三色堇對NaCl 脅迫的生理響應

蘇世平，劉小娥，席杰

（甘肅農業大學林學院，甘肅 蘭州 730070）

土壤鹽漬化是全球面臨的環境問題，由于在農業生產中長期的灌溉行為，導致鹽分隨灌溉水進入土壤，另外由于不合理的灌溉，導致過多的水分滲入土壤深層，在土壤水分蒸發的過程中，將深層土壤中殘存的鹽分通過土壤毛管蒸發作用運移到土壤表層，加劇了土壤鹽漬化。有研究表明，全球現有鹽堿地10 億hm2［1-2］，并以每年100萬～150 萬hm2的速度增長，而我國是鹽堿化土地重災國，據報道，全國目前有鹽漬化土地面積為3600 萬hm2，占全球鹽堿地面積的3.6%，占全國可耕地面積的4.88%［2-3］。因此，隨著鹽堿化土地面積和鹽堿化程度的加劇，一方面將導致農業可耕土地面積的減少，另一方面，將使鹽堿地上生長的植物受到更強的鹽堿脅迫，影響植物的正常生命活動。NaCl 是土壤中最常見的中性鹽，對植物的脅迫主要以Na+和Cl-脅迫為主，Cl 是植物生長的營養元素之一，在植物體內主要以離子形態存在，參與光合作用光系統Ⅱ中水的光解放氧反應，還能提高細胞的滲透壓和植物組織的水合作用，具有一定的生理功能，但是植物對Cl-的需要量較少，當Cl-過多時會造成離子毒害，抑制植物生長［4-5］。而Na 元素不是植物生長所必需的元素，土壤中Na 元素的存在，會對植物造成離子傷害，是因為Na+會取代細胞膜上的Ca2+，導致細胞膜出現漏洞，細胞內原生質體外滲，進而引起離子種類和離子濃度發生改變，Na+脅迫也會造成葉綠體破壞，使植物光合作用速率下降［6-8］。植物在遭受鹽脅迫后細胞內滲透調節系統會過量表達，以此來增加細胞膨壓，維持細胞較高的水勢，增強其保水能力［9-12］，抗氧化酶系統被激活，以此來清除過氧化氫、超氧陰離子等活性氧（reactive oxygen species，ROS），保護細胞膜系統的完整性［13-14］，也有研究表明，植物在遭受鹽脅迫后，其代謝調節系統［脯氨酸（free proline，Pro）、可溶性糖（soluble sugar，SS）、可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量］會不同程度地升高，而抗氧化酶系統［超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）］活性在低鹽濃度下呈升高趨勢，隨著鹽濃度的增加逐漸降低，光合色素含量隨鹽濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，生物產量降低，如株高生長和根系生長受限［15］，葉片變小，出現壞死斑點等［16-17］。但是不同植物對NaCl 的耐受程度不同，響應機理不同。

三色堇（Viola tricolor）為堇菜科堇菜屬多年生草本，其喜在肥沃、排水良好、富含有機質、pH 為5.4～7.4 的中性壤土或黏壤土上生長，在園林綠化中常用作花壇、花池、花鏡以及模紋花壇擺放的材料，同時三色堇全株可藥用，具有清熱解毒、散瘀、止咳的功能［18］。也有研究表明，三色堇花朵富含花青素、黃酮和類胡蘿卜素，具有食用價值［19］，美國及有些國家已培育出食花用三色堇。因此，隨著三色堇利用價值的不斷拓寬，其栽培面積將不斷升高，三色堇的抗逆性研究將會越來越多地受到關注。目前在干旱脅迫［20］、鹽脅迫［21-22］、高溫脅迫［23-25］及重金屬脅迫［26］等方面做了相關研究，其中在NaCl 脅迫下的研究，有的集中在滲透調節物質（Pro、SS、SP）方面，有的集中在抗氧化酶系統（SOD、POD、CAT）方面，有的集中在生長表現方面，有的集中在膜脂過氧化（丙二醛malondialdehyde，MDA）方面，目前沒有對三色堇在NaCl 脅迫下的生理生化方面進行系統的研究，而植物的耐鹽能力不是某一個指標或某一類指標的表現，而是多因子綜合作用，調控植物的抗逆能力。因此本研究以食花用三色堇為對象，通過設置不同濃度的NaCl 進行脅迫，探索三色堇對NaCl 脅迫的響應機制以及其能耐受的最高土壤NaCl 含量，為鹽堿地三色堇的栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大花三色堇幼苗，種子購于藍翔園藝。

