趙建濤,岳亞飛,張前兵,馬春暉
(石河子大學動物科技學院,新疆 石河子 832000)
紫花苜蓿(Medicago sativa)是多年生的豆科苜蓿屬植物,因其具有抗寒、抗旱、耐鹽堿、適口性好、粗蛋白含量高、干草產量高等特點[1],被廣泛種植。研究表明,在土壤肥力低下的地區或不適宜種植糧食作物的地區,種植苜蓿不僅可以避免牧草與糧食競爭土地,而且可以降低土壤中鹽堿含量,并提高土壤肥力。新疆北疆地區是我國苜蓿的主要種植區之一,其寒冷天氣約占全年的一半,且年平均降雪量約為38.7 mm,年均積雪厚度約為23.8 cm。研究發現,寒冷天氣會影響紫花苜蓿的正常生長發育,不僅會引起植物的生理代謝失調,甚至可以導致植株死亡[2]。不同秋眠級苜蓿的抗寒性有所差異,其抗寒性可以由秋眠等級來預測[3]。也有研究表明,苜蓿的秋眠等級并不能代表其冬季的抗寒能力[4]。選擇抗寒性強的苜蓿品種對大力發展北疆地區苜蓿產業、解決新疆優質飼草短缺問題具有重要的經濟意義。
研究表明,丙二醛(malondialdehyde,MDA)能夠較好地指示植株的抗寒性,當植物長時間處于寒冷條件時,會引起植株體內活性氧含量增加、膜脂過氧化程度加劇并且會伴隨大量丙二醛的產生[5-7]。通過對不同的苜蓿品種在寒冷條件下的研究發現,不同苜蓿品種中丙二醛的增加量也存在差異,抗寒性強的苜蓿品種丙二醛含量積累較少[8]。研究發現,除丙二醛之外,植物在低溫脅迫下還可以通過增加可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate,WSC)和可溶性蛋白(soluble protein,SP)等滲透調節物質含量,來提高抗氧化酶活性[9],進而提高植株的抗寒能力[10-11]。因此,可以通過評價寒冷條件下植株體內丙二醛、可溶性蛋白和可溶性碳水化合物含量的多少來比較不同植物品種之間抗寒性的差異。
冬季積雪是新疆干旱區農業的重要水分補給來源之一[12],研究表明,積雪覆蓋可以有效避免農作物冷害與凍害的威脅,且消融雪水可以為多年生植物提供生長所需的水分[13],同時也是農作物越冬的重要保障。研究發現,積雪對土壤的水熱狀況、苜蓿的抗寒性以及越冬率都有重要影響[14]。盡管前人就覆雪對不同作物的影響等問題已做了長足研究,但是不同覆雪厚度對不同秋眠級的紫花苜蓿品種的越冬率及抗寒指標的影響等問題研究較少,尤其對不同覆雪厚度條件下的不同秋眠級紫花苜蓿品種抗寒指標的動態變化規律鮮見報道。因此,本研究通過測定不同覆雪厚度條件下田間土壤的不同土層溫度,苜蓿根頸中可溶性蛋白、可溶性碳水化合物和丙二醛含量以及苜蓿越冬率及干草產量,嘗試明確覆雪厚度對各秋眠級紫花苜蓿的抗寒性和越冬率的影響機制,以期為新疆北疆地區強抗寒性的紫花苜蓿品種篩選以及苜蓿越冬問題的解決提供理論依據。
試驗于2014-2015 年在新疆石河子大學牧草試驗站(44°20′N,88°30′E,海拔450.8 m)進行,此地區屬于溫帶大陸性干旱氣候,夏季短而炎熱少雨,冬季長而干燥寒冷,年均氣溫為7.5~8.2 ℃,年日照時數為2721~2818 h,年降水量為180~270 mm,年蒸發量為1000~1500 mm,無霜期為147~191 d。試驗地土壤類型為灰漠土,耕作土層(0~20 cm)土壤有機質含量為15.5 g·kg-1,堿解氮含量為16.8 mg·kg-1,速效磷含量為5.4 mg·kg-1,pH 值為6.44。試驗當年11 月29 日第1 次降雪,降雪次數約為31,翌年春季3 月18 日冰雪融化返青。
試驗采用雙因素隨機區組設計,試驗田的覆雪厚度(因素一)為0、10 及15 cm 共計3 個處理,小區覆雪處理用6 m×8 m 的控雪架(孔徑為15 mm 的鐵質塑料篩網)控制(每次降雪后人工打掃控雪架,使其保持不同的覆雪厚度)。不覆雪處理:在每次降雪之后及時將積雪清除,盡量保證試驗田表層無積雪覆蓋。若降雪厚度小于覆雪厚度的10 及15 cm,則人工進行增加覆雪厚度以達到試驗處理的要求。供試紫花苜蓿品種(因素二)分別為:秋眠級為1 級的紫花苜蓿馴鹿(AC Caribou)、3 級的康賽(Concept)、5 級的巨能551(Magnum 551)、7 級的賽迪7(Sardi 7)、9 級的WL656HQ(表1)。

