響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取靈芝黃酮工藝研究

陳 芳，溫 艷，姜小帆

（1.陜西省食品藥品檢驗研究院，西安 710000；2.陜西省人民醫(yī)院，西安 710068）

靈芝（Ganoderma lucidum）為多孔菌科真菌靈芝的子實體［1，2］，又名赤芝、紅芝、丹芝、瑞草，外形呈傘狀，菌蓋腎形、半圓形或近圓形［3-5］。在中國普遍分布，歐洲、美洲、非洲、亞洲東部也有不同量產(chǎn)［6-8］。其富含氨基酸、多肽、麥角甾醇、三萜類、黃酮等功能活性成分，從而具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、抗氧化、延緩衰老等臨床藥效作用［9-13］。研究發(fā)現(xiàn)黃酮化合物是指以2-苯基苯并吡喃酮為母核的一大類天然化合物及其衍生物［14-16］。超聲波輔助提取法主要是利用其空化作用破壞植物細胞使提取物溶入提取液中，進而提高了提取效率，是一種操作簡單、便捷、能耗低的生物活性物質(zhì)提取新方法［17，18］。目前，對植物體內(nèi)黃酮類化合物提取研究報道較多［19-21］。然而，利用響應(yīng)面法來優(yōu)化超聲輔助提取技術(shù)有效地提高靈芝中黃酮提取率的研究還鮮見報道。本試驗采用超聲輔助法提取靈芝中的黃酮，以提取溶劑乙醇濃度、料液比、浸提功率及浸提時間為考察因素，通過Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化其最優(yōu)工藝提取條件。篩選出最優(yōu)提取方法，提高靈芝的綜合利用率，降低靈芝黃酮的提取成本，為工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝：市售，產(chǎn)地長白山，將靈芝切成碎片后用研磨儀粉碎后備用。

水為GB/T 6682—2008 規(guī)定的一級水，由陜西省食品藥品檢驗研究院制備；硝酸鋁、乙酸鉀、氫氧化鈉等（均為分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純），濟南潤泰化工股份有限公司；蘆丁標準品（純度≥98.0%，生產(chǎn)批號：C100001），北京輝光科技發(fā)展股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CLN-24L 型低溫組織研磨儀、UV-2601 型可見分光光度計，北京紅凱瑞利分析儀器有限公司；80目標準試驗篩，上海過望化工有限公司；SCQ-1800F型超聲波提取儀，上海鴻運儀器股份有限公司；H2500R-2 型高速冷凍離心機，廣東祥高實驗室儀器有限公司；WB-502S 型超級電熱恒溫水浴鍋，廣東環(huán)凱生物科技有限公司；OE-45 型電熱鼓風干燥箱，天津瑞捷科技有限公司；Research plus 單道移液器，Eppendorf中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 靈芝黃酮的提取 稱取靈芝粉末2.0 g（精確至0.001 g）置于150 mL 具塞三角瓶中，用75%～95%的乙醇作為提取溶劑，按料液比1∶（5～25）g/mL 加入提取溶劑，在超聲功率為120～200 W 的條件下提取10～50 min，儀器工作頻率為40 kHz，提取液以4 500 r/min 離心10 min，取其上清液，按照相同條件繼續(xù)提取1 次，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸餾儀濃縮至1 mL，過C18SPE 小柱進行脫色處理，用無水乙醇定容至50 mL，得到靈芝黃酮的提取液，待測。

1.3.2 蘆丁工作曲線的制作 準確稱取蘆丁標準品50 mg（精確至 0.001 mg）于 50 mL 容量瓶中，加入20 mL 無水乙醇超聲溶解后并用無水乙醇定容至刻度，即得1.0 mg/mL 貯備液，放于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

精密吸取蘆丁貯備液 1、2、3、4、5 mL 分別置于50 mL 容量瓶中，加無水乙醇至總體積為15 mL，依次加入質(zhì)量濃度為100 g/L 的硝酸鋁溶液、98 g/L 的乙酸鉀溶液各1 mL；搖勻后加水至刻度，再次搖勻；靜置60 min，用1 cm 比色皿于420 nm 處測定吸光度，以30%乙醇溶液為空白；以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得y=1.457 8x+0.065 78，R2=0.999 8。

