養殖長莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）污損微藻群落結構與水體pH 和Eh 變化的相關性

陳加雄，李偉濱，黃乙書，廖小珊，林傳旭

（1.中國科學院南海海洋研究所，廣州 510301；2.汕頭市農產品質量安全監督檢驗檢測中心，廣東 汕頭 515041）

在自然界中，海洋綠藻長莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）主要分布于中國南海、東南亞、日本沖繩、中國臺灣、大洋洲等熱帶和亞熱帶海域［1，2］，因其含有大量的粗多糖和粗纖維、蛋白質和氨基酸、不飽和脂肪酸、礦物質和多種微量元素，其中氨基酸種類齊全且呈味氨基酸占比較高［3-5］，是一種具有較高營養價值的美味食品。此外，長莖葡萄蕨藻因為含有蕨藻倍半萜、多糖等生物活性物質，可以用于治療痛風、肥胖癥、Ⅱ型糖尿病等疾病，其提取純化物硫化多糖（SP1）具有顯著的免疫刺激活性［6-8］，所以長莖葡萄蕨藻還是一種潛在的醫藥保健品原料。近年來由于需求量不斷增大，只有開展人工養殖才能滿足市場需要，中國在養殖技術方面主要是研究溫度、鹽度、光照強度、氮磷營養條件對無機碳的吸收和長莖葡萄蕨藻對硒元素的富集作用以及生物量增加的影響［9-13］。在規模化養殖試驗方面，有工廠化養殖關鍵技術研究、自然海區和室內外水泥池養殖試驗等［14-16］，但由于長莖葡萄蕨藻對生長環境要求比較嚴格，生態因子稍有變化即會影響其正常生長甚至死亡，規模化養殖技術尚未成熟。在長莖葡萄蕨藻養殖過程中，經常出現藻體和附著基發生細菌和雜藻污損的現象，細菌和硅藻附著在藻體上導致其生長緩慢甚至腐爛死亡，絲藻則主要是爭奪營養和附著基影響長莖葡萄蕨藻的生長，這些雜藻抗逆性很強不易清除［15］。傳統方法通過人工清除費時費力，也有用二氧化鍺抑制硅藻的生長、調節光照控制絲藻繁殖和套養小型草食性海洋動物控制絲藻等方法［13，17，18］，張艷楠等［19］則用抗生素對黑褐病致病菌溶藻弧菌等細菌性病害進行防除，以上這些方法繁瑣、效果有限，二氧化鍺有殘毒且成本較高，并且不適用于生產。

水體中的pH 決定著碳酸平衡體系的CO2、HCO3-、CO32-之間的比例相關，藻類繁殖光合作用吸收 CO2使水體 pH 上升，呼吸作用釋放 CO2使 pH 下降，不同藻類對pH 的適應性不同［20］。水體中的各種有機、無機物質的存在和轉化，都與氧化還原反應有關，氧化還原電位影響著水體中的硝化與反硝化作用和磷的釋放，決定著水體的富營養化程度，而水體的營養狀態變化直接影響了微藻的生長和種群結構演變［21-23］。因此，本研究在工廠化養殖長莖葡萄蕨藻水體中裝置pH 計和氧化還原電位測定儀實時監測水體pH 和Eh，觀察微藻群落結構變化并分析其關聯性，通過監測水體的pH 和Eh 預示污損微藻群落結構變化，改良水質抑制污損微藻的繁殖，為長莖葡萄蕨藻的健康養殖提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料長莖葡萄蕨藻購自中國水產科學研究院南海水產研究所深圳試驗基地。取色澤鮮艷、無腐爛、生長旺盛的植株，用消毒海水清洗除去雜質，在解剖鏡下挑選干凈的藻體，暫養于光照培養箱中，備用。培養箱設定溫度為24 ℃，光照度2 000 lx，光照周期為12 h∶12 h。培養液為添加NaNO3和KH2PO4至濃度分別為15 mg/L 和1.5 mg/L 的高壓消毒天然海水，鹽度為32‰。

