高寒草地耐低溫植物根際促生菌的篩選鑒定及特性研究

劉曉婷，姚拓

（甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅蘭州 730070）

紅原縣位于我國青藏高原的東部邊緣，近年來由于人類活動和氣候變化的不斷影響，退化草地的面積不斷增加［1］。退化后植被生產力、生物多樣性和土壤因子相互作用，使生態環境持續惡化，嚴重制約了農牧業和環境的可持續發展［2］。近年來許多科研工作者對高寒退化草地的改良和修復進行了大量研究，從農牧業可持續發展及生態環境保護等多方面綜合考慮，微生物肥料在高寒草地生態修復中具有良好的應用潛力［3］。而植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是微生物肥料的主要功能成分，能夠固氮，溶磷，分泌吲哚-3-乙酸（indoleacetic-3-acid，IAA）、赤霉素（gibberellin，GA3）、玉米素（trans-zeatin，t-Z）等直接促進植物生長［4-5］。此外，PGPR 等生防菌定殖在植物根際，在抑制或減少植物病原菌的同時促進植物生長并增加作物產量［6］。PGPR 還可以誘導植物抗逆性，從而減少病害對植物生長發育的不利影響［7］。因此，植物根際促生菌資源的篩選成為人們研究的熱點。

PGPR 作為一種天然的根際細菌［8］，其來源廣泛。研究發現PGPR 的生長受到土壤環境變化的影響，不同生境中的菌株其促生效果和菌株的適應性存在差異［9］。Mishra 等［10］從喜馬拉雅山西北部高海拔地區植物根際分離出一株能在4 ℃下生長良好的耐低溫假單胞菌，其通過溶磷、調節植物激素分泌促進小麥（Triticum aestivum）幼苗生長。除此之外，PGPR 在生態環境修復方面也表現出巨大的潛力，接種PGPR 可以增強植物對鹽堿、干旱等脅迫的耐受性，例如，在鹽脅迫下接種耐鹽促生菌通過改善葉面養分吸收和增強抗氧化機制使植物鹽毒性降低，提高作物產量［11］。Xu 等［12］發現在干旱條件下接種耐旱PGPR 可以增強蘋果（Malus pumila）幼苗葉片抗氧化酶活性，減少細胞膜過氧化損傷，提高植株的抗旱性能。目前已開展了大量的關于農田、草地等的促生菌資源篩選研究，但天然草地，尤其是青藏高原東部邊緣的川西北高寒草地，植被群落物種組成豐富，其耐低溫促生菌資源的篩選及將其應用于退化草地修復的研究鮮有報道。因此，挖掘適應高寒地區的耐低溫PGPR 用于開發新型微生物肥料以修復退化高寒草地已成為一項具有重要意義的工作。

本研究以生長在高寒、高海拔地區的毛稃羊茅（Festuca kirilowii）、洽草（Koeleria cristata）、紫穗鵝觀草（Roegneria purpurascens）3 種優良植物為研究對象，從植物根際分離篩選固氮、溶磷、分泌植物激素的菌株，并對其進行促生特性研究及分類鑒定，旨在篩選獲得兼有固氮、溶磷、分泌植物激素多種功能的耐低溫優良PGPR，以期為退化高寒草地生態系統的生態恢復和微生物肥料的研制應用提供理論依據和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 植物樣品采集

2020 年7 月，在四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣邛溪鎮（32°53′15″N，102°35′59″E，海拔3480 m），選擇生長旺盛且無病害的毛稃羊茅、洽草、紫穗鵝觀草植株，用鐵鍬沿著植物根部的生長方向取出植株，將植物根際盡量采集完整，裝入無菌自封袋中注明植物名稱和采集日期，于4 ℃冰盒保存，帶回實驗室盡快進行微生物分離和篩選。

1.2 培養基

無 氮 培 養 基（nitrogen free medium，NFM）［13］：CaCl2·2H2O 0.02 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.5 g，NaMoO4·2H2O 0.002 g，NaCl 0.1 g，KOH 4.5 g，蘋果酸5.0 g，生物素10 μg，0.5%溴百里酚藍5 mL，瓊脂20.0 g（半固體培養基2.0 g），蒸餾水1000 mL，pH 7.0。無機磷 培養基（national botanical research institute’s phosphate，NBRIP）［14］：葡 萄 糖10.0 g，Ca3（PO4）25.0 g，MgCl2·6H2O 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO40.1 g，瓊脂20.0 g（液體培養基不加），蒸餾水1000 mL，pH 6.8～7.0。有機磷培養基［15］：以相同質量的植酸鈣替代NBRIP 培養基中的磷酸鈣制成。LB 培養基（Luria-Bertani，LB）［13］：胰蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g（液體培養基不加），蒸餾水1000 mL，pH 7.0。King 氏培養基［13］：胰蛋白胨20.0 g，K2HPO41.15 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，丙三醇15 mL。

