石油污染土壤富集前后細菌群落組成和共現網絡分析

余天飛,柳曉東,艾加敏,王佳敏,郭一丹,劉鑫慧,姜影影,鄧振山

石油污染土壤富集前后細菌群落組成和共現網絡分析

余天飛,柳曉東,艾加敏,王佳敏,郭一丹,劉鑫慧,姜影影,鄧振山*

(延安大學生命科學學院,陜西 延安 716000)

為了探究石油污染土壤中細菌群落在富集過程中的演替規律,試驗采用平板劃線法、菌落PCR和高通量測序技術,分析了富集前后細菌群落結構、共現網絡和核心菌屬組成,并對富集后體系中的微生物進行分離鑒定,篩選石油降解菌.研究表明富集體系中可培養微生物隸屬于34個屬53個種,其中3個為潛在新種微生物,OS33和OS62-1具有降解石油的能力.高通量測序結果顯示,在門分類水平上,富集前后豐度較高的菌門均為Proteobacteria和Actinobacteria,富集后兩菌門的豐度可達到97.98%,占據絕對優勢;豐度較高菌屬由和轉變為Unspecified和,標志微生物轉變為與石油降解有關的.細菌群落共現網絡在富集后,網絡結構進一步簡化且更加穩定,核心微生物轉變為與石油降解有關的、、、、,且非石油降解菌P35可協同石油降解菌OS33降解石油.

石油污染；富集培養；共現網絡；迪茨氏菌；土壤；高通量測序；群落結構

石油工業目前正面臨石油污染物修復和提高石油采收效率兩個主要問題.由于石油所含成分復雜,處理難度較大,因此石油已被列入優先控制的污染物[1].陸地和水生生態系統中的石油污染,主要應用微生物修復技術進行處理,其中微生物的降解作用,被認為在石油污染物消散過程中發揮重要作用[2].細菌是石油污染物降解最主要、最活躍的類群[3],因此,獲得高效率石油降解菌,是應用生物處理石油污染的基礎.

在自然環境土壤中,具有降解碳氫化合物能力的微生物僅占微生物群落的0.01%,而在石油污染環境中這一數值可以增加到1%～10%[4].雖然石油污染環境中的石油降解微生物豐度有所增加,但是直接通過石油污染土壤進行石油降解菌的篩選仍然較為低效.富集培養在功能微生物篩選過程中發揮著重要作用,通過富集培養,已經篩選到諸多石油降解微生物,如、、、、、、、、、和[5].研究環境中微生物群落組成的傳統方法主要為:平板劃線分離法、變性梯度凝膠電泳法(DGGE)和基因芯片等,但是這些方法難以精確顯示微生物的群落組成,而高通量測序技術則能夠高分辨率揭示微生物群落多樣性和優勢群體[6].Huang等[7]基于高通量測序技術,對比分析土壤在發生石油污染前后細菌群落組成時發現,石油污染后Proteobacteria和Actinobacteria微生物豐度顯著升高,其中豐度較高的屬為:、、、和,核心菌屬轉變為與石油降解相關的、、、和,與多環芳烴代謝相關的基因豐度也有所增加.

單一微生物在土壤環境中往往由于各種因素限制,難以高效降解石油,因此構建石油降解菌群逐漸被大家所關注.Chen等[8]利用sp. YC-X 2、sp. YC-X 7、sp. YC-X 4三株石油降解菌構建了一個菌群,7d內實現了49.22%的降解效率.Zhang等[9]將和(真菌)按照1:1的比例進行復配,在pH值為9.0的條件下,7d石油降解效率可達80%,均高于單一菌株的降解效率.目前,所構建的菌群也都集中在石油降解菌之間的簡單復配.然而石油污染環境中的微生物類群絕大多數為非石油降解菌,有研究表明,這些非石油降解菌可產生表面活性劑,增加石油的溶解度,從而提高石油降解菌降解效率[10];Hu等[11]研究發現非石油降解菌產生的次生代謝產物也可以提高石油降解菌相關酶的活性,從而提高降解效率.然而在構建石油降解菌群時,對石油降解菌和輔助菌的選擇上缺少相關理論指導,導致所構建菌群作用效果不穩定.

