人白細胞抗原-G對呼吸道合胞病毒感染的支氣管上皮細胞炎癥損傷的影響

鄒 慶， 楊 帆， 王智惠， 楊 曦， 陳 昕， 王成秀， 余春梅

兒童喘息性疾病是兒童最常見的呼吸道疾病，其中哮喘的患病率呈顯著上升趨勢[1]，并不易根治[2]。研究哮喘發病機制的分子途徑，對于開發新的哮喘治療手段具有重要意義。哮喘本質為氣道的慢性炎癥、氣流受限和氣道高反應性；以肥大細胞的激活、嗜酸粒細胞與活化T淋巴細胞浸潤，許多炎性介質產生為特點[3-4]。有研究顯示，遺傳基因在哮喘的病理生理過程中起關鍵作用，人類白細胞抗原-G（HLA-G）可能是其中一員[5]。HLA-G是HLA-Ib類分子，與T細胞、B細胞和自然殺傷細胞等淋巴細胞上的受體相互作用，影響免疫應答[6]。與經典的HLA分子不同，HLA-G的表達并不存在于所有的體細胞，而是局限于部分組織如人支氣管上皮細胞[7]。研究顯示，HLA-G組織特異性表達與許多涉及免疫系統監測和炎癥性疾病（如哮喘）有關[8]。然而，HLA-G在哮喘患兒中的表達及潛在機制尚不清楚。本研究旨在探究HLA-G對呼吸道合胞病毒（RSV）感染人支氣管上皮細胞株16HBE的細胞炎癥損傷的影響，以期為哮喘的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑

人支氣管上皮細胞株16HBE（中國科學院上海細胞資源中心），RSV（上海邦奕生物科技有限公司），HLA-G 小干擾RNA（siRNA）（廣州銳博生物），RPMI 1640培養液（美國Invitrogen公司），RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒（北京天根生化科技），AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（日本TaKaRa公司），白細胞介素（IL）-4、IL-10和γ干擾素（IFN-γ）ELISA檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司），蛋白提取試劑盒（南京凱基生物公司），HLA-G、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cleaved caspase）-3和cleaved caspase-9單抗及辣根過氧化物酶標記的二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司），BCA蛋白檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所），實時熒光定量PCR （qRT-PCR）檢測試劑盒和ECL化學發光試劑（賽默飛世爾科技），引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 細胞培養和分組處理

人支氣管上皮細胞株16HBE復蘇后加入RPMI 1640培養液（含10%胎牛血清）重懸細胞，接入到細胞培養瓶中，放置在5% CO237℃培養箱培養，使用顯微鏡觀察細胞生長狀態，待細胞融合度至80%左右時，除去舊培養液，加入0.25%胰蛋白酶消化細胞，以1∶3的比例傳代培養。

對數生長期的16HBE細胞以胰酶消化，收集并計數，以1×105個/孔接種到96孔板中，于37℃培養箱繼續培養24 h，待細胞生長匯合度達50%左右時，按照Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑制造商使用說明將HLA-G siRNA轉染16HBE細胞。16HBE細胞隨機分為4組：對照組、感染組、轉染組和感染+轉染組，每次實驗做3個孔，重復實驗3遍，其中感染組、轉染組和感染+轉染組16HBE細胞采用RSV進行感染，轉染組和感染+轉染組16HBE細胞轉染HLA-G siRNA。RSV感染方法按參考文獻[9]進行操作。

1.3qRT-PCR檢測細胞中HLA-G的表達

各組16HBE細胞相應處理24 h后，收集各組16HBE細胞，使用RNA提取試劑盒提取細胞中總RNA，并測定純度和濃度，選取合格的RNA進行反轉錄，以合成的cDNA作為模板，以GAPDH為內參，使用qRT-PCR檢測HLA-G mRNA相對表達量，具體操作參照試劑盒使用說明書進行。

所用引物：HLA-G 上游引物5’-GGAAGAGGAGACACGGAACA-3’；下游引物 5’-TGAGACAGAGACGGAGACAT-3’。GAPDH 上 游 引 物5’-CCTGCCTCTACTG-GCGCTGC-3’；下游引物5’-GCAGTGGGGACACGGAAG-GC-3’。

1.4Western blot檢測細胞中HLA-G、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達

各組16HBE細胞相應處理24 h后，收集各組16HBE細胞，加入裂解液200 μL，于冰上裂解，離心收集上清液蛋白樣品，采用BCA法檢測蛋白濃度。將上樣緩沖液（loading buffer）與蛋白樣品充分混勻，沸水浴5 min致蛋白變性，取30 μg變性蛋白樣品行SDS-PAG凝膠電泳，電泳結束后轉膜到PVDF膜上，洗膜后封閉1.5 h。分別加入1∶800稀釋的HLA-G、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9一抗，4℃過夜孵育，隨后加入1∶2000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，滴加ECL顯色液，顯影、定影，采用成像系統采集圖像，以GAPDH為內參，計算三者的表達水平。

1.5 噻唑藍（MTT）檢測細胞活力

各組16HBE細胞相應處理后，以1×104個/孔接種到96孔板中，分別于12、24、48 h測定各組細胞活力，即在各個時間點棄上清液，向每孔細胞中加入10 μL MTT溶液，避光孵育4 h，棄上清液，再添加100 μL DMSO，搖床振蕩至結晶物溶解，采用酶標儀測定490 nm處細胞的吸光度（D）值。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