1.3 植物根際促生菌的分離純化

為了解PGPR 在植物根際的分布情況，本研究將植物根際劃分為3 個部分，即根表土壤（soil adhering to roots，RS）、根系表面（rhizoplan or surface of roots，RP）、根內（histoplan or interior of roots，HP）［16］。具體方法如下：在超凈工作臺中將植物根系上大部分土壤和根系表面的虛土抖落后，稱取1.0 g 根系放入9 mL 0.85%生理鹽水（已滅菌）中，200 r·min-1振蕩10 min 后靜置，上清液即為10-1根表土壤稀釋液；振蕩后的根系放入9 mL 0.85%生理鹽水（已滅菌）中，并加入2～3 粒無菌玻璃珠，1000 r·min-1離心2 min 后靜置，上清液即為10-1根系表面稀釋液；取出上述根系并用石蠟將兩端密封，先用2%的次氯酸鈉表面消毒30 s 后用無菌水沖洗干凈，再用75%酒精滅菌1 min 后無菌水沖洗3～5 次，剪去兩端石蠟，用無菌濾紙吸干表面水分，在已滅菌的研缽中研磨，用9 mL 0.85%生理鹽水（已滅菌）沖洗，1000 r·min-1離心5 min 后靜置，上清液即為10-1根內組織稀釋液。再按稀釋梯度法依次制備10-2、10-3、10-4、10-5梯度的根表土壤、根系表面和根內組織稀釋液備用［17］。

采用平板涂布法［17］將制備好的植物根際3 個區域的10-3、10-5稀釋液各50 μL 分別接種在NFM、NBRIP 無機磷和植酸鈣有機磷固體培養基上，每個濃度梯度重復涂布3 次，15 ℃培養箱培養5～7 d，挑取NFM 培養基中生長較快、形態各異的單菌落進行多次重復劃線至無雜菌長出，即為固氮菌株。用接種環挑取NBRIP 無機磷和植酸鈣有機磷培養基中菌落周圍出現溶磷圈的不同大小單菌落，并進行多次重復劃線直至菌株純化，即為溶磷菌株。將分離純化好的固氮菌和溶磷菌接種在LB 斜面培養基上，于4 ℃冰箱保存備用。

1.4 菌株促生特性測定

1.4.1固氮特性 采用乙炔還原法［18］測定菌株固氮酶活性。用接種環將1.3 中已分離出的固氮菌挑取一環接種于10 mL 半固體培養基中（血清瓶，規格30 mL），每個處理重復3 次，以不接菌培養基為對照處理，用棉球塞封口，15 ℃培養箱培養2 d。在超凈工作臺中將棉球塞換成橡膠塞，用無菌注射器抽出1 mL 氣體，然后注入1 mL C2H2氣體并用蠟質封口膜密封，15 ℃培養箱培養2 d；2 d 后用50 μL 微量進樣器從血清瓶中分別抽取50 μL 混合氣體快速注入氣象色譜儀（GC7890，美國）氣體進樣柱內，記錄并觀察C2H4的出峰時間及峰面積，計算菌株的固氮酶活性（nitrogenase activity，NA，nmol C2H4·h-1·mL-1）。

1.4.2溶磷特性 采用溶磷圈法定性測定，將1.3 中分離出的溶磷菌接種于NBRIP 無機磷培養基和植酸鈣有機磷培養基中，每個處理重復3 次，15 ℃培養箱培養7 d，測量各菌株的溶磷圈直徑（D）與菌落直徑（d），根據D/d 值的大小進行初步篩選。鉬藍比色法［17］定量測定：在無菌條件下，將初篩后的菌株接種于NBRIP 無機磷和植酸鈣有機磷液體培養基（已滅菌）中，每個處理重復3 次，以不接菌培養基為對照處理，15 ℃、180 r·min-1搖床中培養10 d 測定菌株溶磷量，用酸度計測定各菌株培養液的pH。準確吸取10 mL 各菌株培養液，4 ℃、10000 r·min-1離心15 min，吸取上清液1 mL 于50 mL 三角瓶中，同時每個三角瓶中加入0.5 mol·L-1NaHCO3溶液19 mL，180 r·min-1振蕩30 min 后吸取5 mL 于50 mL 容量瓶中，每個容量瓶中加入0.5 mol·L-1NaHCO3溶液5 mL，加少量蒸餾水搖勻，并加5 mL 鉬銻抗顯色液，搖勻充分反應后定容至50 mL。30 min 后在紫外可見分光光度計（TU-1901，北京）下測定波長700 nm 的吸光度值，通過制作的磷標準曲線計算各菌株的溶磷量（phosphate solubilization capacity，PSC）。

