電針調節功能性消化不良大鼠胃腸動力障礙及對胃竇組織鐵死亡相關因子的影響

2022-08-22 08:04:22李躍兵王煥梅孫柳青陳佳怡侯培媚

湖南中醫藥大學學報 2022年8期

關鍵詞：模型

李躍兵，王煥梅*，孫柳青，陳佳怡，侯培媚，李箏，佘艷，彭艷

（1.湖南中醫藥大學針灸推拿與康復學院，湖南長沙 410208；2.武漢市第九醫院康復科，湖北武漢 430010）

功能性消化不良（functional dyspepsia, FD）是一組以上腹痛、腹脹、腹瀉、反酸、噯氣等為主要表現的非器質性胃腸病，流行病學調查顯示，FD 發病率為18%～38%，我國發病率為19.8%[1]。 FD 發病機制至今尚不清楚，胃腸動力障礙被認為是FD 發生最主要的生理機制之一[2]。本課題組前期研究表明，電針能夠有效改善FD 大鼠運動功能，降低FD 大鼠腸道敏感性，提高FD 大鼠胃排空率及小腸推進率，能夠良性調節FD 大鼠胃腸動力功能[3]。鐵死亡是一種以鐵依賴性、細胞脂質活性氧族簇（reactive oxygen species, ROS）積累為特征的新型細胞死亡方式。研究發現，鐵死亡與多種胃腸道疾病發生有密切關系[4]。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）是公認的鐵死亡關鍵物質之一，胱氨酸/谷氨酸反向轉運蛋白（cystine/glutamate reverse transporter, system Xc-）負責將還原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）的合成原料半胱氨酸轉運至胞內，GPX4 在GSH 的輔助下，降解脂質過氧化物，避免細胞發生氧化性損傷，從而降低鐵死亡的發生[5]。本研究以FD 大鼠為研究對象，采用電針FD 大鼠足三里為干預手段，通過觀察電針對FD 大鼠胃腸動力調節情況、對鐵死亡相關因子表達的影響以及二者的相關性分析，從鐵死亡途徑探討電針調節FD大鼠胃腸動力功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物來源

SPF 級功能性消化不良大鼠40 只，雌雄各半，體質量200～250 g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供（大鼠訂購編碼：DWDG-202111150005)。飼養溫度為20～25 ℃，濕度為55%～65%，12 h∶12 h明暗光線交替照射。本實驗經湖南中醫藥大學倫理委員會評審批準實施，動物實驗過程及對實驗動物的處理符合國家科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》[5]。

1.2 主要試劑與儀器

多潘立酮片（10 mg×30 s，批號：國藥準字H10910003，西安楊森制藥有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（250 mL，批號：H20033973，湖南比揚醫療科技有限公司）；伊利脫脂純牛奶（批號：66115271050，內蒙古伊利實業集團股份有限公司）；墨汁（250 g，批號：BR-987/975，上海晨光文化用品有限責任公司）；亞鐵比色法測試盒、GSH 比色法測試盒、MDA比色法測試盒（批號：國械注進20162401765、CB75771065、FS-E9710，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；熒光染料PCR 檢測試劑盒、反轉錄試劑盒（批號：KL14-49500、KL14-49600，江蘇科惟生物技術有限公司）；大鼠GPX4 抗體、System Xc-抗體、GAPDH（批號：BM5231、Bs-6883、BM1623，武漢博士德生物科技有限責任公司）。酶標儀、熒光酶標儀、流式細胞儀（型號：A51119500C、A51119600C、A51119700C，湖南比揚醫療科技有限公司）；微量高速離心機、隔水式恒溫培養箱（型號：TG16W、GNP-9080，湖南比揚醫療科技有限公司）；華佗牌無菌針灸針（0.25 mm×25 mm，批號：津械注準20172270152，蘇州醫療用品有限公司）；電子針灸治療儀（型號：HANS100A，蘇州醫療用品有限公司）。

1.3 造模方法

將40 只SD 大鼠分為空白組、模型組、電針組、西藥組，每組10 只。除空白組外，其余30 只大鼠按復合病因造模法造模，具體方法如下：將大鼠隔日禁食，隔日進食，進食時足量喂食，將大鼠置于(0±1) ℃冰水中游泳20 min，之后用（-4±2) ℃冰板刺激大鼠腹部，每日2 次，上午、下午各1 次，連續21 d。在造模過程中，大鼠出現便溏、體質量減輕、運動遲緩、運動量少等癥狀，則視為造模成功[6]。

1.4 干預方法

1.4.1 空白組正常飼養，足量喂食。

1.4.2 模型組造模成功后正常飼養，足量喂食。

1.4.3 電針組（1）足三里穴定位[7]：位于小腿外側，膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm。（2）電針方法[8]：FD 大鼠清醒固定，直刺，深度0.2～0.3 寸，進針后，接電針儀，疏密波（2 Hz，波頻率100 Hz），強度以針柄輕微抖動為度，每次留針20 min。于造模成功后第3天開始針刺，每天1 次，連續治療21 d。

