過表達長穗偃麥草EeHKT1；4 基因增強擬南芥抗旱耐鹽性分析

張勇，田小霞，鄭明利，毛培春，孟林

（北京市農林科學院草業花卉與景觀生態研究所，北京 100097）

干旱和鹽是限制植物生長發育和作物產量的主要非生物脅迫因素［1-2］，會導致植物細胞中有毒離子的過量積累，影響細胞代謝并抑制生長發育［3］。K+在大多數植物的生長發育過程中發揮重要作用，Na+與K+的理化性質相似，這導致K+易在細胞內被Na+置換，Na+流入使質膜去極化，激活外向整流K+通道導致K+流出［4］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）細胞質中高濃度Na+會抑制根部AKT1 通道對K+的吸收［5］，故Na+毒性是主要的生長抑制因素［6］。植物試圖在細胞質中保持較低的Na+/K+，該比率通常被用作評估鹽脅迫強度和植物耐鹽性［7］。為了應對外界Na+壓力，植物已經進化出完整的機制來確保在外部高Na+濃度的情況下對K+的吸收，以保證植物正常的生長發育［8-9］；一方面限制Na+的流入，促進Na+外排以抵消不可避免的Na+流入；另一方面通過木質部長距離運輸將Na+轉運至植株的各個組織器官中，實現Na+在植物器官的重新分配［10-11］，避免Na+在局部組織中過高累積。

植物高親和性K+轉運蛋白基因（high-affinity potassium transporters，HKT）編碼K+、Na+轉運或K+-Na+共轉運質膜通道蛋白［12］；雖然在雙子葉植物基因組中的代表性較弱，如楊樹（Populus）和擬南芥中僅存在單個HKT基因［13］，但在單子葉植物中HKT家族包含更多成員，表現出巨大的功能多樣性；如，水稻（Oryza sativa）擁有9 個HKT基因［13］，大麥（Hordeum vulgare）和小麥（Triticum aestivum）基因組中擁有5～11 個HKT基因［14］。基于系統發育和功能分析，植物HKT基因已分為兩個亞家族［15］；亞家族I 類HKT存在于所有高等植物物種中，編碼Na+選擇性轉運蛋白，而亞家族Ⅱ類基因是單子葉植物所特有，編碼Na+和K+共轉運蛋白系統［1，16-17］。亞家族I 類HKT的Na+轉運蛋白已被證實在植物耐鹽方面起關鍵作用［1，18-19］。AtHKT1；1在擬南芥的維管組織（木質部薄壁組織和韌皮部細胞）中表達，已被證明有助于從木質部汁液中卸載Na+及在鹽脅迫下將Na+加載到韌皮部汁液中，從而減少植株地上部Na+的積累［20］。水稻OsHKT1；5和小麥TaHKT1；5-D均在根維管系統中表達，且在高鹽濃度條件下阻止Na+由根部向地上部轉移，將Na+保留在根中，從而使葉組織能夠維持K+穩態［16，21-22］。盡管亞家族I類HKT基因均在維管組織中表達，參與植物體內Na+的分配，但I 類基因在不同組織器官中表達量存在差異，構成HKT 功能特性（對Na+的親和力、對K+的敏感性、運輸方向等），引起植物中Na+轉移和組織累積不同，最終導致植物不同的鹽敏感性。例如，鹽脅迫下，水稻OsHKT1；1、OsHKT1；4和OsHKT1；5可降低葉片Na+含量，增強植物耐鹽性，而OsHKT1；5主要在根中表達，OsHKT1；4主要在葉鞘和穗中表達，OsHKT1；1主要在葉中表達［17-21］。一粒小麥（Triticum monococcum）基因TmHKT1；4在根和葉鞘中行使功能，TmHKT1；5僅在根中發揮作用［23］；大麥HvHKT1；5功能缺失，降低了鹽脅迫下Na+從根部向地上部的轉運，導致植物體內K+/Na+提高，耐鹽性增強［24］。