表1 供試苜蓿秋眠等級及來源Table 1 Fall dormancy grade and source of alfalfa varieties for test
紫花苜蓿試驗田建植于2013 年4 月,種植方式為人工條播,每個小區面積為48 m2(6 m×8 m),每個品種重復3 次,播種量為18.0 kg·hm-2,播種深度為2~3 cm,行間距為25 cm,滴灌帶間距為50 cm,灌水方式為滴灌。
在積雪形成(2014 年11 月29 日)和積雪完全消融(2015 年3 月18 日)當天進行土壤溫度測定,采用多點式土壤溫度記錄儀(i500-E3TW,玉環智拓儀器科技有限公司)測定不同土層深度(1~10 cm)和苜蓿冠層處(高于地面5 cm 左右)溫度,每個土層放置3 個溫度探頭[15],每間隔10 min 測定1 次。在各處理埋設2 根時域反射儀(time domain reflectometry,TDR,JK-100F,優科儀器儀表有限公司),測定不同土層深度(0、10 和15 cm)的含水率,每個處理重復10 次,取其平均值。
用考馬斯亮藍G-250 染色法測定可溶性蛋白含量[16];用蒽酮比色法測定可溶性碳水化合物含量[17];用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量[15]。
于2014 年的最后一茬苜蓿收割后統計各紫花苜蓿品種(1 m×1 m)在越冬前的植株總數及2015 年苜蓿返青后的存活總株數,每個品種重復3 次,計算苜蓿越冬率(winter survival rate,WSR):

用Excel 2010 對數據進行整理,所有數據均為3 次重復的平均值。用SPSS 21.0 軟件對SP、WSC 和MDA 含量進行多因素方差分析,多重比較采用Duncan 法。用SPSS 21.0 軟件進行主成分分析,用Excel 2010 軟件進行繪圖。
從無積雪時期(11 月28 日)到積雪完全消融時期(3 月25 日)土壤凍結深度的變化過程來看(圖1),從11 月28日土壤已有凍結,在翌年2 月10 日土壤凍結深度達到最大,為50 cm,直到2 月12 日開始融化,整個凍結時期長達117 d。隨后,隨著春季溫度的回升,土壤出現融化現象。圖1 中AC 段為凍結期,CD 段為融化期。在整個試驗期內,根據土壤的凍深變化曲線,選取凍結期(12 月17 日)和融化期(2 月27 日)這兩天來描述覆雪厚度下紫花苜蓿根冠處和土壤表層(1~10 cm)溫度的日變化規律。

圖1 土壤凍結程度變化曲線Fig.1 Change curve of soil freezing degree
在凍結期內,選擇有代表意義的12 月17 日進行試驗,觀測不同覆雪處理下紫花苜蓿大田里土壤溫度的日變化情況(圖2)。試驗發現,大氣溫度對不同覆雪紫花苜蓿冠層處溫度影響比較顯著。與無積雪覆蓋處理相比,有積雪覆蓋時其溫度的日變化幅度較小。無積雪處理下紫花苜蓿冠層處9:00 時溫度最低(-30.5 ℃),隨著溫度的上升,在當日的14:00 達到了最高溫度(-17.1 ℃),其溫差在13.4 ℃左右(圖2A)。無積雪處理下土壤表層的溫度對大氣溫度的響應較小,其溫差約在2.0 ℃。有積雪覆蓋下,不同秋眠級紫花苜蓿的冠層處溫度均在10:00 時最低,分別為-10.7 和-5.9 ℃,且有積雪比無積雪最低溫晚1 h左右出現,在當日18:00 時溫度均達到了最高,分別為-7.7 和-5.2 ℃,且有積雪比無積雪最高溫晚4 h 左右,溫差變化幅度分別為3.0 和0.7 ℃(圖2B,C),覆雪厚度的增加可以明顯提高土壤表層溫度。