1.2 試驗方法

1.2.1材料培育 2021 年5 月，將泥炭土（丹麥生產）用蒸餾水浸泡48 h 后，倒掉水分，用蒸餾水反復沖洗3～5次，以此清除泥炭土中可溶性離子，之后用50%的可濕性多菌靈粉劑滅菌并密封5 d 后裝入營養缽（直徑×高度=10 cm×15 cm）待用。用蒸餾水將營養缽中基質澆透后每營養缽播種2 粒種子，等發芽長出2 片真葉后，每營養缽保留1 株幼苗，待幼苗長出5～6 片真葉（苗齡45 d 左右）時進行鹽脅迫處理。

1.2.2試驗處理 NaCl 設置6 個濃度處理，為0（CK，蒸餾水澆灌）、25、50、100、150、200 mmol·L-1，每濃度處理3 次重復，每重復30 株（缽），每隔2 d 處理一次。在處理時為避免鹽沖激效應［27］，對濃度高于25 mmol·L-1的處理，每隔1 d 用高一濃度的處理液進行澆灌，直至到達設定濃度后，每隔1 d 用目標濃度的處理液澆灌1 次，每次灌溉量為基質持水量的2 倍，確保有2/3 的處理溶液流出，以此將前期由于水分蒸發而殘留在土壤中的鹽分沖洗掉，以保證NaCl 濃度恒定（表1）。在全部處理達到目標濃度時定為鹽脅迫處理的第1 天。

表1 NaCl 濃度處理遞增表Table 1 Concentration increasing order of NaCl treatments

1.2.3取樣及測定 在處理達到預定濃度后的第7 和14 天，每重復隨機選擇10 株進行生長指標和生理指標測定。每重復選擇10 株三色堇植株，每株選擇大小一致的3 片葉片，共30 片，裝入液氮中，供生理指標測定用，每一指標測定時，用直徑為0.5 cm 的打孔器進行每葉片取樣，混合葉片作為樣品，采用酶標儀（spectra MAX 190，美國）進行測定。

采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量；采用磺基水楊酸提取法測定游離脯氨酸含量；采用考馬斯亮藍染色法測定可溶性蛋白含量；采用氮藍四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶活性；采用愈創木酚法測定過氧化物酶活性；采用紫外吸收法測定過氧化氫酶活性，采用分光光度法測定葉綠素（chlorophyll，Chl）含量，采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量［28-29］。

在處理第0 天測定莖基部到頂芽處的高度H0（cm），處理第7 和14 天測定莖基部至頂芽處的高度H7、H14（cm）。株高凈生長量Δi=Hi-H0，式中：Δi為處理后第i天的株高凈生長量，H0為處理第0 天的株高，Hi為處理后第i天的株高，i=7 或14。

1.3 數據處理與分析

采用SPSS 17.0 軟件進行方差分析，采用Duncan 法檢驗各處理之間差異性，采用Microsoft Excel 2010 軟件進行作圖及隸屬函數分析。

如果該指標與抗鹽能力呈正相關，計算公式為（1），如該指標與抗鹽能力呈負相關，計算公式為（2），式中：i=1，2，3，…，n，Xi為指標測定值，Xmax和Xmin為該指標測定的最大值和最小值。隸屬函數平均得分計算公式為（3），UA值高則表明耐鹽能力強，反之則低。

2 結果與分析

2.1 NaCl 脅迫對三色堇株高生長的影響

NaCl 處理三色堇植株后，在處理濃度≤50 mmol·L-1時，對株高凈生長量有明顯的促進作用，在14 d 時，25 mmol·L-1處理株高凈生長量最高，為1.06 cm，在100 mmol·L-1時，14 d 的株高凈生長量和CK 相等，為0.66 cm，當濃度＞100 mmol·L-1時對株高凈生長造成了抑制，并隨濃度的升高抑制作用加劇，在200 mmol·L-1時，株高凈生長量比對照降低了45.43%。說明NaCl 濃度＞100 mmol·L-1時對株高生長的抑制作用明顯（圖1）。

圖1 NaCl 處理下三色堇株高凈生長量Fig. 1 Net growth of plant height of V. tricolor under NaCl treatments