富集培養作為分離石油降解菌的中心環節之一,在高濃度石油和營養物質的刺激下,微生物群落會進行相應演替,可最大程度模擬自然環境下對石油降解菌株的選擇,并且可為構建菌群提供理論指導.基于此,本研究以石油為唯一碳源,對石油污染土壤中的微生物進行富集培養,采用平板劃線法和菌落PCR法,研究了富集后體系中可培養微生物群落組成,并從中篩選出石油降解菌.采用16S擴增子高通量測序技術,揭示了富集前后細菌群落的多樣性,構建了細菌群落共現網絡,分析了富集前后核心菌屬組成.以高通量測序結果為指導,測試了菌株石油降解效率.并使用GC-MS對單獨培養和共同培養后殘余原油組分進行分析.本研究將為構建石油降解菌群提供菌種資源,為微生物修復石油污染提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2020年7月在陜西省榆林市靖邊縣延長石油公司油井采集原油和石油污染土壤(108°34′58″E,37°4'28''N,半干旱大陸性季風氣候),油樣中烷烴含量59.04%(/),芳香烴含量13.81%(/),瀝青質含量20.93%(/),蠟質含量2.54%(/).石油污染土壤取自距離井口2m,深度為20～30cm處的土壤,石油含量為1328.78mg/kg,樣品在4℃下使用無菌采樣袋運回實驗室,-80℃保存.

1.2 菌株的分離、鑒定

1.2.1 富集和分離 將石油污染土壤按1%(/)比例添加到ERM培養基中,在28℃,180r/min條件下培養15d后,將富集培養液分成兩部分,一部分用于高通量測序,一部分用于分析可培養微生物群落組成.分析可培養微生物群落組成主要步驟為:①取一定量富集培養液進行梯度稀釋,然后將30μL稀釋液分別涂布在蛋白胨酵母粉葡萄糖培養基(Peptone Yeast Glucose broth,PYG)、R2A培養基(R2A Agar Medium,R2A)、完全培養基(Complete Medium,CM)3種培養基上,28℃,培養3d.每個梯度設置3個重復;②為避免挑取大量相同種微生物,選擇培養基中菌落分布較為均勻的平板,根據菌落形態、顏色、生長時間等差異,挑取培養基上不同的單菌落,轉接到相應的培養基中培養.

用于富集培養的ERM培養基配方為(g/L):原油10.0,(NH4)4SO41.0,NaNO32.0,KH2PO45.0,MgSO4·7H2O 0.3,NaCl 5.0,pH值7.5,121℃滅菌15min.

用于分離純化的PYG、R2A和CM培養基的配方分別為:PYG培養基(g/L):蛋白胨 5.0,酵母粉 0.2,葡萄糖 5.0,牛肉膏 3.0,NaCl 0.5,MgSO4·7H2O 1.5,pH值7.5,121℃滅菌15min.

R2A培養基(g/L):酵母粉 0.5,酸水解酪蛋白胨 0.5,月示蛋白胨0.5,葡萄糖0.5,淀粉0.5,K2HPO4·3H2O 0.3,MgSO4·7H2O 0.024,丙酮酸鈉0.3,pH值 7.5,121℃滅菌15min.

CM培養基(g/L):NaCl 80.0,酪氨酸 7.5,蛋白胨 5.0,酵母粉 1.0,檸檬酸鈉 3.0,MgSO4·7H2O 20.0,KH2PO40.5,pH值7.5,121℃滅菌15min.

1.2.2 菌株16S rRNA基因擴增及測序 采用菌落PCR法對所分離的菌株進行鑒定,首先使用無菌牙簽挑取已純化菌株的單菌落,加入裝有5.0μL溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH,1%SDS)的PCR管中,95℃裂解5min,待裂解完成后,加入95μL的ddH2O,顛倒混勻,以此作為擴增16S rRNA基因模板,PCR引物為27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'),擴增體系為2×Taq Master Mix(Dye plus) 25.0μL,27F和1492R各2.0μL,模板DNA 2μL,ddH2O 19μL,反應條件為:預變性94℃,5min;變性94℃,30S;退火54℃,30S;延伸72℃,30S,終延伸72℃,3min;循環數:30.擴增結果用1.0%瓊脂糖凝膠,90V水平電泳30min檢查擴增結果,PCR產物送至擎科生物科技公司(西安)進行測序,測序結果在Ezbiocloud數據庫(https://www. ezbiocloud.net/identify)進行16S rRNA序列比對,使用MEGA-X軟件中N-J法構建菌株系統發育進化樹[12].