長穗偃麥草（Elytrigia elongata）系禾本科小麥族偃麥草屬多年生根莖疏叢型草本植物，具有較強抗旱耐鹽性，是小麥的近緣物種，已成為小麥遺傳改良的野生基因庫［25］。先前的研究中，已從長穗偃麥草中發掘出一個耐鹽基因EeHKT1；4，該基因主要在長穗偃麥草根中表達且不受外界K+影響，而NaCl 能誘導EeHKT1；4基因上調表達，導致K+在長穗偃麥草根中流失，表明EeHKT1；4在維持長穗偃麥草K+、Na+穩態中起重要作用［26］。基于此，本研究通過農桿菌介導的遺傳轉化法，將長穗偃麥草EeHKT1；4轉化到擬南芥中，研究過表達EeHKT1；4擬南芥的抗旱耐鹽性，為長穗偃麥草抗逆分子機制的研究提供重要理論基礎，同時為通過基因編輯技術提高農作物耐鹽性研究提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料 長穗偃麥草（PI 531747）種子由美國國家植物種質資源庫（The U. S. National Plant Germplasm System，NPGS）提供；試驗所用擬南芥野生型（wild type，WT）為Columbia-0 型；植物材料均于2020年4 月9 日-2021 年5 月27 日置于25 ℃、光照16 h/黑暗8 h（白天/黑夜）的人工氣候室培養。

1.1.2主要試劑 瓊脂糖凝膠回收及質粒提取試劑盒購自天根生物公司，高保真Taq 酶、限制性內切酶XbaI和KnpI、克隆載體、反轉錄試劑盒、qPCR 試劑盒購于塔克拉（TaKaRa，日本）生物公司，植物表達載體pZh01 由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1植物表達載體構建 依據已獲得的長穗偃麥草EeHKT1；4基因序列設計酶切引物（表1），以長穗偃麥草根cDNA 為模板，使用高保真酶，按照94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環，72 ℃延伸7 min 的PCR 程序擴增EeHKT1；4基因。分別使用XbaI 和KnpI 酶切消化EeHKT1；4基因與植物表達載體pZh01，消化過的載體及基因片段純化回收后使用T4連接酶連接，重組植物表達載體轉化大腸桿菌DH5α。經測序比對，構建成功的植物表達載體，轉化農桿菌GV1301，用于后續遺傳轉化。

表1 本研究所用的引物序列及用途Table 1 The primer sequence and application used in this study

1.2.2擬南芥遺傳轉化及分子鑒定 將轉化有EeHKT1；4基因植物表達載體的農桿菌接種到添加了50 mg·L-1硫酸卡那霉素和50 mg·L-1利福平的LB 液體培養基中，28 ℃，200 r·min-1培養至OD600值0.8～1.0，參照李小冬等［27］描述的浸花法轉化擬南芥野生型，收集轉化后的擬南芥種子，記為T0代。T0代種子使用1%次氯酸溶液消毒后，使用無菌水洗滌7～8 次，平鋪至添加了50 mg·L-1潮霉素的MS 培養基中，4 ℃春化3～4 d，然后轉移至人工氣候室置于光下培養。2 周后將抗性綠色小苗轉移至土壤中培養，待成熟后提取抗性植株DNA，使用EeHKT1；4全長引物進行PCR 鑒定，同時提取轉基因擬南芥RNA 反轉錄成cDNA，使用qEeHKT1；4-F/R 定量引物檢測EeHKT1；4是否在擬南芥中表達。收集轉基因種子，成功轉化的擬南芥種子記為T1代，選擇T1代抗潮霉素性狀分離比為3∶1 的轉基因擬南芥繼續篩選至純合。T3代種子用于后續抗旱耐鹽試驗。

1.2.3NaCl 和甘露醇處理下植株表型分析 擬南芥WT 和轉基因T3代種子如1.2.2 所描述的方法脫菌后，均勻鋪在不添加潮霉素的MS 培養基平板中，平板水平放置于如1.1.1 所描述的條件下生長4 d，選擇已萌發的擬南芥，使用尖頭鑷子將WT 和轉基因擬南芥幼苗點種于添加有50、100 mmol·L-1NaCl 和75、150 mmol·L-1甘露醇的MS 培養基平皿（直徑9 cm）的同一直線上，將平皿垂直固定培養14 d，觀察根生長狀態并記錄根長，每個濃度重復5 皿；同時選取WT 與轉基因株系（L1、L2 和L5）各25 粒萌發后的種子置于上述培養基中，平板水平放置于上述相同培養條件下進行耐鹽和干旱處理試驗，生長20 d 后觀察其表型并統計存活率，每個濃度重復3 皿。