圖2 凍結期不同覆雪厚度下紫花苜蓿冠層及土壤表層溫度的日變化Fig. 2 Diurnal variation of the temperature of alfalfa canopy and soil surface under different snow cover thicknesses during the freezing period
在融化期內,于2 月27 日觀測不同覆雪處理下紫花苜蓿田間土壤溫度的變化情況(圖3)。此時各處理積雪已經完全融化,其溫度的日變化規律基本相同。隨著溫度的回升,紫花苜蓿冠層回溫速度和溫度大小的排序為:冠層處>土壤表層1 cm>土壤表層10 cm。苜蓿冠層處和土壤表層1 cm 處的溫度都在9:00-16:00 突然升高并且達到當日的最大溫度,從16:00 后溫度開始迅速下降,日溫差約為11.6 和10.6 ℃,而土壤表層10 cm 處溫度的變化表現出滯后性,在10:00-18:00 時增加,18:00 后溫度降低,溫度的變化幅度為6.7 ℃(圖3)。

圖3 融化期不同覆雪厚度下紫花苜蓿冠層及土壤表層溫度的日變化Fig. 3 Diurnal changes in the temperature of alfalfa canopy and soil surface under different snow cover thicknesses during the melting period
在土壤凍結時期,不同覆雪厚度下的土壤表層含水率呈大幅度降低趨勢(圖4),覆雪10 和15 cm 處理下的土壤含水率最小值分別為7.56%和8.50%;無積雪覆蓋處理下的土壤含水率變化幅度較為劇烈,其含水率的最小值為4.10%。從第360 天到次年第31 天的時間內不同覆雪厚度下的土壤含水率均保持相對穩定,其中不覆雪為4%~5%,覆雪10 cm 的土壤含水率為7%~8%,覆雪15 cm 的土壤含水率為8%~9%。由此可知,相比于無積雪覆蓋,有積雪覆蓋在冬季最寒冷時期能顯著提高土壤表層含水率,并且隨著覆雪厚度的增加,土壤含水率的變化大小順序為無覆雪<覆雪10 cm<覆雪15 cm。

圖4 不同覆雪厚度下表層土壤(0~15 cm)含水率Fig. 4 Moisture content of the surface soil(0-15 cm)with different snow cover thickness
在土壤融化時期,不同覆雪處理下的土壤含水率隨著春季溫度的回升驟然升高。覆雪10 和15 cm 處理下的土壤含水率存在一定差異,其土壤含水率的最大值分別為20.44%和22.20%;無積雪覆蓋處理下土壤含水率變化幅度較小,其含水率的最大值為16.23%。由此可知,相比于無積雪處理,有積雪在春季回暖時期明顯提高了土壤表層的平均含水率,并且隨著覆雪厚度的增加,土壤含水率的變化幅度逐漸增大。在這段時期內,不同覆雪厚度處理下的土壤平均含水率均出現了較強的波動,并且有著較強的隨機性與不可預測性。
在相同覆雪處理下,SP 含量呈先升高后降低的趨勢,且5 個品種SP 含量均在同一時間達到最大(12 月31日),其中馴鹿在覆雪10 cm 時最大;康賽和賽迪7 變化差異不大(P>0.05),且都在覆雪15 cm 時含量達到最大值,其中康賽最大(76.94 mg·g-1)(表2);在3 月2 日時不同覆雪處理下SP 含量均出現最小值(巨能551 除外),且賽迪7 最小,為35.19 mg·g-1。在11 月26 日-12 月31 日,不同覆雪厚度下5 個苜蓿品種的SP 含量變化不顯著(P>0.05);在3 月2 日時差異顯著(P<0.05),并且隨著覆雪厚度的增加,各苜蓿品種的SP 含量逐漸增加(賽迪7除外)。