1.2.3 石油降解菌的篩選 2,6-二氯靛酚(DCPIP)是一種人工合成電子受體,氧化態為藍色,還原態為無色.微生物在生長過程中產生還原性物質,能夠將氧化態DCPIP還原為還原態的DCPIP,從而使培養基從藍色變為無色,因此可用來評估菌株在以石油為唯一碳源的培養基中生長情況[13].具體而言,將所分離的菌株接種到PYG培養基中,28℃,180r/min,過夜培養,然后在4℃,12000r/min條件下,離心15min,收集菌體,用ERM(無石油)培養基調節菌體密度至OD600=1.0.最后在48孔板中加入ERM培養基(無石油)800μL、DCPIP溶液(37.5μg/mL)100μL、菌體懸液80μL、滅菌石油5μL,28℃,180r/min,培養7d后,觀察培養基顏色,無色表示菌株具有石油降解能力,藍色表示菌株沒有石油降解能力.

1.3 石油污染土壤富集前后高通量測序

1.3.1 測序樣本預處理 取富集后的培養液100.0mL,4℃、12000r/min離心30min,收集沉淀,以富集時所加入的石油污染土壤為對照,測序樣本使用干冰運送至深圳微科盟生物科技公司進行16S擴增子測序.

1.3.2 樣本16S擴增子高通量測序 測序樣本基因組DNA提取、16S基因擴增和測序均委托深圳微科盟生物科技有限公司完成.16S擴增區域為V3～V4,擴增引物為338F(5'-ACTCCTACGGGAG- GCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTW- TCTAAT-3'),采用IIIumina NovaSeq平臺進行雙末端測序.

1.3.3 測序數據處理 高通量測序數據經過barcode拆分后獲得有效序列,使用Qiime 2軟件中的DADA 2插件對所有樣品的原始序列進行質控、去噪、拼接和去除嵌合體,以99%核酸相似性聚類,形成操作分類單元(OTU),選取OTU代表序列,與Greengenes Database 13_8數據庫進行比對獲得物種注釋信息[14].采用LEFSe分析法(LDA>4.0),對樣品特征微生物進行標記[15].

1.4 富集前后微生物共現網絡構建

基于樣本各OTU之間Spearman系數構建共現網絡.首先將OTU豐度表中出現率小于2/3的OTU剔除;然后使用R語言中“psych”程序包,采用“Spearman法”計算OTU之間相關性系數,如果OTU之間的值大于0.6且值小于0.05,則認為兩者之間存在顯著相關,反之則不相關.在值矩陣中記為“0”;隨后使用Gephi 0.9.2軟件進行網絡可視化,網絡中圓點代表一個OUT,節點大小按OTU的豐度進行設置,以門分類水平進行節點著色,并統計各節點之間的平均度;最后使用Cytoscape 3.9.0軟件中MCODE插件,對網絡進行拓撲計算[7,16].

1.5 室內搖瓶試驗

以高通量測序結果為指導,將所篩選的石油降解菌和非石油降解菌的菌體密度調節至OD600= 1.00,在20.0mL的ERM中接種2.0μL菌體懸液,28℃,180r/min培養7d,使用紅外測油儀(北京華夏科創,OiL-480)測量石油含量,殘余石油組分使用GC-MS (Agilent,5975C)進行分析.接種方式分為3種.即為:單獨培養和共同培養.以上試驗設置3個平行對照.

1.6 數據分析

采用Origin 2020軟件進行數據整理及繪圖,采用SPSS 22.0軟件進行顯著性和單因素方差分析(<0.05).

