鼻內翻性乳頭狀瘤中HPV 感染狀況分析

謝佳 顏永毅 龔輝成

作為一種來源于鼻黏膜上皮組織的良性腫瘤，鼻內翻性乳頭狀瘤（NIP）有鮮明的臨床特點，即易侵蝕破壞周圍組織、術后易復發、有癌變傾向。據文獻報道其發病率為0.03%～0.84%，在鼻腔鼻竇乳頭狀瘤中約占70%，在全部鼻部腫瘤中占0.5%～4.0%，超過10%的NIP 可能會發生癌變。Holm 等在研究NIP 的發病因素時發現1984 至2014 年NIP 發病率上升了7.6%。絕大多數學者在研究NIP 起病相關因素時發現，HPV 感染與NIP發生、進展有著極大關系。國內外已有不少關于HPV 與NIP 發生發展關系的文獻報道，但以往報道的相關研究樣本量相對較少，缺乏代表性，且樣本中HPV 檢出率在0%～86%，檢測結果大相徑庭，故HPV 與NIP 的關系成為當下臨床研究關注的重點。筆者團隊將在本次實驗中分析HPV 在NIP 中的感染情況，并且運用核酸分子快速導流雜交基因芯片分型技術（HybriMax）檢測NIP 中的HPV 亞型，為進一步研究 HPV 介導NIP 發病、復發及惡變機制提供實驗及理論依據。

資料與方法

一、臨床資料

選取廣州市第十二人民醫院住院患者的石蠟包埋存檔組織標本，2010 至2019 年48 例經病理確診為NIP （男32 例，女16 例，中位年齡52.2 歲）患者的石蠟包埋組織標本作為NIP 實驗組；另取同期20 例因鼻中隔偏曲行鼻中隔矯正患者術中所取鼻中隔切口邊緣黏膜組織的石蠟包埋標本（男11 例，女9 例，中位年齡45 歲）作為正常鼻黏膜對照組；所有入組患者均在本院耳鼻咽喉頭頸外科住院治療，在只給予手術治療尚未給予放射治療、化學治療、IFN 治療、免疫治療等措施的條件下進行病理組織學檢查，并排除其他系統的惡性腫瘤。

二、HE 及免疫組織化學（組化）染色

NIP 實驗組48 例石蠟標本及正常鼻黏膜對照組20 例石蠟標本均經過10%中性福爾馬林溶液固定、脫水及石蠟包埋。

1.常規病理制片

①切片：將每例石蠟標本作4 μm 厚的連續切片4 張；②展片、貼片：在40～45 ℃的水面上，用鑷子將蠟片平鋪于水面并充分展平，將蠟片貼于載玻片上，載玻片預先涂上0.05%多聚賴氨酸；③烤片：將蠟片放在烤箱中，溫度設置為60 ℃，時間設置為0.5～1 h；④脫蠟：使用二甲苯、不同濃度乙醇進行脫蠟；⑤染色：進行HE 及免疫組化染色，根據試劑盒具體做法進行操作（4 張切片中，2 張切片行目的蛋白免疫組化染色、1 張切片行HE 染色、剩下1 張切片則用于設置空白對照）。

2.判斷標準

在400 倍顯微鏡下，選取5 個視野，需遵循隨機取樣原則，觀察5 個視野中的細胞染色情況。①根據5 個視野中觀察到的染色細胞平均百分比記分： 0%～10%、11%～25%、26%～50%、51%～75%、超過76%。分別記為1 分、2 分、3 分、4分、5 分。②根據5 個視野中觀察到的細胞著色強度進行分級：未著色、淡黃色、黃色、棕黃色，分別記為0 級、1 級、2 級、3 級。③最終判定：根據①、②結果的乘積判定，＜ 3 為（-），定義為陰 性 表 達；3～6 為（+）、7～9 為（++）、10～12 為（+++），均定義為陽性表達。病理切片的觀察、結果讀取及記錄由2 位醫師負責，由符合資質的病理科醫師進行最終審核。