表2 不同覆雪厚度下各秋眠級苜蓿抗寒指標分析Table 2 Analysis of cold resistance index of alfalfa at different fall dormancy levels under different snow cover thickness
WSC 含量從整體上均呈降低的趨勢(11 月26 日-3 月2 日),不同覆雪處理下的各苜蓿品種的WSC 含量在11 月26 日均處于最高值,在相同覆雪情況下,5 個苜蓿品種隨著時間的推移逐漸降低,其中WL656HQ 在不覆雪時(3 月2 日)WSC 含量最低,為63.1 g·kg-1,康賽在覆雪10 cm 時(11 月26 日)含量最大,為287.8 g·kg-1。在11月26 日,不同紫花苜蓿品種WSC 含量不同,且差異顯著(P<0.05);不同覆雪厚度處理對WSC 含量影響不顯著(P>0.05)。在15 cm 覆雪處理下,WL656HQ 品種的WSC 含量在11 月26 日處于最大值,并且在整個試驗期間變化差異顯著(P<0.05),巨能551 在試驗期間WSC 含量變化差異不大(P>0.05),其后WSC 含量隨時間推移逐漸降低。在3 月2 日,不同覆雪處理下WSC 含量均呈先增加后降低的趨勢,且在覆雪10 cm 時達到最大(馴鹿和WL656HQ 除外)。
在整個試驗期內的相同覆雪處理下,MDA 含量整體變化均呈先升高后降低的趨勢。5 個品種的MDA 含量均在覆雪15 cm 時達到最大(12 月31 日),其中馴鹿、康賽和WL656HQ 在覆雪10 cm 處理下達到最大;巨能551 和賽迪7 在無覆雪處理下達到最大,并且賽迪7 的MDA 含量最大,為236.47 mmol·g-1。覆雪10 和15 cm 時,在11月26 日時5 個品種間的MDA 含量均差異不顯著(P>0.05),在12 月31 日5 個苜蓿品種間MDA 含量均差異顯著(P<0.05)。在12 月31 日時,不同覆雪處理下巨能551 和賽迪7 的MDA 含量呈先降低后增加的變化規律,并且下降與上升的幅度較大,康賽和WL656HQ 均呈下降趨勢,其下降的幅度較大。馴鹿和康賽在11 月26 日時MDA含量出現最低值,巨能551、賽迪7 和WL656HQ 在3 月2 日時出現最低值。
秋眠級9 的紫花苜蓿在無覆雪處理下,未能成功越冬(圖5)。在無覆雪處理下,各秋眠級紫花苜蓿越冬率的大小順序為秋眠級3>秋眠級1>秋眠級5>秋眠級7>秋眠級9,在覆雪10 cm 處理下,各秋眠級紫花苜蓿越冬率的大小順序為秋眠級3>秋眠級7>秋眠級5>秋眠級9>秋眠級1,在覆雪15 cm 處理下,各秋眠級紫花苜蓿越冬率的大小順序為秋眠級5>秋眠級3>秋眠級1>秋眠級7>秋眠級9。因此,有積雪處理下,秋眠級3 的紫花苜蓿品種越冬率表現最好,其次是秋眠級5 的苜蓿品種。

圖5 不同覆雪厚度下各秋眠級苜蓿越冬率的變化Fig. 5 Changes of winter survival rate of alfalfa of different fall dormancy grades under different snow cover thickness
秋眠級9 的紫花苜蓿品種在無覆雪處理下,因未能成功越冬,致使第二年沒有干草產量(圖6)。不同覆雪處理條件下不同秋眠級紫花苜蓿的年干草產量為3.2×103~27.5×103kg·hm-2。在不同覆雪條件下,各秋眠級紫花苜蓿的年干草產量均隨著覆雪厚度的增加而增加,且均在覆雪15 cm 處理時產量達到最大。覆雪為15 cm 處理時,秋眠級為5 的紫花苜蓿品種干草年產量達到最大,為27.5×103kg·hm-2,秋眠級1 的紫花苜蓿品種產量最小,為18.8×103kg·hm-2。在無覆雪處理下各紫花苜蓿干草產量的順序為秋眠級5>秋眠級3>秋眠級1>秋眠級7>秋眠級9,在覆雪10 cm 處理下苜蓿干草產量的大小順序為秋眠級5>秋眠級7>秋眠級9>秋眠級1>秋眠級3,在覆雪15 cm 處理下為秋眠級5>秋眠級7>秋眠級9>秋眠級3>秋眠級1。各秋眠級紫花苜蓿干草產量大小順序為覆雪15 cm>覆雪10 cm>覆雪0 cm。因此可知,在各覆雪處理下,秋眠級5 的紫花苜蓿品種干草產量均為最高。