1.2.4轉基因擬南芥DAB 與NBT 染色 使用0.01 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）配制1 mg·mL-1二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液和0.5 mg·mL-1硝基氮藍四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）溶液；選擇不同脅迫處理生長20 d 后的轉基因擬南芥同一位置的葉片，分別置于添加有適量DAB 和NBT 溶液的10 mL 離心管中，真空滲透10 min，置于28 ℃恒溫培養箱中DAB 避光染色6 h，NBT 避光染色2 h。染色完畢后棄染色液，使用95%酒精煮沸脫色5 min，觀察并拍照。

1.2.5轉基因擬南芥抗逆相關基因的表達模式分析 提取不同干旱、鹽脅迫處理下生長20 d 的轉基因和野生型擬南芥RNA，按照TaKaRa 反轉錄試劑盒說明書的要求反轉錄成cDNA，作為qPCR 的模板，根據已報道的擬南芥AtSOS1、AtNHX1、AtP5CS1和AtRD29B基因序列設計定量引物（表1），以擬南芥AtACTIN基因作為內參基因，按照侯潔茹等［28］描述的qPCR 程序進行PCR，采用2-ΔΔct計算基因的相對表達量。

1.3 數據分析

表型統計、組織化學染色和qPCR 均進行3 次生物學重復；使用t-test 進行顯著性分析，不同的小寫字母代表P＜0.05；GraphPad Prism 5 和Adobe Illustrator CS5 軟件用于作圖。

2 結果與分析

2.1 EeHKT1；4 基因表達載體構建

先前的研究中，已成功從長穗偃麥草中獲得EeHKT1；4基因，該基因包含1722 bp 的開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼573 個氨基酸，且與其他植物HKT1 氨基酸序列同源性達65%以上。采用雙酶切的方法將EeHKT1；4基因構建至pZh01 植物表達載體（圖1A），經測序和酶切驗證，正確的植物表達載體命名為35S：：EeHKT1；4，同時轉化至農桿菌中。

2.2 EeHKT1；4 轉基因擬南芥鑒定

采用農桿菌介導的浸花法轉化擬南芥野生型，收集轉化后的種子經潮霉素抗性篩選，獲得抗性植株（圖1B）。提取抗性植株DNA 并使用EeHKT1；4基因全長引物進行PCR 檢測，獲得1722 bp 的條帶（圖1C），與預期結果一致；提取PCR 陽性植株RNA 反轉錄成cDNA，以擬南芥AtACTIN為內參基因，使用qEeHKT1；4-F/R 定量引物檢測，結果在L1、L2、L4 和L5 中檢測到PCR 條帶，而在WT 中并未檢測到PCR 條帶（圖1D），表明EeHKT1；4基因已成功整合到擬南芥基因組中并表達。

圖1 轉基因擬南芥植株的獲得與鑒定Fig.1 Obtaining and identification of transgenic Arabidopsis

2.3 NaCl 與甘露醇脅迫下EeHKT1；4 轉基因擬南芥主根的表型變化

將萌發后的轉基因擬南芥與WT 轉移至不同濃度NaCl 和甘露醇的MS 培養基中，垂直生長結果顯示，正常生長條件下，轉基因株系L1、L2 和L5 與WT 的根長均未有差異；在NaCl 和甘露醇各個濃度處理下，L1、L2 和L5株系與WT 主根的生長均受到抑制，且隨著處理濃度的增加抑制愈加顯著，但L1、L2 和L5 株系主根生長受抑制程度較WT 小，主根長度顯著高于WT（圖2）。