2.2 NaCl 處理對三色堇光合色素含量的影響

隨著NaCl 處理濃度的增加，光合色素含量在處理后第7 和14 天均呈先升高后降低的趨勢（圖2）。在處理的第14 天，NaCl 脅迫濃度為50 mmol·L-1時Chl含量比CK 增加了6.50%；在濃度為200 mmol·L-1時，比CK 降低了30.05%。隨著處理時間的延長，處理濃度≥50 mmol·L-1時，NaCl 處理第14 天的光合色素含量均低于第7 天。說明濃度≤50 mmol·L-1的NaCl 處理能明顯提高三色堇植株Chl 含量，大于此濃度，光合色素的降解速度加劇。

圖2 NaCl 處理下三色堇植株葉綠素含量Fig.2 Chlorophyll content of V. tricolor leaves under NaCl treatments

2.3 NaCl 脅迫對三色堇滲透調節物質的影響

隨NaCl 處理濃度的增加，SP 含量在處理的第7和14 天均呈先上升后降低的趨勢，在處理的第14 天，在脅迫濃度為50 mmol·L-1時，SP 含量最高，比CK 增加了96.75%；在脅迫濃度為200 mmol·L-1時比CK降低了14.65%（圖3）。隨著處理時間的延長，各濃度NaCl 處理第14 天SP 含量均低于第7 天，各濃度鹽脅迫處理后SP 含量均大于對照（除200 mmol·L-1處理第14 天），并隨著處理時間的延長，增加幅度呈降低趨勢。說明三色堇植株經NaCl 處理后，能顯著提高SP 含量。

隨著NaCl 處理濃度的增加，SS 和Pro 含量在處理的第7 天均呈持續升高趨勢，在第14 天呈先上升后降低的趨勢。SS 含量在處理的第14 天，脅迫濃度為50 mmol·L-1時最高，比CK 增加了427.65%，在濃度為200 mmol·L-1時比CK 增加了228.38%。除200 mmol·L-1處理外，隨著處理時間的延長，各濃度處理第14 天時SS 含量均高于第7 天，且均高于CK，并隨著處理濃度的升高，增加幅度呈降低趨勢（圖3）。說明三色堇植株經NaCl 處理后，能顯著提高SS 含量。

Pro 含量在處理的第14 天，脅迫濃度為150 mmol·L-1時最高，比CK 增加了121.08%；濃度為200 mmol·L-1時比CK 增加了28.46%。除25 mmol·L-1處理外，隨著處理時間的延長，處理第14 天時Pro 含量均低于第7 天（圖3）。在處理14 d 時，濃度≥150 mmol·L-1時，Pro 含量高于CK，說明在處理早期（7 d）NaCl 脅迫能明顯提高三色堇植株Pro 含量，在處理晚期（14 d），當濃度≥150 mmol·L-1時，能顯著提高Pro 含量。

圖3 NaCl 處理下三色堇植株可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量Fig. 3 Soluble protein，soluble sugar and free proline content of V. tricolor leaves under NaCl treatments

2.4 NaCl 處理對三色堇抗氧化酶系統活性的影響

隨著NaCl 處理濃度的增加，POD 活性在處理的第7 和14 天均呈先上升后降低的趨勢。在處理的第14 天，脅迫 濃 度 為50 mmol·L-1時，POD 活 性 最 高，比CK 增 加 了89.60%；在 濃 度 為200 mmol·L-1時，比CK 降 低 了8.33%（圖4）。隨著處理時間的延長，各濃度NaCl 處理第14 天的POD 活性均高于第7 天。濃度≤150 mmol·L-1處理三色堇植株能顯著提高POD 活性。

隨著NaCl 處理濃度的增加，SOD 活性在處理的第7 和14 天均呈先上升后降低的趨勢。在處理的第14 天，在脅 迫 濃 度 為50 mmol·L-1時，SOD 活性 最 高，比CK 增 加了52.41%；在濃 度 為200 mmol·L-1時，比CK 降 低 了11.91%（圖4）。隨著處理時間的延長，各濃度NaCl 處理第14 天SOD 活性均低于第7 天。濃度≤150 mmol·L-1NaCl 處理三色堇植株能顯著提高SOD 活性。

圖4 NaCl 處理下三色堇植株過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性Fig. 4 Peroxidase， superoxide dismutase and catalase activity of V. tricolor leaves under NaCl treatments

隨著NaCl 處理濃度的增加，CAT 活性在處理的第7 和14 天均呈先上升后降低的趨勢。在處理的第14 天，NaCl 脅 迫 濃 度 為100 mmol·L-1時，CAT 活 性最高，比CK 增加了319.39%；在濃度為200 mmol·L-1時，比CK 降低了17.97%（圖4）。隨著處理時間的延 長，≤100 mmol·L-1處 理 的 第14 天 時CAT 活 性 均高于第7 天。濃度≤150 mmol·L-1處理三色堇植株能顯著提高CAT 活性。