1.4.3分泌植物激素能力 采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatographic，HPLC）［19-20］測定27 株優良PGPR 菌株分泌植物激素的能力。將待測菌株接種于King 氏培養基（已滅菌）中，每個處理重復3 次，以不接菌培養基為對照，15 ℃、180 r·min-1搖床中培養7 d。樣品經乙酸乙酯萃取，真空離心濃縮儀（RVC 2-25，北京）濃縮至近干，以2 mL 甲醇溶解，經0.45 μm 有機系濾器過濾后注入棕色樣品瓶，保存于4 ℃冰箱待高效液相色譜分析。HPLC 色譜條件如下：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A 為甲醇，流動相B 為含0.2%（體積分數）的冰乙酸水溶液，柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL·min-1，檢測波長為254 nm，進樣量為10 μL。

1.5 菌株分子鑒定

選擇優良菌株，使用TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR，80 ℃熱變性15 min 后，低速離心，裂解后的上清液作為PCR 反應的模板。選擇細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行16S rRNA 序列的擴增。PCR 體系為：DNA 模板5 μL、2×Tap PCR Master Mix 25 μL、正反向引物各1 μL、ddH2O 18 μL。PCR 擴增條件為：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35 次；72 ℃延伸10 min。PCR 擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至蘭州天啟基因生物科技有限公司測序。將測序結果與EzBioCloud 數據庫中的序列進行對比，然后利用MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹，確定菌株的分類學地位。

1.6 數據分析

利用Excel 2010 軟件整理數據及制圖，采用SPSS 22.0 統計分析軟件對數據進行One-way ANOVA 分析，并應用Duncan’s 新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同植物根際菌株的分布情況

利用選擇性培養基從3 種植物根際初步分離出294 株細菌，其中固氮菌株120 株，溶解無機磷菌株64株，溶解有機磷菌株110 株。從洽草根際分離出的固氮、溶磷菌數量最多，紫穗鵝觀草次之，毛稃羊茅最少，分別占菌株總數量的45.9%、30.3%、23.8%。毛稃羊茅RP、RS、HP 菌株數量分別為33、29、8 株，洽草分別為62、55、18 株，紫穗鵝觀草分別為63、24、2 株，總體來看，3 種植物根際菌株數量分布都呈RP＞RS＞HP 的趨勢，表現出較強的根際效應（圖1）。

圖1 細菌菌株在植物根際的分布情況Fig. 1 The distribution of bacteria strains in rhizosphere of plant

2.2 菌株固氮酶活性

利用乙炔還原法對植物根際初步分離的120 株固氮菌進行固氮酶活性測定，有30 株的固氮酶活性良好，其中14 株分離自洽草，11 株分離自紫穗鵝觀草，剩余5 株分離自毛稃羊茅。各菌株固氮酶活性為124.61～311.04 nmol C2H4·h-1·mL-1，其中NCZ1 的固氮酶活性最高，分離自紫穗鵝觀草根內組織，NCM3 固氮酶活性最低。固氮酶活性高于180 nmol C2H4·h-1·mL-1的有6 株，分別為NCZ1、NAQ15、NAM6、NAM7、NAZ11、NAZ19，占固氮菌總數量的20%。30 株固氮菌中，15 株產堿，4 株為中性，11 株產酸（表1）。

表1 固氮菌株固氮酶活性Table 1 Nitrogenase activity of nitrogen-fixing strains（mean±SE）

2.3 菌株溶磷特性

2.3.1菌株溶解無機磷能力測定 根據溶磷圈大小對菌株進行定性分析發現，64 株溶解無機磷菌株中有24株的D/d 值大于1.5，這些菌株主要分離自洽草和毛稃羊茅根際，分離自紫穗鵝觀草根際的最少。溶磷菌株的無機磷溶磷量為249.85～558.07 μg·mL-1，各菌株培養液pH 為4.06～5.10，PAZ17 溶解無機磷能力最強，分離自紫穗鵝觀草根表土壤，PAM11 溶磷能力最弱。此外，PAQ4、PAQ7、PAZ17 的溶磷量均高于500 μg·mL-1，具有高效的無機磷溶解能力（表2）。