1.2 試驗設施

1.2.1 養殖水池 養殖水池用玻璃材料粘貼成水族箱形狀，分上下兩部分。上部分為養殖池，規格為200 cm×40 cm×35 cm，在水面上方10～30 cm 處安裝LED 燈，測定水面處的光照度，調整光源距離使水面處的光照度為6 000 lx，保持水深30 cm 恒定不變，在池的尾端離底板30 cm 處開一個溢洪排水口，用水管連接至下池過濾框上；下部分為水處理池，分為過濾池、充氣池和抽水池三部分互相連通，過濾池上方安放塑料框，用濾棉布過濾，充氣池底部安放多個開孔的充氣管，抽水池安裝水泵，把水抽至上部養殖池進水口，下池安裝浮球控制水位，用過濾自來水自動補充蒸發水分，安裝pH 計和氧化還原電位儀實時監測pH 和Eh（圖1）。養殖池安裝于室內，將空調溫度設置為25 ℃。

1.2.2 附著基 夾苗板用塑料水管連接成43 cm×23 cm 的長方形框架，上下2 層封聚乙烯網，上層網孔徑為1.0 cm，下層網孔徑為0.3 cm，苗種夾于2 層網中間，框架下方裝5 cm 高墊腳，使苗種與底部保持間隔空間（圖1）。

圖1 養殖水池、水質監測儀和夾苗板

1.2.3 養殖用水 養殖用水為經過砂濾和過濾棉2級過濾的天然海水，水質指標符合國家標準《漁業水質標準（GB 11607—1989）》和農業行業標準《無公害食品海水養殖用水水質（NY 5052—2001）》的要求，鹽度為 34‰，添加濃度為 15 mg/L 的 NaNO3和1.5 mg/L 的KH2PO4作為氮、磷營養。養殖用水循環使用，蒸發水分用過濾自來水補充。

1.3 方法

1.3.1 掛板試驗 取厚度約2 mm 的PVC 塑料板材，裁剪規格為2 cm×2 cm 的正方形塑料板45 塊，平鋪固定于無種苗的空白夾苗板上面，與其他夾苗板同時投放于養殖池中并置于中間位置。

1.3.2 取樣檢測 養殖開始后至第90 天，每隔10 d小心提取試驗板5 塊，分別于夾苗板的四周和中間位置，同時記錄pH 和Eh。用刮刀刮取表面附著藻類，5 塊樣板樣品合并處理，用去離子水清洗干凈后一并置于容量瓶中，加去離子水至刻度，容量瓶大小視藻類密度選擇，充分震搖使藻類分散均勻。樣品在光學顯微鏡下參照金德祥等［24］、夏邦美［25］和錢樹本等［26］的方法進行種類鑒定，采用0.1 mL 浮游生物計數框在光學顯微鏡下計數，重復3 次，取平均值。優勢度采用公式Y=（ni/N）×fi計算，式中，ni為i物種的個體數，N為群落樣本個體總數，fi為該物種出現的頻率。個體總量占10%以上為優勢種，占1%～10%為常見種，1%以下為稀有種。

1.3.3 相關性分析 經過顯微種類鑒定和計數結果，按照污損微藻分類合并優勢度，采用Microsoft Excel 2007 軟件分析pH 和Eh 與微藻種群優勢度的相關性。

2 結果與分析

2.1 pH 和 Eh 隨時間的變化

2019 年7—10 月，從試驗開始時觀察安裝于養殖水池中的pH 計和氧化還原電位儀，記錄初始pH和氧化還原電位，以后每隔10 d 記錄1 次數據至第90 天為止（表1）。從表1 可以看出，在長莖葡萄蕨藻養殖后的前50 d pH 明顯呈上升趨勢，后40 d 趨于穩定，變化不大。Eh 則在90 d 內一直呈上升趨勢。這可能是前期隨著長莖葡萄蕨藻生物量的增長和其他藻類植物的繁殖，藻類光合作用快速消耗水中的CO2，破壞水體碳酸平衡體系，使pH 上升，后期因為pH 的升高使其接近 pH 補償點而上升不明顯［27］，而光合作用釋放的O2使水中的還原性物質轉化成氧化態，氧化還原電位逐步上升。

表1 pH 和Eh 隨時間的變化

2.2 附著藻類及優勢種群分析

2019 年 7—10 月，從養殖試驗開始至第 90 天，每天觀察長莖葡萄蕨藻生長及藻體污染情況，20 d后肉眼能見到硅藻附著于藻體的假根和匍匐枝，60 d 后開始見到絲狀藍藻生長，后期長滿整個夾苗板（圖2）。

