雷帕霉素對非酒精性脂肪性肝病大鼠的影響

譚麗萍 陳文慧 石安華 武俊紫 朱曉松 張 珊

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)徐宏喜專家工作站，云南昆明 650500；3.云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省高校中醫(yī)證候微觀辨證重點實驗室，云南昆明 650500

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率逐年上升，已成為21 世紀全球排名第一的慢性肝病，現(xiàn)全球患病率約25%，嚴重影響人類健康[1-2]。細胞自噬參與NAFLD 發(fā)生發(fā)展過程，其可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善肝細胞損傷和胰島素抵抗、減少氧化應(yīng)激等環(huán)節(jié)有效治療NAFLD[3-4]，自噬調(diào)節(jié)已成為治療NAFLD 的潛在靶點[5]。雷帕霉素可抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白而激活自噬，為自噬研究中最常用的藥物[6]。雷帕霉素在動脈粥樣硬化及機械通氣導(dǎo)致膈肌脂質(zhì)代謝異常中均有緩解局部病變的作用[7-8]，由此本研究希望通過雷帕霉素治療高糖高脂建立的NAFLD 大鼠模型，探討其治療NAFLD 的效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD 大鼠24 只，體重180～220 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002，動物合格證號：430047000 57203。本研究經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（R-06201926）。

1.2 主要儀器與試劑

CM 1860UV 冷凍切片機、RM235 石蠟切片機（德國LEICA 公司），Cobas C311 全自動生化儀（瑞士羅氏公司），DNM-9602 全自動酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司），DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器廠產(chǎn)品）。雷帕霉素購自美國Sigma 公司（批號：R0395）。自噬相關(guān)蛋白Beclin1 抗體（批號：ab207612）、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B（light chain 3B，LC3B）抗體（批號：ab48394）購自英國abcam 公司，泛素結(jié)合蛋白p62 抗體（批號：A11250）、自噬相關(guān)蛋白ATG5 抗體（批號：A0203）購自ABclonal 公司。

1.3 實驗動物模型建立、分組、給藥

隨機選取8 只大鼠作為正常組，普通飼料喂養(yǎng)。剩余16 只采用高糖高脂飼料（59.5%常規(guī)飼料、10.0%豬油、20.0%蔗糖、0.5%膽酸鈉、10.0%蛋黃粉）伴日常飲用5.0%紅糖水的飼養(yǎng)方法建立NAFLD 大鼠模型，持續(xù)造模6 周后，肝組織低倍鏡下可見脂肪變性肝細胞占肝小葉比例＞1/3，即出現(xiàn)NAFLD[9-10]，明確造模成功。將其按隨機數(shù)字表法分為模型組和雷帕霉素組，每組各8 只。雷帕霉素組用2.8 mg/（kg·d）雷帕霉素灌胃[11]，正常組與模型組用0.9%NaCl 溶液灌胃，灌胃液體容積為每只大鼠2 ml/d，持續(xù)給藥4 周。

1.4 生化指標(biāo)檢測

實驗結(jié)束后，大鼠麻醉后心臟取血，用羅氏全自動生化分析儀檢測三組血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。三組處死并解剖，取部分肝組織，制作肝勻漿，采用TC、TG 試劑盒以GPO-PAP 法檢測TC、TG。

1.5 肝臟病理檢測

另取部分肝組織于4%中性甲醛固定后，通過石蠟切片進行蘇木精-伊紅染色，通過冰凍切片進行油紅O染色。

1.6 免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色

三組肝組織石蠟切片后脫蠟至水，通過抗原修復(fù)、封閉、加一抗、加二抗、顯色等步驟，泛素結(jié)合蛋白p62 抗體稀釋比為1∶300，ATG5 抗體稀釋比為1∶50，待測蛋白與抗體結(jié)合顯色呈現(xiàn)棕黃色，統(tǒng)計分析光密度。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測

取三組大鼠肝組織裂解勻漿，用BCA 試劑盒測定蛋白含量，待測蛋白通過電泳、轉(zhuǎn)膜，最后進行免疫反應(yīng)顯影。Beclin1 抗體稀釋比為1∶20 000，LC3B 抗體稀釋比為1∶500、β-actin 抗體稀釋比為1∶1000。用灰度比值進行蛋白表達水平分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組生化指標(biāo)比較