2 結果與分析

2.1 富集體系中微生物分離鑒定及石油降解菌篩選

石油污染土壤中微生物經過富集后,從中共分離純化得到173株細菌,依據16S rRNA序列結果分為53個種,其中PYG培養基共分離得到32種微生物,R2A培養基共分離得到22種微生物,CM培養基共分離得到19種微生物.在MEGA-X軟件中采用N-J法構建菌株系統發育進化樹(圖1).這些菌株分布于Actinobacteria,Proteobacteria,Firmicutes和Deiococcus-Thermus 4個菌門,隸屬于34個屬.其中隸屬于Firmicutes主要為,大多數由CM培養基分離得到.Proteobacteria中主要為、、和;隸屬于Actinobacteria種類最多,主要為、和.其中編號為E-05、OS52和OS49-1-1菌株與M3、NSG39和DSM9035的16S rRNA序列相似性分別為97.57%、97.71%和97.54%,可初步認定這3株菌為潛在的3個新種.原油降解測試中,接種OS33、OS62-1的培養基顏色由藍色變為無色,可初步認為OS33、OS62-1具有石油降解能力.

圖1 富集體系中可培養微生物群落結構

紅色圓圈表示該菌株從相應的培養基分離得到

2.2 富集前后細菌群落多樣性

2.2.1 富集前后細菌群落α多樣性分析 采用高通量測序技術,對富集前后體系中細菌群落進行16S擴增子測序.擴增區域為:V3～V4.質控后得到的有效序列數為562157,以99%核酸相似性形成操作分類單元(OTU),去除嵌合體后,得到OTU代表序列數目為5184.從稀釋曲線來看,Shannon多樣性指數曲線趨于平坦,說明測序數據量足夠,可反映樣本中絕大多數微生物信息.從反映微生物群落α多樣性指數:chao1,faith_ PD,shannon,simpson指數來看,富集后體系多樣性指數均小于富集前的體系(圖2).以上結果說明石油污染土壤中細菌群落經過富集后,微生物的群落多樣性會降低.

2.2.2 富集前后細菌群落組成 如圖3A所示,所有樣品共檢測到24個菌門,其中5個菌門為共有菌門,分別為:Actinobacteria、Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Chloroflexi. Actinobacteria和Proteobacteria為富集后體系中豐度最高菌門,兩者共占總豐度的97.98%,分別占52.25%和45.73%,比富集前體系中分別高7.05%和19.25%.其余菌門在富集前體系中有著更高的豐度,如Firmicutes和Chloroflexi.此外在富集前體系中檢測到的18個菌門(Acidobacteria、TM7、Gemmatimonadetes、Deferribacteres、Cyanobacteria、Verrucomicrobia、Tenericutes、Nitrospirae、Planctomycetes、Armatimonadetes、Crenarchaeota、Fibrobacteres、Chlorobi、MVP_21、OP11、BRC1、FBP、OD1)在富集后的體系中未被檢測到,而Euryarchaeota只在富集后的體系中被檢測到.以上結果表明,石油污染土壤的細菌群落經過富集培養后,在門水平上發生了顯著變化.

圖2 富集前后細菌群落α多樣性

*、**和***表示差異顯著(檢驗,<0.05,<0.01和<0.001)

在屬水平的群落組成如圖3B所示,富集后體系的主要群落為:、Unspecified_、、和,而富集前體系中的主要微生物類群為:、、和.富集后體系中豐度排名前30的菌屬里,有12個屬的細菌類群被分離得到,如:、、、.其中8個屬隸屬于Actinobacteria,11個菌屬隸屬于Proteobacteria,這一結果與采用平板劃線法研究富集體系中微生物群落組成的結果一致.

為了進一步研究富集體系中的特有細菌類群,采用LEFSe(LDA閾值>4.0)對樣品中特有類群進行分析.結果顯示,共有38個細菌類群存在顯著差異,有33個細菌類群在富集前的體系中存在顯著差異(圖3C).然而,在富集后的體系中,僅有5個細菌類群存在顯著差異,如:Dietziaceae和Idiomarianceae.