表2 溶磷菌株溶解無機磷能力Table 2 The capacity of dissolving inorganic phosphorus of phosphate-solubilizing strains

2.3.2菌株溶解有機磷能力測定 同樣對初步分離的110 株溶解有機磷菌株的溶磷能力進行定性分析，110株溶解有機磷菌株中有22 株D/d 值大于1.5，其中13 株分離自洽草根際，5 株分離自紫穗鵝觀草根際，4 株分離自毛稃羊茅根際。定量測定結果表明，溶解有機磷菌株溶磷量為52.25～158.77 μg·mL-1，各菌株培養液pH 為2.88～4.34，其中以MBM5 的溶磷量最大，分離自毛稃羊茅根系表面，MCZ1 的溶磷能力最弱。溶磷量高于100 μg·mL-1的有3 株，分別為MBM5、MBQ3、MAQ23（表3）。

表3 溶磷菌株溶解有機磷能力Table 3 The capacity of dissolving organic phosphorus of phosphate-solubilizing strains

2.4 菌株分泌植物激素能力

對27 株優良PGPR 菌株產植物激素的能力進行測定發現，3 種植物激素含量差別較大，總體來看GA3的含量高于IAA 和t-Z。27 株PGPR 菌株均能產生植物激素，其中14 株分離自洽草根際，8 株分離自紫穗鵝觀草根際，5株分離自毛稃羊茅根際，有48.15%的菌株可同時分泌3 種植物激素，有51.85%的菌株可同時分泌2 種植物激素。26 株具有分泌GA3的能力，分泌量為0.60～52.91 μg·mL-1，其中PAQ2 分泌GA3的能力最強，顯著高于其他菌株，分泌IAA 的有18 株，分泌量為0.11～1.53 μg·mL-1，23 株PGPR 可分泌t-Z，分泌量為0.11～0.31 μg·mL-1（表4）。

表4 PGPR 菌株分泌激素能力Table 4 The capacity of PGPR strains to secrete hormones（μg·mL-1）

2.5 優良PGPR 菌株的鑒定

通過16S rRNA 鑒定并與同源序列比對分析，對促生特性優良的14 株PGPR 菌株的分類地位進行確定，發現分 別 屬 于4 個 屬13 個 種，假 單 胞 菌 屬 有10 個 種，PAZ10、PAZ17、NAZ17、MAZ15、NAQ6、PBQ4、MAQ23、PAQ2、MAQ19、PBM6 及MBM11 為假單胞菌屬（Pseudomonas），其中MAZ15、MBM11 為同一種，NCZ1 為假節桿菌屬（Pseudarthrobacter），MAQ10 為不動桿菌屬（Acinetobacter），NAM6 為貪噬菌屬（Variovorax）（表5）。

表5 優良PGPR 菌株分子生物學鑒定Table 5 Molecular biology identification of excellent PGPR strains

3 討論

近20 年來，在微生物資源的研究工作中，作為綠色新型投入品和優先支持發展的微生物肥料被廣泛應用于生產［21］。PGPR 是一類具有促進植物生長功能，或具有抑制植物病原菌作用的自由生活在土壤或附生于植物根際的有益菌群。然而PGPR 菌株因其特定的生長環境，對土壤物理性質、栽培措施、植物種類等外部因素非常敏感，因此篩選更多適應特定氣候條件的優良PGPR 菌株就顯得尤為重要［22］。

低溫是限制川西北高寒地區植物生存的重要環境因子。低溫會影響自由基的消除進而損傷植物的細胞膜系統，而接種耐低溫PGPR 可以提高植株抗氧化酶活性，增強其對自由基的清除能力，從而增強植物對低溫環境的耐受性［23-24］。本研究針對紅原地區獨特的地理環境和氣候特征，以高寒草地優良植物洽草、紫穗鵝觀草、毛稃羊茅為研究對象分離獲得能在15 ℃條件下良好生長的促生菌，研究發現3 種植物根際分離純化的具有固氮、溶磷能力的菌株數量不同，而且根際不同部位PGPR 菌株種類分布也存在差異，PGPR 在數量上呈現“RP＞RS＞HP”的根際分布趨勢，其原因可能是微生物生長需要碳源，而植物根系在生長過程中組織脫落物和根系分泌物為微生物活動提供了生長和繁殖所需要的營養和能量［25］，因而表現出植物根際微生物數量高于根外土壤的現象，這與姚拓［26］、馬文文［27］、馬驄毓等［28］在植物根際分離篩選PGPR 時取得的研究結果相一致。