各組16HBE細胞相應處理24 h后，采用胰酶消化，收集細胞并調整細胞至1×106個/mL，取細胞懸液1 mL，采用1 000 r/min離心10 min，除去上清液，以預冷的PBS洗滌細胞，隨后加入結合緩沖液100 μL重懸細胞，向細胞懸液中加入PI和AnnexinⅤ-FITC染色液各5 μL，混勻后避光孵育20 min，1 h內上流式細胞儀檢測各組16HBE細胞凋亡情況。

1.7ELISA檢測細胞上清液中IL-4、IL-10和IFN-γ的含量

各組16HBE細胞相應處理24 h后，分別收集上清液，使用IL-4、IL-10和IFN-γ ELISA檢測試劑盒分別測定細胞上清液中三者的含量，具體操作嚴格按照ELISA試劑盒使用說明，使用酶聯免疫檢測儀測定450 nm波長處每孔D值。

1.8 統計學分析

采用SPSS 21.0版軟件對以上實驗數據進行統計分析，計量資料以表示，兩組間差異比較采用t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩組間差異比較采用SNK-q檢驗分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組16HBE細胞中HLA-G的表達

qRT-PCR和Western blot檢測4組16HBE細胞中HLA-G的表達，結果顯示：與對照組相比，感染組和轉染組16HBE細胞中HLA-G的表達明顯升高（P＜0.05），與感染組和轉染組相比，感染+轉染組16HBE細胞中HLA-G的表達明顯降低（P＜0.05），見圖 1。

2.2 各組16HBE細胞的增殖活力

MTT檢測各組16HBE細胞增殖活力，結果顯示：與對照組相比，感染組和轉染組16HBE細胞活力明顯降低（P＜0.05），與感染組和轉染組相比，感染+轉染組16HBE細胞活力均明顯升高（P＜0.05），見圖 2。

2.3 各組16HBE細胞的凋亡情況

流式細胞術和Western blot檢測各組16HBE細胞凋亡率及cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達，結果顯示：與對照組相比，感染組和轉染16HBE細胞凋亡率、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達均明顯升高（P＜0.05），與感染組和轉染組相比，感染+轉染組三者的表達均明顯降低（P＜0.05），見圖3。

2.4 各組16HBE細胞的炎性細胞因子的分泌

ELISA檢測各組16HBE細胞上清液中炎性細胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ的含量，結果顯示：與對照組相比，感染組和轉染中3種因子的含量明顯升高（P＜0.05），與感染組和轉染組相比，感染+轉染組中3種因子的含量明顯降低 （P＜0.05），見圖4。

3 討論

HLA-G是一類免疫耐受分子，具有選擇性組織分布的特點，除了高表達于母胎界面絨毛外滋養細胞，在一些腫瘤細胞、病毒感染細胞、器官移植后的移植物細胞上的表達也明顯增高[10]。HLA-G分子參與免疫調節作用是一個復雜的過程，在很多方面都有作用，如器官移植、腫瘤、病毒感染、慢性炎癥性疾病和妊娠等[11]。HLA-G在調節免疫中同時刺激Th2細胞反應和Treg細胞活化。許多臨床研究集中于HLA-G單核苷酸多態性、HLA-G單倍型作為預測哮喘的生物標志物，表明HLA-G可能在哮喘發病和進展中發揮一定的作用，繼而在哮喘診治中具有潛在價值[12-13]。哮喘最主要的特征是上皮異常和炎性細胞激活[14]。IFN-γ和IL等因子在其發病過程中起著重要作用[15-16]。小兒哮喘的發病機制非常復雜，一項研究表明，炎性系統的過度反應在哮喘發生和發展中起著重要作用[17]。本研究采用RSV感染16HBE細胞體外模擬哮喘環境，通過脂質體轉染敲低HLA-G的表達，結果顯示，RSV感染的16HBE細胞炎性細胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ的分泌增加，而敲低HLA-G可減少RSV感染的16HBE細胞IL-4、IL-10和IFN-γ的分泌，這些實驗結果提示敲低HLA-G能夠降低RSV感染的16HBE細胞炎性損傷。此外，RSV感染的16HBE細胞活力明顯降低，而敲低HLA-G的表達能夠拮抗RSV對16HBE細胞活力抑制作用。線粒體途徑是細胞凋亡的重要內源性途徑。線粒體通透性導致凋亡小體的形成，凋亡小體促進半胱氨酸蛋白酶的激活，并隨后觸發凋亡細胞死亡的其他蛋白質[18]。Bax的激活導致許多線粒體蛋白質的釋放，如細胞色素c （Cyt-c），通過Bax從胞漿到線粒體的易位，克服Bcl-2對線粒體膜蛋白通透性的調節，然后通過Cyt-c的結合形成凋亡復合體。然后凋亡體復合物二聚體激活caspase-9并進一步激活caspase-3，后者降解以誘導凋亡[19]。以往研究顯示，G蛋白-偶聯雌激素受體（GPER）/miR-148a/HLA-G信號通路抑制細胞凋亡與降低Bax/Bcl-2比率和caspase3/9活性有關，進而介導卵巢子宮內膜異位癥的發生發展[20]。本研究結果顯示，敲低HLA-G能夠降低RSV感染的16HBE細胞凋亡，以及cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達水平。表明敲低HLA-G能夠通過線粒體凋亡途徑減少RSV誘導的16HBE細胞凋亡。

綜上，敲除HLA-G能夠減少RSV感染的人支氣管上皮細胞凋亡，減輕炎癥反應。本研究為哮喘的發病機制及HLA-G用于哮喘的診治提供了一定的實驗依據。