圖3 富集前后細菌群落組成

(A)為在門分類水平上,富集前后樣品中細菌群落相對豐度.(B)為在屬分類水平上,相對豐度為前30的細菌群落相對豐度熱圖.紅色矩形表示該菌屬隸屬于變形菌門或放線菌門.黃色矩形表明該菌屬的微生物已被分離到.(C)為微生物類群LEfSe分析(LDA閾值:4.0 )

2.3 富集前后細菌群落共現網絡轉變

富集前后細菌群落共現網絡如圖4A、B所示,富集后體系共現網絡的連通性低于富集前,網絡更加簡單.為進一步評估共現網絡的穩定性,對網絡中各節點平均度進行統計(圖4C),富集后體系共現網絡的平均度高于富集前體系(富集后為3.273,富集前為2.477).對網絡進一步拓撲分析,如圖4D、E所示,在富集后體系中,有18個屬節點和38個環節被解析出來,低于富集前(17個屬節點和44個環節).以上結果表明,石油污染土壤中的細菌群落經過富集培養后,微生物網絡進一步簡化,細菌群落之間的聯系更加緊密,網絡結構更加穩定.

富集后體系中相關性最高的5個核心菌屬分別為:、、、、,均為豐度前30的菌屬;富集前的體系中相關性最高的8個核心菌屬分別為:、、、、、、、,只有、是豐度前30的菌屬,其余6個菌屬雖然在樣本中豐度較低,但其對維持共現網絡的穩定性發揮重要作用.核心菌屬作為整個共現網絡的基石,如果沒有這些菌屬,整個微生物共現網絡也會隨之崩潰[17-18].

圖4 富集前后共現網絡分析

(A)和(B)分別為富集后和石油污染土壤中微生物共現網絡,節點大小與微生物相對豐度成正比,節點著色以門分類水平進行.(C)為共現網絡各節點平均度統計.(D)和(E)分別為富集后和石油污染土壤中微生物共現網絡k核分解.節點的顏色表現為核心度的分布,靠近中心的節點具有較高的核心度

2.4 室內搖瓶試驗

根據富集后核心菌屬組成,選擇OS33為石油降解菌,P35為輔助菌,經過7d降解測試,原油含量如圖5A所示,單獨接種P35和OS33石油含量分別為(8506.26±253.43)mg/L和(2887.08±253.43)mg/L,共同培養的石油含量為(1435.79±322.43)mg/L.殘余原油組分如圖5B所示,OS33可降解中長鏈烷烴,在P35協同下,可進一步增加對中長鏈烷烴的利用,以上結果說明非石油降解菌P35可協同石油降解菌OS33降解石油.

圖5 培養基中原油含量及組分

菌株處理之間不同字母表示其之間具有顯著性差異(<0.05)

3 討論

從石油污染的環境中分離石油降解菌,是目前獲得石油降解菌的主要方法之一.由于缺乏具有特異性互補底物的微生物,故利用幾種石油降解菌構建的菌群其降解效率往往會受到限制[19].本研究以石油為唯一碳源,對石油污染土壤中的微生物進行富集培養,從中分離得到34個屬53個種的微生物,并且得到3個潛在新種微生物.結合高通量測序結果,豐度為前30的菌屬僅分離得到13個屬,然而豐度較高的未分離得到,相關研究表明,為中度嗜鹽微生物[20-21],常與生物降解有關[22],并且可降解石油組分中的單環芳烴[23].針對高通量測序結果中豐度較高,但未分離得到的可培養微生物,應繼續了解該菌屬的生長特性,選擇更加適合該菌屬生長的培養基,進一步豐富可培養微生物的多樣性.

采用高通量測序技術研究了石油污染土壤富集前后細菌群落組成,結果表明細菌群落在富集前后Proteobacteria和Actinobacteria中的微生物為主要類群,但在富集后兩菌門的豐度達到97.89%,占據絕對優勢,并且隸屬于Actinobacteria中的為富集后體系中標志微生物,這與Huang等[7]采用高通量測序技術研究石油對土壤中細菌群落影響的結果一致.Proteobacteria作為類群最大、種類最多的微生物類群,在原油污染的陸地和沿海濕地中廣泛分布[24],其中Gammaproteobacteria的微生物類群與石油烴的降解有關[25],如和,此外Actinobacteria中、也是經常報道的石油降解菌屬[26].