圖6 不同覆雪處理下各秋眠級紫花苜蓿干草的年產量Fig. 6 Annual hay yield of various fall dormancy grade alfalfa under different snow-covering treatments
對5 個不同秋眠級的紫花苜蓿品種的SP、WSC、MDA、WSR 和干草產量5 個指標進行主成分分析,提取主成分特征值大于1,得到兩個主成分,主成分1 為2.073,主 成 分 2 為 1.493。用2 個 主 成 分 變 量PCA1、PCA2代替原來的5 個指標(表3),得出各主成分的特征向量為:


表3 主成分得分系數矩陣Table 3 Principal component score coefficient matrix
通過選取的第1 和第2 主成分的方差貢獻率α1(41.458%)、α2(29.852%)作為權數構建綜合評價模型:Y=α1×Y1+α2×Y2,即Y=0.41458×Y1+0.29852 ×Y2(表4)。
不同秋眠級紫花苜蓿的綜合評分均隨著覆雪厚度的增加而增加(表4)。秋眠級為5 的苜蓿品種在覆雪厚度為10 和15 cm 時評分較高,且覆雪厚度為15 cm 時,其綜合評分最高。秋眠級為9 的紫花苜蓿品種在3 個覆雪處理下評分均是最低,且在無覆雪下的綜合評分最低。