圖2 污損微藻附著

每隔10 d 提取試驗掛板5 塊收集附著藻類，樣品混合后用去離子水稀釋至容量瓶刻度，在顯微鏡下鑒定種類并計數，記錄數據，計算并分析各種類優勢度。經過9 批次鏡檢共檢出硅藻4 屬4 種，分別是線性雙眉藻（Amphora lineata）、舟形藻（Naviculasp.）、雙壁藻（Diploneis aspera）和長菱形藻（Nitzschia longissima）；檢出藍藻4 屬 4 種，分別是水生集胞藻（Synechocystis aquatilis）、絲狀鞘絲藻（Lyngbya confervoides）、龐氏顫藻（Oscillatoria bonnemaisonii）、海生螺旋藻（Spirulina subsalsa）（表2）。

從表2 可以看出，長莖葡萄蕨藻養殖前期污損微藻以硅藻種群（線性雙眉藻、舟形藻、雙壁藻、長菱形藻）為主，后期則以藍藻（水生集胞藻、絲狀鞘絲藻、龐氏顫藻、海生螺旋藻，其中水生集胞藻為單細胞藍藻，其他3 種為絲狀藍藻）為主，除了長菱形藻以外，其他種類均在不同時間成為優勢種群（圖3），前30 d 僅有硅藻附著，后30 d 僅有少量線性雙眉藻和舟形藻，絲狀鞘絲藻、龐氏顫藻、海生螺旋藻3 種絲狀藍藻為絕對優勢種群，水生集胞藻在50～60 d的過渡期間成為優勢種。

圖3 污損微藻優勢種

表2 各采樣時間污損微藻群落主要種類及其優勢度

2.3 pH 和Eh 與種群優勢度的相關性

將8 種污損微藻歸并成硅藻門（Bacillariophyta）和藍藻門（Cyanophyta），合并其優勢度（表3），采用Microsoft Excel 2007 軟件分析 pH 和Eh 與微藻種群優勢度的相關性。結果表明，pH 與藍藻和硅藻優勢度的相關系數（r）分別為 0.769 和-0.769，Eh 與藍藻和硅藻優勢度的相關系數分別為0.876 和-0.876。

表3 pH 和Eh 及藍藻門、硅藻門優勢度

分析結果表明，pH 和Eh 與污損藍藻門種群優勢度呈正相關，與硅藻門呈負相關。水體酸堿度和氧化還原電位較低時適合于硅藻類的生長繁殖，較高時則適合藍藻類生長，pH 和Eh 與污損微藻種群結構具有顯著相關性。

3 討論

當長莖葡萄蕨藻夾苗板和試驗掛板浸入海水后，蛋白質和多糖等大分子物質及一些無機化合物通過范德華力、氫鍵和靜電等相互作用沉集在其表面構成基膜；然后細菌、真菌和硅藻等微小生物聚集在基膜上，通過胞外大分子物質與基膜黏結形成生物膜，藻類具有較大的生物量，是生物膜中重要的組成部分［28］；之后隨著其他生物的附著種類和個體數不斷增多，群落演替使密度大、生長迅速的物種成為污損生物的優勢種，經過優勝劣汰優勢種充分生長，群落結構穩定［29］。本試驗長莖葡萄蕨藻工廠化養殖的水體與外界隔離，污損生物種類簡單，群落變化僅在硅藻和藍藻之間演變，最終以絲狀藍藻為優勢物種，進而形成穩定的群落結構。

試驗早期，水體在弱堿性和還原狀態下，內源性磷不斷輸入水中，磷酸鹽PO43-濃度和亞鐵離子Fe2+濃度升高［23］，在氮素營養占比相對較高的情況下，硅藻快速生長，生物量不斷增多，其光合作用大量吸收水體中的CO2和有機酸使pH 上升，釋放O2使氧化還原電位上升，至試驗中后期，pH 接近9.0，水體轉變成氧化態，氮磷營養比發生變化，水體污染程度較大，污損微藻優勢種由硅藻類轉變成藍藻類［30，31］。

4 小結

種群結構變化結果與pH 和Eh 變化分析表明，pH 和Eh 與污損藍藻門種群優勢度呈正相關，與硅藻門呈負相關，水體酸堿度和氧化還原電位較低時適合于硅藻類的生長繁殖，較高時則適合藍藻類生長，pH 和Eh 與污損微藻種群結構具有顯著相關性。因此，在長莖葡萄蕨藻養殖過程中，通過監測pH 和Eh 分析預測污損微藻群落結構變化情況，調節水質防控污損微藻，有利于長莖葡萄蕨藻的健康養殖。