構建了富集前后細菌群落共現網絡,并對核心網絡進行解析,富集前體系中有3個核心菌屬與石油降解相關,分別為:[27-28]、[29]和[30-31],其中微生物在降解石油方面有較好的效果,已被廣泛報道.富集后體系中的核心菌屬[32-33]和[34]為石油降解菌屬,其中產鼠李糖脂類表面活性劑已被廣泛報道,而生物表面活性劑可增加石油在水中的溶解度,可協同石油降解菌降解石油[10].常應用在重金屬修復方面[35],在對石油污染土壤的理化性質研究發現,土壤發生石油污染往往也伴隨著重金屬污染和鹽堿化[36].以上結果進一步說明,在高濃度石油和營養物質的作用下,石油污染土壤中的微生物群落得以簡化,微生物朝著與石油降解有關的類群轉變.

作為富集體系中豐度最高的菌屬,卻未出現在最核心的菌屬中,而等豐度較低的菌屬卻成為核心菌屬,的很多微生物能夠降解鏈狀烷烴、單環芳烴、多環芳烴和蠟質[3,37],室內搖瓶試驗發現非石油降解菌P35能夠協同石油降解菌OS33降解石油,因此下一步將采用響應面分析法優化菌株的復配比例,進行室內模擬修復試驗,評價菌群穩定性,應用于實際場地.

4 結論

4.1 石油污染土壤中細菌群落經過富集培養后,可培養微生物隸屬于34個屬53個種,其中有3個為潛在新種微生物,OS33OS62- 1為主要石油降解菌.

4.2 石油污染土壤中細菌群落經過富集培養后,豐度較高的優勢菌屬由、、和轉變為、Unspecified_和,并且共現網絡更加簡單,結構更加穩定,核心菌屬轉變為與石油降解相關、、、、.

4.3 非石油降解菌P35可協同石油降解菌OS33降解石油.

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Bacterial community composition and co-occurrence network before and after enrichment of oil-contaminated soil.

YU Tian-fei,LIU Xiao-dong,AI Jia-min,WANG Jia-min,GUO Yi-dan,LIU Xin-hui,JIANG Ying-ying,DENG Zhen-shan*

(School of Life Sciences,Yan'an University,Yan'an 716000,China).,2022,42(8)：3858～3866

Enrichment culture is one of the most important aspects of isolating petroleum degrading microorganisms,in which the microbial community undergoes corresponding succession. The bacterial community structure,co-occurrence network and core genus composition before and after the enrichment were conducted with the streak plate method,colony PCR and Illumina-MiSeq high-throughput sequencing technology to investigate the succession pattern of bacterial communities in oil-contaminated soil during the enrichment process. The microorganisms in the enriched system were isolated and identified. We observed that the culturable microorganisms in the enriched system belong to 34 genera and 53 species,among which 3 are of potential new species,andOS33 andOS62-1are able to degrade oil. High-throughput sequencing results show that Proteobacteria and Actinobacteria are the main phylum,whenever it is before or after enrichment. But after enrichment,these two phylums are of absolutely dominant groups and the abundance is up to 97.98%. At the genus level,the dominant genuses are transformed from,,andto,Unspecified_and,the core genera are altered tofor degrating petroleum. The co-occurrence networks of bacterial communities are more simplified and stable after enrichment. The core microorganisms are altered to,,,andwhich are related to petroleum degradation. The non-petroleum degrading bacteriaP35can cooperate with the oil degrading bacteriaOS33to degrade petroleum.

petroleum pollution；enrichment cultivation；co-occurrence networks；；soil；high-throughput sequencing；community structure

X53,Q93

A

1000-6923(2022)08-3858-09

2022-01-04

陜西省教育廳專項科研計劃項目(21JK0992);延安市科技專項經費(2019-27,203010105);陜西省教育廳服務地方專項計劃項目(16JF029);延安大學博士科研啟動項目(YDBK2019-43);延安大學2021年研究生教育創新計劃項目(YCX2021080)

* 責任作者,教授,zhenshandeng214@163.com

余天飛(1998-),男,陜西安康人,延安大學碩士研究生,主要從事資源與環境微生物學研究.