2.5 NaCl 處理對三色堇MDA 含量的影響

隨著NaCl 處理濃度的增加，MDA 含量在處理后第7 和14 天均呈升高的趨勢。在處理的第14 天，NaCl 的脅迫濃度為200 mmol·L-1時最高，比CK 增加了101.97%（圖5），說明隨著NaCl 濃度的升高，膜脂過氧化和細胞膜受損程度加劇。

圖5 NaCl 處理下三色堇植株MDA 含量Fig.5 MDA content of V. tricolor leaves under NaCl treatments

2.6 NaCl 處理對三色堇植株脅迫的綜合評價

植物的耐鹽能力不是某一個因子的單獨作用，而是與耐鹽能力密切相關的眾多因子的綜合作用，因此為了準確評價NaCl 處理后三色堇耐鹽能力和最高耐鹽濃度，對所測定參數進行隸屬函數分析（表2），結果表明，三色堇植株經≤150 mmol·L-1的NaCl 處理后隸屬函數平均得分均高于CK 第0 天（0.318），說明濃度≤150 mmol·L-1的處理可通過提高SS、SP、Pro 含量，激活CAT、POD、SOD 活性，減緩Chl 的降解進程，而NaCl 濃度在200 mmol·L-1時，得分低于CK 第0 天，說明代謝調節物質的積累和抗氧化酶活性受到嚴重影響，Chl 降解加劇，光合系統遭到嚴重破壞，嚴重抑制了三色堇的生長。

表2 NaCl 處理下各指標的隸屬函數得分Table 2 Membership function score of V.tricolor under NaCl treatment

NaCl 處理隸屬函數綜合得分排序為：50 mmol·L-1＞25 mmol·L-1＞100 mmol·L-1＞150 mmol·L-1＞CK＞200 mmol·L-1。從綜合排序結果看，三色堇植株對NaCl 的最高耐受濃度為150 mmol·L-1。

3 討論

NaCl 是土壤中最常見的中性鹽，由于在農業生產中長期的灌溉行為，導致土壤中鹽分積累。土壤中的鹽分一部分是通過灌溉水引入，另一部分是通過土壤水分蒸發，將土壤深層鹽分運移到表層［30］，土壤中鹽分的增加影響植物的正常生長，嚴重時會使植物代謝失調，甚至死亡。本研究發現，土壤中存在一定濃度的NaCl 有利于三色堇的生長，但是當土壤中NaCl 濃度過高時，對三色堇生長會起到不良的影響。

植物在逆境脅迫下，通過主動積累SS、SP、Pro 等滲透調節物質來維持細胞滲透勢，避免鹽分過多地進入細胞，從而降低逆境的危害程度，其累積量與抗逆性呈正相關［31］。本研究發現，三色堇在NaCl 脅迫下，SS、SP、Pro積累量顯著高于對照，說明三色堇在NaCl 脅迫下，通過提高細胞內的滲透調節物質的含量來提高細胞的滲透壓，進而維持細胞的吸水和保水能力，減緩NaCl 脅迫對細胞的傷害，這與Al-Farsi 等［32］的研究結果一致。

植物在逆境脅迫下，通過提高抗氧化酶的活性來清除過氧化氫、超氧陰離子等ROS［13，33］，以減緩ROS 對細胞的傷害，其活性與植物的抗逆性呈正相關。本研究發現，三色堇植株經NaCl 處理后，抗氧化酶系統SOD、POD、CAT 整體表現出先升高后降低趨勢，在處理14 d，在鹽濃度≤150 mmol·L-1時，SOD、POD、CAT 活性高于CK，當處理濃度＞150 mmol·L-1時，SOD、POD、CAT 活性均低于CK，說明鹽濃度＞150 mmol·L-1時，加劇了三色堇細胞膜脂過氧化程度。滲透調節物質含量和抗氧化酶活性，在處理14 d 時均表現出隨濃度的升高而降低的趨勢，這可能是當NaCl 濃度高于三色堇自身能調節的范圍時，導致代謝調節系統和抗氧化酶系統的紊亂，防御系統已不能維持較高水平，進而抑制了三色堇的生長和發育，這與梁曉艷等［3］的研究結果一致。