三、運用HybriMax 檢測HPV 病毒分型檢測

1.材料準備

將NIP 實驗組中的48 例石蠟標本及正常鼻黏膜對照組中的20 例石蠟標本隨機進行排列，從每個標本上連續切下3 片石蠟組織，厚度均為10 μm，并將切下的石蠟組織放入干凈研缽。

在研缽中加入適量液氮后充分研磨，根據試劑盒說明進行DNA 的提取。

PCR 總反應體積為25 μL，其中含有PCR premix 23.25 μL、Taq 酶0.75 μL、不同標本的HPV DNA 1 μL，并設置蒸餾水作為HPV 陰性對照，在PCR 儀上設置好反應程序，循環次數為40 次。

將低密度基因芯片放入導流雜交儀中，芯片標記有21 種常見HPV 寡核苷酸探針（HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、CP8304），根據試劑盒具體做法進行操作，酶標顯色。以上全過程需進行無菌操作。

四、統計學處理

采用統計軟件SPSS 22.0。計數資料用率或構成比表示，計數資料比較采用檢驗，P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、HPV 在NIP 實驗組與正常鼻黏膜對照組中的感染情況

NIP 實驗組與正常鼻黏膜對照組HPV 感染情況見表1。

表1 NIP 實驗組與正常鼻黏膜對照組HPV 感染情況（例）

經統計學分析，NIP 實驗組與正常鼻黏膜對照組的中位年齡、性別比較差異均無統計學意義（P均＞ 0.05）。NIP 實驗組組織標本中HPV 總陽性率為64.58%（31/48），正常鼻黏膜對照組組織標本中HPV 陽性率為0（0/20），NIP 陽性率高于正常鼻黏膜對照組，差異有統計學意義 （= 32.178，P ＜ 0.01）。

二、HPV 亞型在NIP 實驗組石蠟標本中的分布情況

在48 例NIP 標本中，31 例檢測出HPV，其中檢測出49 株HPV 病毒，含括12 個亞型：HPV6占4.08%（2/49）、HPV11 占32.65%（16/49）、HPV16 占12.24%（6/49）、HPV18 占4.08%（2/49）、HPV33 占4.08%（2/49）、HPV39 占2.04%（1/49）、HPV44 占10.20%（5/49）、HPV52 占8.16%（4/49）、HPV53 占2.04%（1/49）、HPV56 占2.04%（1/49）、HPV58 占16.30%（8/49）、HPV68 占2.04%（1/49）。

討 論

NIP 是一種良性腫瘤， 發生于鼻黏膜上皮組織，鑒于其易侵蝕破壞周圍組織、術后易復發、有癌變傾向等的顯著特點，多數學者認為其是一種交界性腫瘤，各研究中NIP 有較高的復發率及惡變率，其中復發率高達30%～78%，且惡變率可達5%～21%。NIP 的發病因素尚未完全清楚，雖然NIP 患病人群中以中老年男性患者居多，但并無相關研究明確年齡、性別與NIP 發病的關系。國內外許多研究在NIP 標本中檢測出HPV，認為NIP的發病與HPV 感染存在密切關系，但受取樣、不同檢測方法、不同地區及其他因素影響導致檢出率差異性較大。目前，HPV 介導NIP 發生發展的機制尚不清楚，且NIP 惡變機制也未明了，在判斷NIP 是否會發生惡變及如何有效地降低其復發率等方面研究也有所欠缺。