1.3.3 靈芝黃酮的測定 精密吸取待測樣品溶液1.0 mL，置于50 mL 容量瓶中，按照“1.3.2”進行顯色反應(yīng)后測定，其計算公式為：

式中，X為黃酮類化合物的總含量（%）；m為經(jīng)標準曲線計算求出樣品比色液中的蘆丁質(zhì)量（mg）；W為樣品的質(zhì)量（g）；d為稀釋比例。

1.3.4 單因素試驗 按照“1.3.1”的方法提取靈芝黃酮，提取條件為固定料液比1∶20（g/mL）、提取功率180 W、提取時間30 min，考察不同乙醇濃度（75%、80%、85%、90%、95%）對靈芝黃酮得率的影響；固定提取溶劑為90%乙醇、提取功率180 W、提取時間30 min，考察不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL）對靈芝黃酮得率的影響；固定提取溶劑為90%乙醇、料液比1∶20（g/mL）、提取時間30 min，考察不同提取功率（120、140、160、180、200 W）對靈芝黃酮得率的影響；固定提取溶劑為90%乙醇、料液比1∶20（g/mL）、提取功率180 W，考察不同提取時間（10、20、30、40、50 min）對靈芝黃酮得率的影響。

1.3.5 靈芝黃酮超聲波提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化 選取浸提溶劑乙醇濃度（A）、料液比（B）、浸提功率（C）、浸提時間（D）為自變量，以靈芝黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken 試驗原理做4 因素3 水平曲面設(shè)計，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件進行數(shù)據(jù)分析及模型建立，對超聲波輔助提取靈芝黃酮的工藝條件進行優(yōu)化，試驗設(shè)計因素水平及編碼見表1。

表1 試驗設(shè)計因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對靈芝黃酮得率的影響 由圖1 可知，當乙醇濃度為75%～90%時，隨著乙醇濃度的增加靈芝黃酮的提取得率逐漸增大；當乙醇濃度為90%時，靈芝黃酮的提取得率達到最大值；當乙醇濃度大于90%時，靈芝黃酮的提取得率隨著提取溶劑濃度的增加反而逐漸降低。其原因可能是乙醇濃度為90%時，靈芝黃酮的溶出趨于飽和，隨著乙醇濃度的增加，其他醇溶性色素、親脂溶性物質(zhì)溶出增多，這類物質(zhì)與黃酮類化合物競爭同乙醇-水分子結(jié)合，從而使得靈芝黃酮得率降低。因此選擇乙醇濃度為85%、90%、95%進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖1 提取溶劑濃度對靈芝黃酮得率的影響

2.1.2 料液比對靈芝黃酮得率的影響 由圖2 可知，當料液比為 1∶（5～20）g/mL 時，隨著提取溶劑的增加靈芝黃酮的提取率急劇增加，其原因可能是隨著提取溶劑的增加，增大了靈芝樣品與提取溶劑的接觸面積，有利于靈芝黃酮的溶出，故黃酮提取得率急劇增加；隨著提取溶劑的繼續(xù)增加靈芝黃酮的提取率趨于平緩增長，其原因可能是靈芝黃酮的溶出逐漸趨于平穩(wěn)，且大部分已溶入提取溶劑中，繼續(xù)增加提取溶劑會造成其他雜質(zhì)的溶出，而且還會造成提取成本的上升。因此選擇料液比1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖2 料液比對靈芝黃酮得率的影響

2.1.3 提取功率對靈芝黃酮得率的影響 由圖3 可知，當超聲波提取功率小于180 W 時，隨著提取功率增大靈芝黃酮的提取得率逐漸增大；當提取功率為180 W 時，靈芝黃酮提取得率達到最大值；當提取功率大于180 W 時，靈芝黃酮的提取得率逐漸下降，其原因可能是超聲功率達到一定強度可以產(chǎn)生更好的空化效果，但功率過大可能會破壞黃酮的結(jié)構(gòu)。因此提取功率選擇160、180、200 W 進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖3 提取功率對靈芝黃酮得率的影響

2.1.4 提取時間對靈芝黃酮得率的影響 由圖4 可知，當提取時間為10～30 min 時，靈芝黃酮的提取得率隨著提取時間的延長而上升；并在提取時間為30 min 時靈芝黃酮提取得率達到最大值；當提取時間超過30 min 時，繼續(xù)增加提取時間，靈芝黃酮的提取得率隨著提取時間增加而降低。其原因可能是提取時間為30 min 時，靈芝黃酮已基本完全溶出，繼續(xù)增加提取時間反而會使其他物質(zhì)溶出。同時，樣品處于長時間的超聲中，會導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)被分解，造成黃酮提取得率降低。因此選擇提取時間為20、30、40 min 進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖4 提取時間對靈芝黃酮得率的影響

2.2 響應(yīng)面法分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken試驗原理［22-24］，以提取溶劑乙醇濃度（A）、料液比（B）、浸提功率（C）和浸提時間（D）4 個因素為自變量，以靈芝黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6 軟件進行4 因素3 水平的響應(yīng)面分析，試驗方案及結(jié)果見表2。對表2 中數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到四元二次回歸方程：Y=68.78+0.25A+0.39B-0.65C-0.21D+0.55AB-0.75AC-0.49AD-0.64BC-0.65BD+0.45CD-0.35A2+1.35B2-0.16C2-1.57D2。