1.4.4 西藥組將多潘立酮片研成細粉末，溶于蒸餾水中，制備濃度為0.27 mg/mL 的多潘立酮溶液，置于冰箱，4 ℃恒溫保存備用，用時充分搖勻，多潘立酮（10 mg/kg）采用灌胃給藥，每日1 次，連續給藥21 d，治療時間與電針組一致[9]。

1.5 觀察指標及檢測方法

于實驗第22 天，各組大鼠禁食24 h 后，解剖取胃竇組織進行檢測。胃竇組織取材方法：剪取一部分取胃竇組織，冰生理鹽水沖洗，然后放入4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h 時，石蠟包埋備用，用于免疫組化檢測。

1.5.1 胃內殘留率的測定[10]治療結束后，各組大鼠禁食24 h 后，給予每只大鼠按1 mL/100 g 灌胃容積灌服營養性半固體糊（羧甲基纖維素鈉5 g，奶粉8 g，糖4 g，淀粉4 g，活性炭3 g，蒸餾水約150 mL），30 min 后處死動物，打開腹腔，分離出胃。沿胃幽門處剪取胃，拭干，稱全重(M1)；再沿胃大彎處剪開胃，用生理鹽水洗凈內容物，用濾紙拭干，稱胃凈重(M2)。計算胃殘留率：胃殘留率=(M1－M2)/灌胃量×100%。

1.5.2 小腸推進率的測定[11]治療結束后，各組大鼠禁食、灌胃方法同前，30 min 后處死動物，打開腹腔，分離出腸。用鑷子輕輕提取上端至幽門、下端至回盲部的腸管，平鋪于試驗臺上，不牽扯，輕輕將小腸拉成直線，用直尺測量小腸全長（L1）以及幽門至炭末所達最前端的長度（L2），計算腸推進率：小腸推進率=（L2/L1）×100%。

1.5.3 胃竇組織Fe2+含量檢測[12]將采集各組FD大鼠胃竇組織離心（4 ℃，3000 r/min，半徑10 cm，離心10 min），取上層清液200 μL 加入酶標板相應孔中，混勻，37 ℃孵育10 min，在酶標儀593 nm 處測定各孔OD 值，依據OD 值測定血清中Fe2+含量。

1.5.4 胃竇組織GSH 含量、MDA 含量測定[13]取離心后的上清液0.1 mL，設置標準孔、測定孔、空白孔，酶標儀波長405 nm 振板1 min，靜置5 min，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，測定各孔吸光度并計算GSH 含量。

1.5.5 胃竇組織ROS 含量檢測[14]將胃竇組織離心（4 ℃，3000 r/min，半徑10 cm，離心10 min），取40 μL 細胞懸液加入試管內，再加50 μL（1∶20，用DPBS 稀釋)滅活正常兔血清，用洗滌液洗滌2 次（4 ℃、30 min），加入適量熒光標記物，充分振搖（4 ℃30 min），加入1 mL 固定液制備標本，用流式細胞儀檢測胃竇組織ROS 含量。

1.5.6 胃竇組織GPX4mRNA、system Xc-mRNA 表達檢測[15]用RT-PCR 法檢測胃竇組織GPX4mRNA表達水平。具體方法如下：收集各組胃竇組織細胞，用Trizol 法提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA 濃度及純度，并將RNA 逆轉錄為cDNA，嚴格按照說明書進行RT-PCR 反應，并計算GPX4mRNA、system Xc-mRNA 相對表達量。

1.5.7 胃竇組織GPX4 蛋白、system Xc-蛋白表達檢測[16]用Western blot 法檢測胃竇組織GPX4 蛋白表達水平。具體方法如下：取適量凍存的胃竇組織，研磨后于冰山裂解，混勻，30 min 后置于離心機上離心（4 ℃，10 000 r/min，半徑15 cm，離心10 min），取適量上清液與PBS 混勻，用BCA 法測定蛋白濃度，嚴格按照說明書進行電泳、轉膜、封閉、稀釋，加入稀釋后的GPX4 抗體、system Xc-抗體，4 ℃孵育過夜、TBST、加入HRP 二抗，恒溫37 ℃下繼續孵育1 h，ECL 化學液化顯影，凝膠成像系統進行分析，計算目標蛋白條帶的相對表達量。

1.6 統計學方法

所有數據均用SPSS 22.0 進行數據處理，各檢測指標統計數據均用“±s”表示。計量資料符合正態分布、方差齊性者，組間比較用單因素方差分析，若存在差異，進一步的組間兩兩比較采用LSD 檢驗，方差不齊則選用Tamhane’s T2 檢驗，Pearson 檢驗描述組間比較的相關性。均以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠胃內殘留率、小腸推進率比較

與空白組相比，模型組大鼠的胃內殘留率明顯升高、小腸推進率明顯降低（P<0.05）；與模型組相比，電針組、西藥組的胃內殘留率下降、小腸推進率升高（P<0.05）；與西藥組相比，電針組的胃內殘留率明顯下降、小腸推進率明顯升高（P<0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠胃內殘留率、小腸推進率比較（±s，%）