2.4 NaCl 與甘露醇脅迫下EeHKT1；4 轉基因擬南芥植株表型變化

將萌發后的轉基因擬南芥與WT 轉移至不同濃度NaCl 和甘露醇處理的MS 培養基中生長20 d，正常生長條件下WT 與轉基因株系的長勢一致并未表現出差異（圖3）。50 mmol·L-1NaCl 處理下，WT 部分植株表現葉片萎縮，而轉基因株系的生長與正常條件下的生長基本一致；100 mmol·L-1NaCl 處理下，WT 出現植株葉片萎縮和枯黃現象，而L1、L2 和L5 株系中僅有少量植株出現萎縮。75 mmol·L-1甘露醇處理下，WT 的部分植株表現出葉片萎縮，L1、L2 和L5 株系中僅有少量植株出現萎縮；150 mmol·L-1甘露醇處理下，WT 的大部分植株表現葉片萎縮且枯黃，L1、L2 和L5 株系中僅有少量植株出現萎縮和少量的枯黃。不同脅迫處理下植株存活率的統計顯示，正常生長條件下，WT 與各轉基因株系的植株存活率無差異，而在NaCl 和甘露醇處理下，WT 的植株存活率顯著低于同等處理條件下轉基因植株。

圖3 NaCl 與甘露醇處理下轉基因與野生型擬南芥表型分析Fig.3 Phenotype analysis of transgene and wild-type Arabidopsis under NaCl and mannitol treatment

2.5 NaCl 與甘露醇脅迫下EeHKT1；4 轉基因擬南芥組織化學染色

選取NaCl 與甘露醇脅迫下EeHKT1；4轉基因擬南芥株系和WT 相同生長位置的葉片分別進行NBT 和DAB 染色，結果顯示，NBT 染色中，正常生長條件下，WT 與轉基因各株系染色相對較淺，隨著NaCl 濃度的增加所有葉片呈藍色的程度逐漸加深，且同等脅迫處理下WT 被染色程度高于轉基因各個株系；同樣地，隨著甘露醇濃度的增加，葉片的染藍色程度逐漸加深，且同等脅迫處理下WT 被染色程度也高于轉基因各個株系。DAB 染色中，未脅迫處理的WT 與轉基因各個株系染色相對較淺，僅在葉片上出現棕色斑點，隨著NaCl 處理濃度的增加所有葉片呈紅褐色程度逐漸加深，且同等脅迫處理下WT 被染色程度高于轉基因各個株系；隨著甘露醇濃度的增加，葉片的染紅褐色程度也逐漸加深，且同等脅迫處理下WT 被染色程度高于轉基因各個株系（圖4）。

圖4 NaCl 與甘露醇處理下轉基因株系與野生型擬南芥的DAB 和NBT 染色Fig.4 DAB and NBT staining for the transgenic and wild-type plants under NaCl and mannitol treatment

2.6 擬南芥抗性相關基因的表達分析

提取不同濃度NaCl 和甘露醇脅迫處理下的擬南芥RNA 反轉錄成cDNA，檢測擬南芥抗逆基因的表達水平，在NaCl 處理下，AtNHX1基因上調表達且轉基因擬南芥植株中的表達量低于野生型（圖5）；除轉基因擬南芥株系L5 外，隨著NaCl 處理濃度的增加，WT 和轉基因株系的AtNHX1基因表達量未顯示出明顯差異。NaCI 處理同樣會誘導AtSOS1基因的表達，以正常生長條件下AtSOS1基因的表達量為對照，隨著NaCl 處理濃度的增加，AtSOS1基因在WT 和轉基因株系中均逐漸上調；在甘露醇處理下，AtRD29B和AtP5CS1基因均上調表達且隨著甘露醇處理濃度的增加上調幅度愈加明顯，且轉基因株系中的表達量高于同等脅迫處理下的WT。

圖5 NaCl 與甘露醇處理下擬南芥抗性相關基因的表達分析Fig.5 Expression analysis of Arabidopsis resistance-related genes under NaCl and mannitol treatments

3 討論

長穗偃麥草EeHKT1；4基因編碼573 個氨基酸，且與其他植物HKT1 氨基酸序列同源性達65%以上，其氨基酸序列上存在編碼P-loop A 區域的一段保守序列LFFTAVSAATVSSMSTV，含有絲氨酸殘基，是Na+特異選擇性位點，另外，EeHKT1；4表達豐度在外源KCl 處理下并未發生變化，但卻受到NaCl 誘導［28］，結果表明EeHKT1；4 屬于HKT1 家族。

