乳酸菌及丙酸鈣對全株玉米和燕麥青貯飼料發酵品質和霉菌毒素含量的影響

田吉鵬，劉蓓一，顧洪如，丁成龍*，程云輝，玉柱

（1. 江蘇省農業科學院畜牧研究所，江蘇 南京 210014；2. 農業農村部種養結合重點實驗室，江蘇 南京 210014；3. 中國農業大學草業科學與技術學院，北京 100193）

玉米（Zea mays）和燕麥（Avena sativa）均為一年生禾本科植物，產量和營養價值高，抗性強，是我國反芻動物主要的粗飼料來源［1］。在我國，全株玉米主要以制作全株玉米青貯飼料為主。而燕麥主要通過田間晾曬制作干草，但是在多雨季節仍可能會受到雨水影響而腐爛發霉，因此通過調制青貯亦是有效保存燕麥營養成分的重要技術。

全株玉米具有豐富的可溶性碳水化合物和較低的緩沖能值，不需要添加劑也能發酵良好。但是有氧暴露后酵母菌和霉菌等快速繁殖容易造成有氧腐敗從而導致飼料安全問題如霉菌和霉菌毒素污染［2］。燕麥因含水量及緩沖能值較高而且可溶性碳水化合物含量較低等問題，單獨青貯成功率較低，為此需要添加添加劑及適當的萎蔫［3］處理才能保證青貯成功。添加合適的添加劑能夠有效改善青貯飼料的發酵品質、抑制有害微生物生長與增殖、保存營養物質、降低青貯飼料中霉菌毒素含量。目前常用的添加劑主要有復合乳酸菌添加劑以及有機酸鹽等［4］。復合乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）添加劑能夠有效提高青貯飼料發酵品質和有氧穩定性［5］。丙酸鹽能夠提高青貯飼料的丙酸含量，抑制丁酸梭菌、霉菌和酵母菌等有害微生物生長，從而提高青貯飼料的發酵品質和有氧穩定性［6］。目前全株玉米青貯多集中于鐮刀彎地區，而燕麥多在青海、西藏、內蒙古、東北等地區［7］。相對而言我國長江淮河流域全株玉米和燕麥青貯對于抑制有氧腐敗問題和霉菌毒素污染的需求更為迫切，但相關乳酸菌和丙酸鈣的復合添加劑研發較少。目前本課題組自主研發的乳酸菌復合添加劑能夠有效提高稻秸（Oryza sativa）和大麥（Hordeum vulgare）等青貯飼料的發酵品質［8-9］，但是在燕麥和玉米青貯飼料中尚未驗證過。鑒于全株玉米和燕麥在我國反芻動物粗飼料的占比較大，因此有必要研究復合乳酸菌添加劑及丙酸鹽對本地全株玉米和燕麥青貯飼料的發酵效果。本研究通過乳酸菌制劑及丙酸鹽在全株玉米和燕麥青貯飼料中復合利用，分析添加劑對兩種青貯飼料發酵品質、微生物數量、營養品質、有氧穩定性和霉菌毒素含量的影響，探討適合本地全株玉米和燕麥青貯飼料的添加劑組合，為全株玉米燕麥青貯飼料加工和利用提供科學依據和技術依托。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

全株玉米來源于江蘇省農業科學院六合實驗基地，2019 年9 月蠟熟期收獲，留茬高度5 cm，收獲后立即粉碎成2～3 cm 的小段。燕麥來自鹽城大豐鼎旺飼料有限公司，2019 年6 月乳熟期收割后作為試驗材料，留茬高度5 cm，收獲后粉碎成2～3 cm 小段然后置于陰涼處萎蔫4 h。復合乳酸菌由江蘇省農業科學院畜牧所自主研發，主要包括植物乳桿菌、布氏乳桿菌和副干酪乳桿菌菌種（各菌添加比例為2∶1∶1），總體添加量為5×105CFU·g-1。采用試劑級丙酸鈣（calcium propionate，PACA,4075-81-4），購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗設計

利用雙因素完全隨機設計開展試驗，全株玉米和燕麥原料分別用蒸餾水（CK 組），復合乳酸菌（LAB 組），丙酸鈣（PACA），復合乳酸菌及丙酸鈣（LAB+PACA 組）進行處理，每個處理3 個重復。其中乳酸菌添加量為5×105CFU·g-1鮮樣，丙酸鈣添加量為鮮樣的0.4%。