表4 各秋眠級苜蓿在不同覆雪厚度下的主成分、綜合得分及排序Table 4 Principal components,comprehensive scores(CS)and rankings of various fall dormancy grade alfalfa under different snow cover thickness
研究發現,植物在低溫脅迫下,可以通過增加體內滲透調節物質的含量來緩解低溫傷害,且含量越高抗寒能力越強[18]。可溶性蛋白和可溶性碳水化合物是植物重要的滲透調節物質和營養物質,植物在惡劣環境的脅迫下,體內會產生一些新的或更多的逆境蛋白[19]。可溶性蛋白含量可以反映植物代謝情況,能夠指導植物在逆境下的相關研究[20]。研究表明,紫花苜蓿在低溫脅迫早期就啟動相關酶的基因表達,通過增加植株的可溶性蛋白含量來緩解環境引起的傷害[21]。本研究發現,各秋眠級紫花苜蓿隨著溫度的降低,根頸中可溶性蛋白含量增加,且秋眠等級越低,可溶性蛋白含量變化范圍越小,均在12 月底溫度最低時可溶性蛋白含量最大,在春季回暖之時,可溶性蛋白含量逐漸減少。植物為了適應脅迫環境,通過累積滲透調節物質來提高細胞保水力,從而對細胞生物膜起到一定的保護作用,進而保證植物細胞的正常生理功能[22]。研究表明,在低溫脅迫條件下植物的可溶性碳水化合物含量越高,植物的抗寒能力越強[23]。通過對紫花苜蓿在低溫脅迫處理下的研究發現,苜蓿可以通過增加根頸部可溶性碳水化合物等營養物質含量來提高自身的抗寒能力[24]。本研究發現,5 種不同秋眠級的紫花苜蓿可溶性碳水化合物含量均呈先上升后下降的趨勢,且苜蓿品種的抗寒能力越強,其可溶性碳水化合物含量的上升幅度較大,與前人研究結果一致[25]。
低溫逆境脅迫會引起植物細胞中活性氧的代謝平衡被打破,導致體內積累大量的活性氧,進而對細胞膜系統造成損傷[26-27]。膜脂過氧化作用是指細胞膜上的磷脂雙分子層結構被氧化,生成丙二醛等過氧化物,丙二醛含量的增加會對細胞膜造成破壞。研究表明,丙二醛的含量可以衡量植物在逆境脅迫下的情況,當植物受到低溫脅迫時,體內丙二醛含量均有不同程度的上升,其高低可以反映細胞膜的過氧化程度,并且可以用來判斷細胞膜上雙分子層的受害程度[28-29]。本研究發現,隨著溫度的降低,各秋眠級苜蓿中丙二醛含量迅速增加,這與前人的研究結果一致[30]。在覆雪的情況下,低秋眠級的紫花苜蓿品種的可溶性蛋白和可溶性碳水化合物含量高于無覆雪情況[31],這可能是因為覆雪可以減少地表溫度散熱,來維持相對穩定的溫度條件,降低季節寒冷的變化對紫花苜蓿生理代謝的影響[15]。由此可知,積雪覆蓋可以降低紫花苜蓿根頸中丙二醛的含量、提高可溶性碳水化合物及可溶性蛋白含量來減弱低溫脅迫對細胞膜造成的過氧化作用。
由于新疆北疆地區冬季常年降雪,紫花苜蓿的越冬問題和干草產量是衡量苜蓿生產性能及為北疆地區引種選育的重要指標。積雪對紫花苜蓿根冠及根頸下土層溫度的影響顯著,隨著覆雪厚度的增加,積雪對其覆蓋土層有明顯的增溫作用,可以顯著提高紫花苜蓿的越冬率。通過對不同覆雪條件下各秋眠級的紫花苜蓿品種越冬率分析發現,無覆雪處理下各紫花苜蓿秋眠類型的大小排序為高秋眠級>半秋眠級>非秋眠級,且高秋眠級的紫花苜蓿越冬率顯著低于低秋眠級苜蓿。在無積雪處理下,非秋眠級(秋眠級為9)苜蓿的根莖受凍死亡,這可能是因為北疆地區秋季溫度較高,使得紫花苜蓿生長旺盛,但在冬季天氣降溫迅速,苜蓿根部養分不足導致苜蓿植株不能安全越冬[32]。通過對23 個不同秋眠級紫花苜蓿品種和92 個地區綜合分析研究,發現紫花苜蓿的秋眠等級與苜蓿的抗寒能力有直接聯系,因此可以作為引種及產量預測的主要依據[33]。研究表明,秋眠等級與越冬率之間存在負相關關系,說明秋眠等級低的苜蓿品種抗寒能力相對較強,更適應寒冷的氣候條件[34]。本研究發現,覆雪對各秋眠級紫花苜蓿的越冬率均有顯著地提高,并且不同秋眠級的紫花苜蓿品種越冬率存在一定差異,這主要是因為覆雪降低了低溫對苜蓿根部的凍害,可以維持苜蓿根部溫度的相對穩定。
本研究發現,覆雪處理下的各秋眠級紫花苜蓿中秋眠級為5 的品種干草產量顯著高于其他4 個秋眠級苜蓿。對比無覆雪時的紫花苜蓿品種的干草產量可以發現,秋眠級為7 和9 的品種越冬率較低,致使苜蓿的干草產量也較低。研究表明,不同秋眠級苜蓿的生產性能有所不同,并且不同秋眠級的苜蓿品種在同一種植區的生產性能也存在明顯差異[35]。通過對7 個不同紫花苜蓿品種的干草產量進行相關分析發現,秋眠級高的苜蓿品種干草產量高于秋眠級低的苜蓿品種[36]。本研究表明,覆雪可以保證不同秋眠級的紫花苜蓿成功越冬,并且各秋眠級的紫花苜蓿覆雪的干草產量顯著高于不覆雪,巨能551 苜蓿具有越冬率高、干草產量高等突出特點,比較適合在新疆北疆地區種植,此次試驗數據能夠為新疆北疆地區半秋眠級和非秋眠級紫花苜蓿的推廣種植提供理論指導。
冬季的積雪可以提高紫花苜蓿的抗寒性,并且保障各秋眠級的苜蓿達到90%以上的越冬率。與不覆雪處理相比,覆雪可以提高不同秋眠級紫花苜蓿的干草產量,并提高越冬率。綜合分析得出,覆雪15 cm 處理下巨能551的綜合得分最高。通過綜合比較篩選出巨能551 苜蓿品種在覆雪處理下的干草產量、抗寒性指標及越冬率等方面表現最佳。因此,在新疆北疆冬季降雪的區域,半秋眠級的苜蓿品種較適宜在該地區種植。