模型組血清TC、TG、LDL-C、GOT、GPT 及肝組織TC、TG 高于正常組，血清HDL-C 低于正常組（P＜0.05或P＜0.01）。雷帕霉素組血清TC、TG、LDL-C、HDL-C均高于模型組，血清GOT、GPT 及肝組織TC、TG 均低于模型組（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

表1 三組生化指標(biāo)比較（mmol/L，）

表1 三組生化指標(biāo)比較（mmol/L，）

注 與正常組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01。TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；GOT：谷草轉(zhuǎn)氨酶；GPT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶

2.2 三組肝組織病理變化

正常組肝細胞形態(tài)未見明顯異常，模型組肝組織蘇木精-伊紅染色可見大多數(shù)肝細胞內(nèi)有大小不等的脂肪空泡，油紅O 染色可見大多數(shù)肝細胞內(nèi)含有脂質(zhì)被染成橘紅色。雷帕霉素組肝組織蘇木精-伊紅染色及油紅O 染色可見脂肪空泡和橘紅色較少。見圖1。

圖1 三組肝組織病理變化（200×）

2.3 三組肝組織自噬相關(guān)蛋白、微管相關(guān)蛋白、泛素結(jié)合蛋白比較

模型組Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、ATG5 低于正常組，泛素結(jié)合蛋白p62 高于正常組（P＜0.05）。雷帕霉素組Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、ATG5 高于模型組，泛素結(jié)合蛋白p62 低于模型組（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2、圖2～3。

表2 三組肝組織自噬相關(guān)蛋白、微管相關(guān)蛋白、泛素結(jié)合蛋白比較（）

表2 三組肝組織自噬相關(guān)蛋白、微管相關(guān)蛋白、泛素結(jié)合蛋白比較（）

注 與正常組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01。LC3B：輕鏈3B

圖2 三組肝組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1 及微管相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ條帶

3 討論

圖3 三組肝組織自噬相關(guān)蛋白ATG5 及泛素結(jié)合蛋白p62免疫組織化學(xué)染色（200×）

自噬是維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要生命活動，當(dāng)細胞內(nèi)異常物質(zhì)如衰老細胞器、錯誤折疊蛋白、脂質(zhì)蓄積等增多時，自噬可通過吞噬、消化動作，清除細胞內(nèi)冗余物質(zhì)[12]。在NAFLD 早期單純性脂肪肝階段，由于肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過度蓄積，導(dǎo)致肝細胞自噬水平降低，所以增強肝細胞自噬，促進脂質(zhì)的降解與利用是NAFLD的重要治療靶點[13-15]。自噬是動態(tài)連續(xù)的過程[16]，通過對期過程中關(guān)鍵蛋白Beclin1（介導(dǎo)自噬起始，促進自噬體成核及延伸）[17]、ATG5（促進自噬泡膜延伸）[18]、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ（促進LC3B-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3B-Ⅱ）[19]、p62（可在自噬溶酶體內(nèi)降解）[20]的觀察，能有效掌握自噬狀態(tài)[21-23]。

雷帕霉素為自噬激動劑，其可抑制mTORC1 活性，促使ULK1 激活，啟動自噬[24]。本研究用雷帕霉素治療NAFLD 大鼠后，發(fā)現(xiàn)其會導(dǎo)致NAFLD 大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C 異常增高，但在肝組織內(nèi)脂質(zhì)蓄積減少。有研究表明，一些使用雷帕霉素進行研究的動物實驗中都出現(xiàn)了其對機體脂代謝影響的雙面性[25-27]，綜合來看，使用雷帕霉素后可引起實驗動物全身反應(yīng)及血脂異常增高，對局部脂代謝異常臟器則有改善作用，機制可能與下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體的表達、減少脂肪細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚、并抑制其瘦素分泌有關(guān)[26]。本研究中，雷帕霉素通過增強肝細胞自噬水平來治療NAFLD 大鼠效果顯著，但如何選擇更合適的雷帕霉素劑量及用藥時間，以達到較好的治療效果并降低其副作用是進一步研究的重要方向。