將全株玉米用汽油粉碎機（CX20，日照洋工園林機械有限公司）均勻切割為2～3 cm 的小段并混合均勻，燕麥采用飼料公司的大型收割粉碎一體機（JAGUAR900，德國克拉斯農機公司）直接進行粉碎后取樣。將乳酸菌制劑加入6 mL 滅菌脫脂奶粉溶液中室溫活化2 h，加入適量水（60 mL）溶解均勻噴灑進青貯料中。稱取12 g 丙酸鈣溶于60 mL 蒸餾水中。每個處理3 個重復，每個重復3.0 kg，分別均勻噴灑60 mL 的乳酸菌菌懸液或者丙酸鈣渾濁液，CK 組加入等量60 mL 蒸餾水，然后裝入大號青貯袋中抽真空密封。全部處理完成后放入儲藏室中遮光儲存120 d。開封后將3.0 kg 青貯料利用五分法取約500 g 用于發酵、微生物和營養品質的測定，剩下2.5 kg 裝入5 L 塑料桶中用于有氧穩定性的測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1發酵品質測定 開封后取混合均勻后的青貯料20 g，加入180 mL 水后放入4 ℃冰箱中浸提24 h，然后用4 層紗布和定性濾紙過濾，得到浸提液保存于-20 ℃冰箱中，用于后期pH 值、氨態氮和有機酸含量的測定。采用玻璃電極pH 計（FE20，瑞士梅特勒-托利多集團）測量pH 值。參考許慶方等［10］的方法采用高效液相色譜儀（1260，美國安捷倫科技有限公司）測定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量。色譜條件如下：色譜柱：Shodex RSpak KC-811S-DVB gel C（8.0 mm×30 cm，日本島津公司），進樣體積5 μL，流動相為3 mmol·L-1HClO4，流速為1 mL·min-1，柱溫為60 ℃，檢測波長為210 nm，運行時間20 min。采用苯酚-次氯酸鈉法測定氨態氮含量［11］，最后計算氨態氮占總氮的比值。

1.3.2微生物數量測定 另取混合均勻的20 g 新鮮樣品加入180 mL 滅菌生理鹽水，振蕩混勻30 min 后用于乳酸菌、酵母菌和霉菌的測定。提取液在超凈工作臺中進行梯度稀釋后用MRS 培養基（北京路橋）37 ℃恒溫培養48 h 后進行乳酸菌的計數，用孟加拉紅培養基28 ℃恒溫培養3～7 d 進行霉菌和酵母菌的計數。

1.3.3營養品質測定 取300 g 樣品放在105 ℃烘箱中殺青15 min，然后65 ℃烘干約48 h 至恒重，稱重計算干物質含量（dry matter，DM），烘干后樣品粉碎過1 mm 篩用于營養價值的檢測。采用凱氏定氮法檢測總氮（total nitrogen，TN）含量［12］，以TN×6.25 進行計算粗蛋白含量，采用范氏法［12-13］測定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量（Ankom200i 纖維檢測儀，美國Ankom 科技有限公司），采用蒽酮比色法測定可溶性碳水化合物含量［14］，采用高氯酸-蒽酮比色法測定淀粉含量［15］。

1.3.4有氧穩定性測定 取2.5 kg 青貯料松散放入5 L 青貯桶中，在青貯料中心部位安裝溫度記錄儀（MDL-1048A，中國上海天河自動化儀表有限公司）溫度傳感探頭，然后用紗布覆蓋桶口后在室溫條件下進行有氧穩定性的測定。每小時記錄各個青貯桶中的溫度1 次，將每次青貯桶中溫度值與室溫值相減制作溫差Δt的動態變化圖（圖1），以Δt超過2 ℃的時間記為該重復的有氧穩定性時間（h）。

圖1 玉米和燕麥青貯飼料有氧暴露期間溫度差Δt（樣品溫度-室溫）變化Fig. 1 Curve of Δt（temperature difference between sample temperature and room temperature）during aerobic exposure of corn and oat silages

1.3.5霉菌毒素測定 青貯飼料開封后每個重復立即取兩份各50 g 鮮樣在-20 ℃條件下進行單獨保存，并盡快用于霉菌毒素的檢測。采用ELISA 檢測試劑盒（北京中檢維康生物技術有限公司）檢測黃曲霉毒素B1 含量，采用ELISA 檢測試劑盒（北京華安麥科生物技術有限公司）檢測玉米赤霉烯酮含量，在酶標板微孔條上預包抗原，樣本中相應毒素和此抗原競爭抗體，酶標二抗催化TMB 底物顯色，樣本吸光值與其含有的相應毒素呈負相關，與標準曲線比較得出樣品中對應霉菌毒素的含量，具體方法見試劑盒說明書。