根據菌株能否在固氮、溶磷培養基上生長的篩選方式初步分離了294 株細菌，并測定了這些菌株的促生特性，最終獲得76 株PGPR 菌株，其中固氮菌株30 株，溶磷菌株46 株。研究發現該地區篩選的PGPR 菌株溶解無機磷能力較強，溶解有機磷能力較弱，而且PGPR 菌株溶磷圈大小與溶磷能力不完全呈正相關關系，究其原因可能是由于溶磷菌溶磷過程十分復雜，Patel 等［29］的相關研究表明微生物溶磷的主要機制是產生有機酸，但除產酸外，微生物還可以通過酶解、釋放H+等溶解土壤中難溶性磷酸鹽，因此，溶磷圈的大小并不能絕對地判斷菌株溶磷能力的強弱。與以往研究相比，本研究篩選出的有機磷各菌株培養液pH 較低，可能的原因是篩選有機磷菌株時所選擇的磷源不同，溶磷菌在溶磷培養基中能夠分泌酸性、中性、堿性磷酸酶，而培養基磷源種類不同對3 種磷酸酶活性有很大的影響，以植酸鈣為磷源時，堿性磷酸酶與中性磷酸酶活性很低，只有酸性磷酸酶活性穩定，因而各菌株培養液pH 較低［30］。氮是植物生存和生長的關鍵營養因素，尤其在高寒草地生態系統中發揮著極其重要的作用［31］。本研究經復篩只有25%的菌株固氮酶活性良好，固氮酶活性為124.61～311.04 nmol C2H4·h-1·mL-1，除個別外整體上高于高亞敏等［9］在天祝高寒草甸植物根際所篩選的固氮菌的固氮酶活性，其可能是分離固氮菌的植物種類不同及兩地所處的環境差異所造成的。研究表明固氮酶由鐵蛋白和鉬鐵蛋白組成，它受溫度、氧氣濃度和pH 等多種因素的影響［32-33］，因而固氮酶活性差異很大。除固氮、溶磷等促生特性外，PGPR 的另一個直接促進植物生長的功能為分泌植物激素，本研究發現測定的27 株PGPR 均能產生植物激素，但3 種植物激素含量差別很大，GA3含量較高而IAA 和t-Z 含量甚微。Tomoaki 等［34］研究表明PGPR 代謝產物中的激素類物質能精確地與植物細胞中的特定蛋白質受體相結合，即使微量也能發揮重要的促生作用。

假單胞菌屬和芽孢桿菌屬（Bacillus）是土壤-植物生長體系中發揮重要作用的兩大類土壤細菌［35］，本研究分離的PGPR 多數屬于假單胞菌屬，這可能與宿主植物自身的生長環境密切相關，也可能與篩選PGPR 的溫度有關。本研究中，一株高效的植物根際促生菌NCZ1 經分子生物學鑒定為P. psychrotolerans，在低溫條件下表現出優良的促生特性。據報道該菌株是一株僅在南極土壤中分離到的新的耐寒細菌，可以耐受4 ℃的低溫條件。研究表明生長于低溫等逆境下的微生物，在長期適應生存的過程中，形成了獨特的生理生化機制以抵抗外界環境變化［36］，因此具有很強的抗逆性，在高寒草甸生態修復方面發揮良好的應用潛力，后期將進行進一步研究。

4 結論

從紅原高寒地區3 種優良植物根際分離的PGPR 數量分布上呈“RP＞RS＞HP”的根際分布趨勢；共分離得到76 株PGPR 菌株，固氮菌30 株，溶磷菌46 株，分泌GA3菌株26 株，分泌IAA 菌株18 株，分泌t-Z 菌株23 株，分泌t-Z 含量均小于0.31 μg·mL-1；篩選出有較強固氮、溶磷、分泌植物激素能力，且在低溫下生長良好的菌株14 株，經鑒定分別屬于假單胞菌屬、不動桿菌屬、假節桿菌屬、貪噬菌屬，其中，PAZ17、NAZ17、NCZ1、PAQ2 最具有作為微生物肥料在高寒植被恢復方面應用的潛力。