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計及響應(yīng)值

2.2.2 方差分析 由表3 方差分析可知，P模型＜0.000 1，表明回歸模型具有高度顯著性；P失擬值=0.915＞0.05，失擬值不顯著說明模型構(gòu)建成功，表明試驗以外的其他因素對本試驗黃酮提取得率影響較小；通過判定系數(shù)（R2=0.985）可評價回歸模型的擬合程度，其值越接近1，表明回歸方程的擬合度越好［25］。根據(jù)F的大小可知4 個試驗因素對黃酮得率影響的主次順序依次為提取溶劑乙醇濃度（A）＞浸提功率（C）＞浸提時間（D）＞料液比（B）。其中一次項A、C對黃酮得率的影響極顯著；一次項D和交互項AB、AC對黃酮得率的影響顯著，其余項對指標影響不顯著。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 由圖5 可知，乙醇濃度與提取功率對黃酮的得率影響較大，提取時間、料液比次之，表3 的分析結(jié)果也與之吻合；乙醇濃度和料液比、乙醇濃度和提取功率兩者交互作用顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面走勢陡峭。

圖5 各因素交互作用對靈芝黃酮得率的影響

表3 回歸模型的方差分析

2.2.4 最佳提取工藝條件的預(yù)測與驗證 應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件求解二次回歸方程可得靈芝黃酮提取最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇濃度86.68%、料液比1∶19.56（g/mL）、提取功率186.82 W、提取時間30.35 min，預(yù)測靈芝黃酮的提取得率為7.62%。考慮到黃酮實際提取工作中操作的可行性將工藝參數(shù)修正為乙醇濃度86%、料液比1∶20（g/mL）、提取功率185 W、提取時間30 min。在此條件下對所建方法進行驗證試驗，靈芝黃酮的實際提取得率為7.55%，其與預(yù)測值7.62%誤差小于3%，因此證實了應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件得到的黃酮提取工藝參數(shù)真實可靠，具有實際應(yīng)用價值。

3 小結(jié)與討論

靈芝作為一味珍貴的中藥材，具有廣泛的藥理作用。靈芝中富含氨基酸、真菌溶菌酶、麥角甾醇、三萜類化合物、黃酮等功能活性成分。氨基酸是含有堿性氨基和酸性羧基的有機化合物，陳體強等［26］曾研究報道野生靈芝與栽培靈芝中人體必需氨基酸組分與其含量，研究表明野生靈芝的必需氨基酸組成比例相對栽培靈芝更接近人體的必需氨基酸組成比例，又進一步從紫芝子實體中檢出18 種氨基酸，總量為6.07%～6.38%。靈芝多糖的潛在價值巨大，國內(nèi)外學(xué)者利用核磁共振成像技術(shù)、高效液相色譜技術(shù)、高效陰離子交換色譜與脈沖安培檢測器聯(lián)用等新型現(xiàn)代技術(shù)對靈芝多糖進行研究，分析發(fā)現(xiàn)靈芝多糖具有抗氧化性、消炎、抑制腫瘤細胞活性和免疫調(diào)節(jié)等藥理活性［27，28］。靈芝三萜化合物種類多、化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要是由異戊二烯單位構(gòu)成的羊毛甾烷型，從靈芝中分離三萜類化合物目前有300 多種，按照碳原子數(shù)目可分為C24、C27和C30三大類；按照官能團與側(cè)鏈的不同，可分為靈芝醛類、靈芝醇類、靈芝酸類和靈芝內(nèi)酯類等；靈芝三萜化合物在臨床上具有抗病毒、降血脂、保肝護肝和抗腫瘤等多種藥理功效［29，30］。黃酮化合物是指以 2-苯基苯并吡喃酮為母核的一大類天然化合物及其衍生物。研究表明，黃酮類化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒、防止人體動脈硬化、延緩衰老等功效［31，32］。靈芝各種功能活性成分已被廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域，對靈芝中各種功能活性成分進行提取可開發(fā)成多種類型的功能食品及其他高附加值產(chǎn)品，有助于實現(xiàn)靈芝資源的高值化利用。

本試驗采用靈芝為原料，用超聲輔助法提取其黃酮，并應(yīng)用響應(yīng)面分析法對提取溶劑乙醇濃度、料液比、提取功率、提取時間等因素進行優(yōu)化，得到的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇濃度86%、料液比1∶20（g/mL）、提取功率185 W、提取時間30 min。在此條件下對所建方法進行驗證試驗，靈芝黃酮的實際提取得率為7.55%，其與預(yù)測值7.62%誤差小于3%，因此證實了應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件得到的黃酮提取工藝參數(shù)真實可靠，具有實際應(yīng)用價值。