1.4 數據分析

采用Excel 2016 對數據進行整理、初步分析和圖表制作，用SPSS 20.0 數據處理系統進行進一步統計分析。利用一般線性模型對原料（material，M）、添加劑（additive，A）以及交互效應（M×A）進行方差分析。方差分析顯著（P＜0.05）進一步進行多重比較，采用Tukey 法進行多重比較。各處理以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 添加劑對玉米和燕麥青貯飼料發酵品質的影響

添加劑對兩種原料青貯后的飼料品質所測定指標均有顯著影響（表1），且不同原料、添加劑與青貯原料之間存在顯著的交互效應（P＜0.01）。就燕麥青貯結果而言，CK 組的pH 值達到4.73。LAB、PACA、LAB+PACA能夠顯著降低燕麥青貯飼料的pH 值（P＜0.05）。而對于玉米青貯飼料來說，添加劑對pH 無顯著降低效果，且PACA 能夠顯著提高玉米青貯飼料的pH 值（P＜0.05）。PACA 和LAB+PACA 處理組在玉米和燕麥青貯飼料中都能夠顯著提高青貯飼料的乳酸含量（P＜0.05），而LAB 處理組僅在燕麥青貯飼料中具有顯著提高效果（P＜0.05）。PACA 和LAB+PACA 顯著提高了燕麥青貯飼料的乙酸含量（P＜0.05）。只有PACA 和LAB+PACA處理組能夠增加兩種青貯飼料的丙酸含量（P＜0.05），LAB 處理組和CK 組差別不大且含量極少。檢出的丁酸主要存在于燕麥青貯飼料當中，LAB 組能夠降低燕麥青貯飼料中的丁酸含量，PACA 和LAB+PACA 處理組丁酸的檢出量為0。玉米青貯飼料中未檢出丁酸含量，且氨態氮含量低于10%，LAB 和LAB+PACA 處理組僅從數值上相對于CK 組較小。燕麥青貯飼料中氨態氮含量較高，CK 組達到21.38%。添加劑的使用顯著降低了燕麥青貯飼料的氨態氮含量（P＜0.05）。

表1 添加劑對玉米和燕麥青貯飼料發酵品質的影響Table 1 Effects of additives on fermentation quality of corn and oat silages

2.2 添加劑對玉米和燕麥青貯飼料微生物數量的影響

添加劑和原料對2 種青貯飼料的微生物數量（表2）均具有顯著影響（P＜0.01），且添加劑和原料在乳酸菌（P＜0.01）、酵母菌（P＜0.05）和霉菌（P＜0.01）數量上均存在顯著的互作效應。在玉米青貯飼料中LAB+PACA 處理組顯著降低了乳酸菌、酵母菌和霉菌的數量（P＜0.05），PACA 處理組對于霉菌數量也有顯著的降低效果（P＜0.05）。在燕麥青貯飼料中各處理組乳酸菌和霉菌數量相差不大。燕麥青貯飼料中霉菌數量極少，只有對照組有一個重復檢出少量霉菌。添加劑的使用能夠顯著降低燕麥青貯飼料中酵母菌的數量（P＜0.05），其中LAB+PACA 處理組效果最好（P＜0.05）。

表2 添加劑對玉米和燕麥青貯飼料微生物數量的影響Table 2 Effects of additives on microbial counts of corn and oat silages（lg CFU·g-1）

2.3 添加劑對玉米和燕麥青貯化學成分的影響

燕麥青貯飼料的干物質、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、可溶性碳水化合物和淀粉含量與全株玉米均有顯著差異（P＜0.01），且從整體上看，添加劑的使用顯著影響了粗蛋白（P＜0.01）、中性洗滌纖維（P＜0.05）、可溶性碳水化合物和淀粉含量（P＜0.01）。添加劑和原料在干物質（P＜0.01）、粗蛋白（P＜0.05）和可溶性碳水化合物（P＜0.01）含量中存在顯著的交互效應。LAB+PACA 顯著降低了燕麥青貯飼料的干物質含量（P＜0.05）。PACA 和LAB+PACA 降低了玉米青貯飼料的粗蛋白含量并顯著提高了可溶性碳水化合物含量（P＜0.05），而對燕麥青貯飼料則無顯著影響（表3）。

表3 添加劑對玉米和燕麥青貯飼料化學成分的影響Table 3 Effects of additives on chemical composition of corn and oat silages