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，在鹽脅迫下，由于金屬離子的毒害作用，導致葉綠素降解［34］，其降低程度與植物所受離子脅迫程度呈正相關。本研究發現，在NaCl 脅迫下，50 mmol·L-1處理時Chl 含量最高，當濃度＞50 mmol·L-1時Chl 含量低于CK，說明超過此濃度，鹽脅迫引起了Chl 的降解，降低了光合作用速率，這與呂秀云等［35］的研究結果一致。

MDA 是細胞膜脂質過氧化的產物，其含量與植物的抗逆性呈負相關［36］，因此可以用MDA 含量評價植物的抗逆境能力。本研究發現，NaCl 脅迫后，MDA 含量在整個處理期均呈升高趨勢，說明隨著NaCl 濃度的升高，脅迫程度加劇，對質膜系統的傷害加大，這可能與脂質過氧化而引起的細胞膜受損導致電解質外滲有關。細胞膜是外界鹽離子進入植物細胞的第1 道屏障，在植物抗鹽生理中有重要作用［37］，當細胞組織受到離子脅迫時，三色堇體內自由基的大量產生引發脂質過氧化［38］，細胞膜的完整性和功能受到傷害，膜的穩定性降低，導致細胞內的原生質體和大分子物質通過損傷部位大量外溢［37-39］，進而影響三色堇的正常代謝，嚴重時會導致細胞死亡，這與李子英等［36］的研究結果一致。

生長量是植物的生理生化過程反饋于植物的外在表現，也是可以用肉眼直接觀測到的表型特征，能對植物在逆境脅迫下的抗逆能力進行直觀的觀測，植物在逆境環境下的生長量與抗逆能力呈正相關，生長好，則表明其抗逆能力強［36］。本研究發現，在鹽濃度≤50 mmol·L-1NaCl 處理下，株高凈生長量高于CK，說明低濃度鹽脅迫下，能促進三色堇植株的生長，當鹽濃度＞50 mmol·L-1時，隨著鹽濃度的升高，三色堇株高生長量明顯下降，說明鹽濃度＞50 mmol·L-1時，對三色堇植株的生長造成抑制，這與張麗平等［40］的研究結果一致。

植物的抗逆性是諸多生理生化因子綜合作用的結果，本研究采用隸屬函數法分析表明，三色堇植株最高耐受NaCl 的濃度為150 mmol·L-1，超過此濃度，其生長受限，可能是隨NaCl 濃度的升高，Na+和Cl-濃度同時升高而產生的雙重離子脅迫作用。有研究表明，Cl-是植物16 種必需營養元素之一，在植物體內主要以離子形態存在，它參與光合作用的光系統Ⅱ中水的光解放氧反應，還能提高細胞的滲透壓和植物組織的水合作用，具有一定的生理功能［4-5］，但是植物對Cl-的需要量較少，當Cl-過多時會造成離子毒害，抑制植物生長，因此低濃度的NaCl 處理，提供了三色堇生長所必需的Cl 元素，但Cl-濃度過高時則成為有害元素，抑制其生長。Na 元素不是植物生長所必需的元素，土壤中Na 元素的存在，會對植物造成離子傷害，且與濃度呈正相關。有研究表明，當土壤中Na+過高時，Na+將取代細胞膜上的Ca2+，導致細胞膜出現漏洞，細胞內原生質體外滲，進而引起離子種類和離子濃度發生改變造成葉綠體破壞，使植物光合速率下降［6］。也有研究表明，三色堇幼苗能耐受250 mmol·L-1以下的NaCl 脅迫，但當濃度高于250 mmol·L-1時，植株出現大量死亡［22］，本研究中也觀測到這種現象，在200 mmol·L-1NaCl 處理時，植株出現萎蔫、部分死亡現象。

4 結論

NaCl 處理三色堇植株后，對其抗氧化酶系統、滲透調節系統、光合色素、MDA 以及株高凈生長量產生了顯著影響。在處理后14 d，隨處理濃度升高，SS、SP、Pro、CAT、POD、SOD、Chl 均呈先升高后降低的趨勢，MDA 呈升高趨勢，株高生長量呈降低趨勢。隸屬函數分析表明，當土壤中NaCl 濃度≤150 mmol·L-1時對三色堇的生長無明顯抑制作用，當濃度＞150 mmol·L-1時，對其生長抑制作用明顯。三色堇耐NaCl 的最高濃度為150 mmol·L-1，超過此濃度，代謝調節物質的積累和抗氧化酶系統的活性受到嚴重影響，Chl 降解加劇，光合系統遭到嚴重破壞，三色堇的生長受到嚴重影響。