HPV 是一種雙鏈閉環DNA 病毒，其致病途徑是通過感染人體表皮和黏膜鱗狀上皮，研究表明HPV 亞型至今已有200 種，可根據HPV 亞型致病力及致癌力2 個方面進行比較，將HPV 亞型歸為兩類：低危型（HPV 6、11、40、42 等） 、高危型（HPV 16、18、31、33、35 等）。HPV 自 首 次發現以來一直被認為是手足尋常疣、扁平疣及尖銳濕疣的病因。經后期大量研究發現，當受到某些病毒感染時易引起腫瘤發病，如EB 病毒與鼻咽癌，伯基特（Burkitt）淋巴瘤，肝炎病毒與肝癌，HPV 與宮頸癌等，使得人們越來越關注病毒與腫瘤發病之間的關系，研究表明高危型HPV 檢測對宮頸病變的檢出有重要意義。HPV 不僅與宮頸癌起病有明確關系，還與10%～15%其他部位腫瘤的發病有關聯，如陰道、陰莖、肛門等部位， HPV與乳腺癌、頭頸部腫瘤、食管癌、膀胱癌等之間也存在聯系。隨著病毒分子生物學的研究發展，對HPV 感染致病的研究已不再聚焦于宮頸疾病，HPV 與頭頸部腫瘤，特別是與NIP 的關系，也成為一項熱門研究。近年來，HPV 感染可引發頭頸部腫瘤這一結論得到大多數學者的認可。

在NIP 發病相關因素的研究中，大多數學者認為HPV 感染與NIP 的發生發展密切相關。Syrjantn 等（1987 年）最先運用原位DNA 雜交技術在NIP 中檢測出HPV DNA。此后，國內外不斷出現有關HPV 感染與NIP 的發生發展關系的研究報道。Beck 等（1995 年）研究了32 例NIP 的病理標本，應用PCR 技術發現有20 個標本被檢出HPV 陽性（20/32，62.5%），得出NIP 與HPV 感染有關的結論。McGovern 等報 道HPV 檢出率為76.2%（16/21）。包永新等對HPV16 與NIP進行研究，發現NIP 中HPV16 陽性率為62.5%，NIP 伴癌前病變中HPV16 陽性率達66.7%，說明在NIP 致病過程中HPV16 可能起到關鍵作用。關亞峰等運用PCR 技術在NIP 中檢測出HPV57，陽性率為78.3%，得出HPV57 可能與NIP 的發病密切相關。有研究表明NIP 同時合并2 種HPV 亞型感染率達17.5%，合并3 種HPV 亞型感染率達6.7%。趙仁伍等研究使用薈萃分析法證實了HPV 感染可以增加NIP 發病的風險，并可能在NIP 的復發中起到至關重要的作用。王茂華等用薈萃分析法進一步驗證了HPV 感染與NIP 的發生、復發及癌變相關。同時，有研究表明NIP 癌變中高危型HPV 感染率明顯高于復發及原發NIP，而NIP 復發中高危型HPV 感染率明顯高于原發NIP。Hwang 等（1998 年）應用PCR 技術 對42例NIP 石蠟包埋組織進行研究，發現良性NIP 中有HPV6 和HPV11 擴增，惡變NIP 中有HPV16 擴增。有學者認為HPV16、11/16、18、16/18 可以增加NIP 癌變的風險，而HPV6、11、6/11（尤其是HPV6）被認為是NIP 復發的危險因素。有學者研究表明，鱗狀上皮增生、角化過度、核分裂像增加是影響NIP 預后及復發的重要指標。然而不少學者研究則表明HPV 感染與NIP 復發無明顯關系，故HPV 感染是否促進了NIP 的復發仍然存在爭議。

本研究中針對NIP 中HPV 感染及表達情況，筆者團隊運用了HE、免疫組化染色及HybriMax，結果顯示在所有NIP 石蠟標本中HPV 總陽性率為64.58%，遠高于對照組的0。在48 例NIP 標本中，檢測出49 株HPV 病毒，含括12 個亞型（HPV6、11、16、18、33、39、44、52、53、56、58、68），認為HPV 感染與NIP 的發生有著密切關系，特別是HPV11、16、44、58 亞型。

綜上所述，國內NIP 的發生發展與感染了HPV11、16、44、58 亞型的可能性最大，但HPV如何致癌的分子途徑尚未研究明白，有待深入研究。