2.4 添加劑對玉米和燕麥青貯有氧穩定性和霉菌毒素的影響

玉米和燕麥青貯飼料在有氧穩定性、黃曲霉毒素B1 和玉米赤霉烯酮含量之間存在顯著差異（P＜0.01）。燕麥青貯飼料的有氧穩定性均超過168 h，而玉米青貯飼料有氧穩定性則均低于84 h。PACA 和LAB+PACA 顯著提高了玉米青貯飼料的有氧穩定性（P＜0.05），其中PACA 的效果最好，而LAB 則沒有提高玉米青貯飼料的有氧穩定性。添加劑的使用從總體上對霉菌毒素無顯著影響，LAB 和LAB+PACA 顯著降低了玉米青貯飼料的黃曲霉毒素B1 的含量（表4）。

表4 添加劑對玉米和燕麥青貯飼料有氧穩定性和青貯開封時霉菌毒素含量的影響Table 4 Effects of additives on aerobic stability of corn and oat silages and mycotoxin contents after silo opening

燕麥青貯飼料在168 h 的溫度監控過程中始終沒有超過室溫1 ℃（圖1）。而在玉米青貯飼料中，經過91 h 的有氧暴露，最終所有處理組Δt均高于2 ℃。其中CK、LAB 和LAB+PACA 組最高溫度超過室溫5 ℃。單從降低溫度差角度來看，在21 h 內LAB、PACA 和LAB+PACA 效果接近，51 h 之內PACA 和LAB+PACA 效果相近，超過51 h 后PACA 效果最好。

3 討論

3.1 添加劑對玉米和燕麥青貯飼料發酵品質的影響

青貯開封后所有玉米青貯飼料感官表現都很好，發酵品質也都表現優良，未檢出丁酸，這主要是由于收獲和青貯加工進行了嚴格的控制。青貯玉米收獲期控制在蠟熟期乳線達到1/2 左右的時候，干物質含量控制在32.21%～34.21%，正是全株玉米青貯發酵的最適條件［16］。本研究所用乳酸菌制劑為復合乳酸菌制劑，里面同時包含了同型發酵乳酸菌和異型發酵乳酸菌，能夠在降低青貯飼料pH 值的同時提高乙酸等有機酸含量并抑制霉菌等有害微生物［8］。但是異型發酵乳酸菌（布氏乳桿菌）在玉米青貯飼料中未能提高乙酸產量，這可能是由于青貯pH 值降得太低，嚴重抑制了布氏乳桿菌在發酵穩定階段的活性，使得復合乳酸菌制劑主要發揮了植物乳桿菌的效果，對乙酸含量無影響，這與Miao 等［17］的研究結果一致。玉米青貯飼料中缺乏丁酸菌，丁酸含量極少，本研究中丙酸含量的增加靠的是丙酸鈣的添加，這與盧冬亞等［6］的研究結果一致。

燕麥青貯飼料緩沖能值較高，需要大量的可溶性碳水化合物來快速降低pH 值，較慢的pH 值下降速度容易導致丁酸梭菌等有害微生物的繁殖，從而降低青貯飼料質量，因此燕麥青貯飼料通常需要萎蔫來抑制有害微生物［18-19］。本試驗中燕麥青貯飼料CK 組有難聞味道，雖然經過萎蔫使得干物質含量提高到38%左右，但是丁酸含量仍然嚴重超標。這與葛劍等［20］的研究結果相反，可能與燕麥品種、所在區域等不同有關。李平等［3］研究認為燕麥青貯飼料不宜長時間萎蔫。本研究中萎蔫后CK 組的丁酸含量仍然很高。但是通過乳酸菌的添加能夠有效抑制燕麥青貯飼料中的丁酸發酵，提高燕麥青貯飼料發酵質量。相關研究表明，植物乳桿菌等同型發酵乳酸菌能夠有效提高燕麥青貯飼料發酵品質并且降低丁酸含量［21］。而布氏乳桿菌對于燕麥青貯飼料的發酵品質和丁酸含量所起作用有限［22］。丙酸鈣以及丙酸鈣和乳酸菌的復合添加劑降低丁酸的效果更為明顯，主要是因為提高了燕麥青貯飼料中的丙酸含量，而丙酸的提高能夠降低青貯飼料中的丁酸含量［23］。