非生物脅迫下植物通過調整組織細胞的數量和大小來應對不適的外界環境，如干旱和鹽脅迫處理下植物根系的生長受到抑制等［29-30］。正常生長條件下擬南芥WT 與轉基因株系的植物長勢一致并未表現出差異，NaCl 和甘露醇處理下WT 植株均表現出葉片萎縮、植株枯黃和根系生長受到抑制的現象，而轉基因株系僅有少量植株出現葉片萎縮；根系的抑制程度顯著低于同等脅迫條件下的WT。NaCl 和甘露醇處理下，植株存活率和主根長度統計結果顯示，正常生長條件下，WT 與轉基因擬南芥株系的植株存活率及主根長度無顯著差異，而在NaCl 和甘露醇處理下WT 的植株存活率及主根長度均顯著低于同等條件下的轉基因植株。以上結果表明，EeHKT1；4異源過表達增強了擬南芥抗旱性和耐鹽性。

非生物脅迫下植物體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量產生，少量的ROS 可觸發適應性反應中的信號通路，而高濃度的ROS 會對DNA、蛋白質和膜脂等大分子造成損傷［31］。因此，ROS 含量可作為生物體氧化脅迫的信號［32］。NBT 能與超氧陰離子反應生成不溶于水的藍色甲臜顆粒［33］，沉淀在葉片表面；藍色越淺，表明該植株的抗氧化能力越強。正常生長條件下，擬南芥WT 與轉基因各個株系的染色相對較淺，隨著NaCl 濃度的增加所有葉片呈藍色的程度逐漸加深，且同等脅迫處理下WT 被染色程度高于轉基因各株系；隨著甘露醇濃度的增加，葉片的染藍色程度逐漸加深，且同等脅迫下WT 被染色程度高于轉基因各個株系，表明轉基因株系能更好地清除超氧陰離子，提高植物的抗旱性和耐鹽性。DAB 可以與H2O2反應生成黃褐色不溶性沉淀，聚集在葉片表面，色澤越深，表明H2O2含量越高［34］。未脅迫處理的擬南芥WT 與轉基因各個株系的染色相對較淺，僅在葉片上出現棕色斑點，隨著NaCl 處理濃度的增加所有葉片呈紅褐色的程度逐漸加深，且同等脅迫處理下WT 被染色程度高于轉基因各個株系；同樣地，隨著甘露醇處理濃度的增加，葉片的染紅褐色程度也逐漸加深，且同等脅迫下WT 被染色程度高于轉基因各個株系。

在鹽脅迫條件下，AtNHX1會將胞質中過量的Na+轉移至液泡中，維持細胞滲透壓并降低Na+的毒性［35］，以增強植物耐鹽性。植物應對過量Na+的主要方式是鹽過度敏感（SOS）途徑，SOS1通過實現細胞Na+外排提高植物耐鹽性。本研究中，NaCl 處理下，AtNHX1基因上調表達且轉基因株系的表達量低于野生型，除轉基因株系L5外，轉基因各個株系在50、100 mmol·L-1NaCl 處理條件下AtNHX1基因表達量無差異，該結果與WT 表現一致；NaCl 處理同樣會誘導AtSOS1基因的表達，隨著NaCl 濃度的增加，AtSOS1基因在WT 和轉基因植株中均逐漸上調。植物干旱脅迫下會產生大量的脫落酸（abscisic acid，ABA）和脯氨酸，ABA 將作為信號分子促進氣孔關閉，促進根對水分和離子的吸收；脯氨酸能調節細胞滲透壓保護質膜免受破壞［36］。擬南芥AtRD29B和AtP5CS1分別是ABA 和脯氨酸合成基因，在甘露醇處理下，AtRD29B和AtP5CS1基因均呈上調表達且轉基因植株中的表達量高于野生型，表明EeHKT1；4異源過表達上調了干旱和鹽脅迫下擬南芥抗逆基因的表達，降低了植株中ROS的含量，增強了植物抗旱性。

4 結論

本研究將長穗偃麥草EeHKT1；4基因在擬南芥中異源過表達，干旱和鹽脅迫下擬南芥表型特征、組織化學染色與擬南芥相關抗逆基因表達模式的分析，表明EeHKT1；4在植物響應干旱和鹽脅迫中起重要作用。長穗偃麥草EeHKT1；4直接或間接影響不同的植物組織器官中Na+/K+，進而影響抗逆基因的表達和ROS 在細胞中的積累以增強其抗旱耐鹽性。