3.2 添加劑對玉米和燕麥青貯飼料微生物數量的影響

乳酸菌是可利用碳水化合物產生大量乳酸的一類革蘭氏陽性菌的總稱。在青貯飼料中的氧氣耗盡后，乳酸菌尤其是植物乳桿菌能夠產生乳酸快速降低青貯飼料的pH 值。當pH 值小于4.2 時有害微生物受到抑制，但是乳酸菌本身也會受到抑制，乳酸菌的數量也會減少［24］。玉米和燕麥青貯飼料中的乳酸菌數量均處于發酵穩定期。其中玉米青貯飼料的pH 普遍低于4.0，乳酸含量較多，使得玉米青貯飼料中乳酸菌受到抑制從而使得數量大大減少。而燕麥青貯飼料pH 普遍高于4.2，乳酸菌數量普遍較多。酵母菌和霉菌是導致玉米等青貯飼料有氧變質的主要原因［25］。在不同原料當中，酵母菌和霉菌的差異除了發酵品質以外，主要還有淀粉等非纖維性碳水化合物的含量。燕麥的淀粉含量僅有玉米青貯的1/3，其酵母菌和霉菌數量普遍較少。研究表明，復合乳酸菌制劑能夠有效降低青貯飼料中的酵母菌和霉菌數量［26］。同樣地，丙酸鹽對于青貯飼料中的霉菌和酵母菌也具有抑制作用。本試驗中，添加劑的使用或多或少都對酵母菌和霉菌數量有一定的抑制作用，其中效果最好的是乳酸菌與丙酸鈣的復合添加劑。

3.3 添加劑對玉米和燕麥青貯飼料化學成分的影響

本試驗中所用玉米青貯飼料營養品質優良。添加劑尤其是丙酸鈣或丙酸鈣和乳酸菌復合添加劑的使用顯著提高了青貯飼料的淀粉和可溶性碳水化合物含量，相應地降低了粗蛋白和纖維組分的含量。這進一步說明丙酸鈣等添加劑抑制了酵母菌和霉菌等的繁殖和對于淀粉、可溶性碳水化合物等能量物質的消耗，保留了更多的非纖維類營養物質。這與宗成等［27］的研究結果相一致。燕麥的粗蛋白含量豐富，許多時候超過10%［28］。但本試驗燕麥青貯過程中蛋白質發生降解產生了大量的氨態氮，使得燕麥青貯飼料的粗蛋白保持在8%左右。添加劑的使用能夠有效降低燕麥青貯飼料的氨態氮含量、提高粗蛋白含量，與張晴晴等［29］的研究結果相一致。

3.4 添加劑對玉米和燕麥青貯飼料有氧穩定性和霉菌毒素的影響

孫志強等［30］研究表明，添加植物乳桿菌和布氏乳桿菌的復合乳酸菌添加劑對全株玉米青貯飼料的發酵品質無顯著影響，但是能夠有效提高青貯飼料的有氧穩定性，且受青貯玉米品種的影響。本試驗中復合乳酸菌的使用沒有增加乙酸的含量，并且有氧穩定性相比于對照組僅增加了約6 h，且沒有統計學上的顯著關系。這可能是受乙酸含量不足的影響，也可能是受到品種和不同地區微生物菌群的影響。而乙酸、丙酸等有機酸對于玉米青貯飼料中的有害微生物具有顯著的抑制效果［31］，有助于提高玉米青貯飼料的有氧穩定性［4］。同型發酵乳酸菌和異型發酵乳酸菌復合使用對于提高玉米青貯飼料的有氧穩定性具有重要作用［32］，但是在一些特定條件下乳酸菌尤其是異型發酵乳酸菌的效果不穩定，添加適合的有機酸添加劑是十分必要的。而本試驗當中燕麥青貯飼料有氧穩定性好，全部超過168 h，這與賈婷婷等［33］的結果（CK 組大于168 h）相似，但是顯著高于朱九剛等［34］的研究結果（CK 組35.1 h）。玉米與燕麥青貯飼料中的黃曲霉毒素B1 和玉米赤霉烯酮含量均低于飼料衛生標準關于黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的限量標準［35］。玉米青貯飼料中的黃曲霉毒素含量較多，這主要是因為黃曲霉等產黃曲霉毒素的真菌更容易感染玉米［36］。乳酸菌添加劑的使用能夠有效降低玉米青貯飼料中的黃曲霉毒素B1 含量。這與付浩等［37］以及Guan 等［38］的研究結果相一致。

4 結論

玉米青貯飼料發酵品質優良。添加劑的使用尤其是PACA 和LAB+PACA 的使用提高了玉米青貯飼料的丙酸含量，顯著提高了玉米青貯飼料中的淀粉和可溶性糖等非纖維碳水化合物的含量及有氧穩定性，降低了霉菌和酵母菌等有害微生物數量。LAB 及LAB+PACA 有效降低了黃曲霉毒素B1 的含量。添加劑的使用顯著提高了燕麥青貯飼料的發酵品質，降低了氨態氮和丁酸含量，提高了粗蛋白含量，其中PACA 和LAB+PACA 效果較好。因此，添加劑尤其是LAB+PACA 的復合添加對于提高玉米和燕麥青貯飼料的青貯品質和安全性具有重要作用。