基于網絡藥理學與分子對接技術的乳癖散結膠囊治療漿細胞性乳腺炎的潛在分子機制研究

徐政杰 方 堃 姜蘇曉 段麗娟 毛春花 張 萍

銀川市婦幼保健院外科，寧夏銀川 750001

漿細胞性乳腺炎（plasma cell mastitis，PCM）以乳腺導管阻塞、導管繼發性擴張、肉芽組織增生、淋巴細胞浸潤為主要病理學特征[1-3]。近年來，PCM 發病率逐漸增加，早期多以藥物治療為主[3-4]。PCM 發病機制復雜，明確的藥效靶點不多，臨床缺乏療效肯定的西藥。隨著治療模式的轉變和用藥經驗的積累，人們已經認識到中醫藥治療PCM 的臨床價值，并進行了諸多探索[5-7]。

中藥復方乳癖散結膠囊活血化瘀、通絡止痛、清熱解毒，廣泛用于乳腺增生等的治療[8-10]，且可調節激素水平[11]，治療PCM 具有較高價值。但該復方所含有效成分復雜，治療PCM 的相關機制尚未明晰。網絡藥理學運用生物分子網絡方法分析藥物與疾病和靶點之間“多成分、多靶點、多途徑”協同作用關系的藥理學分支，與中醫藥治療復雜疾病的原則一致[12-13]。本文采用該法探討乳癖散結膠囊治療PCM 的潛在化學成分及可能機制。

1 資料與方法

1.1 預測藥物有效成分篩選及靶點

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）和中藥分子機制生物信息學分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMANTCM）檢索夏枯草、川芎、鱉甲、僵蠶、玫瑰花、赤芍、柴胡、當歸、莪術、牡蠣、延胡索的化學成分，根據口服生物利用度≥30%、化合物類藥性≥0.18 篩選活性成分，收集相應靶點；通過通用蛋白質數據庫（universal protein database，Uniprot）對已篩選的靶點進行標準化處理，轉化為基因名稱。

1.2 預測漿細胞性乳腺炎治療靶點

通過在線人類孟德爾遺傳數據庫（online mendelian inheritance in man，OMIM）和GeneCards 數據庫檢索PCM 相關的治療靶點，匯總、去重后獲得。

1.3 乳癖散結膠囊治療PCM 的靶點預測

運用Draw Venny Diagram 在線軟件，取PCM 治療靶點與“1.1”收集到的靶點取交集后獲得。

1.4 構建藥物-成分-靶點-疾病網絡

運用Cytoscape 3.8.2 軟件構建藥物-成分-靶點-疾病網絡。

1.5 構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡

利用STRING 數據庫，設置信度為0.4，篩選乳癖散結膠囊治療PCM 靶點之間的相互作用關系；提取關鍵基因連接度蛋白統計條圖（選取排序前30 的），根據度值的排序確定核心靶點。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）分子功能和京都基因和基因組數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

利用R 語言3.6.1 進行GO 富集分析，獲得條圖（只展示前20 條）；進行KEGG 富集分析，獲得條圖（只展示前20 條）。

1.7 分子對接

通過TCMSP 及PubChem 數據庫得到乳癖散結膠囊成分的3D 結構信息，通過蛋白質數據庫下載靶蛋白的3D 結構，Autodock Tool 4.0 軟件對小分子和靶蛋白進行加氫、去電荷等處理，借助PyMOL 2.3.4 軟件插件找到對接活性位點，Autodock Vina 1.1.2 軟件處理后的成分與靶蛋白進行分子對接，通過PyMOL 2.3.4 軟件對結果進行可視化[14]。

2 結果

2.1 乳癖散結膠囊有效成分篩選及靶點預測

TCMSP 數據庫預測乳癖散結膠囊11 種有效成分中的40 個藥效成分，共得到321 個靶點；OMIM 和GeneCards 數據庫得到PCM 的治療靶點498 個，取交集得到36 個乳癖散結膠囊治療PCM 的靶點。見圖1。

圖1 乳癖散結膠囊治療PCM 靶點篩選

2.2 藥物-成分-靶點-疾病網絡

運用Cytoscape 3.7.1 軟件構建“藥物-成分-靶點-疾病網絡”。見圖2。

圖2 藥物-成分-靶點-疾病網絡

2.3 蛋白質-蛋白質相互作用網絡

通過STRING 數據庫分析得到227 對蛋白互作關系，涉及36 個蛋白靶點，見圖3。提取排名前30 的關鍵基因連接度蛋白統計條圖，見圖4，其中白介素-6（interleukin-6，IL-6）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EFGR）、白蛋白（albumin，ALB）、IL-1B、B 淋巴細胞瘤-2L1（B-cell lymphoma 2L1、BCL2L1）、趨化因子（C-C 基元）配體2[chemokine（C-C motif）ligand 2，CCL2]、過氧化氫酶（catalase，CAT）的度值排名較靠前。

圖3 乳癖散結膠囊治療漿細胞性乳腺炎靶點間蛋白互作關系

圖4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡節點度值排序

2.4 KEGG 與GO 富集分析

對上述36 個潛在靶點基因的KEGG 通路富集分析表明，P 值排名前20 的通路主要涉及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、IL-17、Toll 樣受體、T 輔助細胞17（T helper cells 17，Th17）分化、絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等信號通路。GO 富集分析提示，乳癖散結膠囊治療PCM 所調控的分子功能主要涉及調控細胞因子、抗氧化、蛋白磷酸酶結合、跨膜受體蛋白激酶、細胞因子受體結合等方面。見圖5～6。

圖5 乳癖散結膠囊治療PCM 的潛在靶點KEGG 通路富集

2.5 分子對接

選取“2.3”中乳癖散結膠囊核心成分自由度>10的有效成分，分別進行分子對接驗證，顯示與BAX、BCL2、PGR 具有最強結合能力的分別為luteolin（-8.2 kcal/mol）、Quercetin 和luteolin（-7.3 kcal/mol）、luteolin（9.5 kcal/mol）（圖7）。據此推測乳癖散結膠囊的活性成分通過影響乳腺導管上皮凋亡及孕激素受體調節等發揮對PCM的治療作用。

圖6 乳癖散結膠囊治療PCM 的潛在靶點的GO 通路富集

圖7 乳癖散結膠囊核心成分治療PCM 的分子對接圖

3 討論

中醫臨床上內治PCM，以疏郁散結為本，清熱解毒為輔[15]。乳癖散結膠囊由柴胡、當歸、川芎、鱉甲等藥物組成，功能軟堅散結、行氣活血[10]。本研究篩選40 個藥效成分，共預測321 個藥效靶點和498 個PCM的潛在治療靶點。本研究提示，IL-6、EFGR、ALB、IL-1B、BCL2L1、CCL2、CAT 為蛋白質-蛋白質相互作用網絡的核心靶點。藥物-成分-靶點-疾病網絡表明，PCM治療靶點較多，且靶點間存在著復雜作用關系，推測復方有效成分間存在協同關系。

GO 富集分析顯示，上述靶點基因通過調控細胞因子活性、抗氧化活性、蛋白磷酸酶結合、跨膜受體蛋白激酶活性、細胞因子受體結合等發揮治療PCM的潛在作用。目前，認為PCM 發病與自身免疫有關，乳房外傷、炎癥、哺乳障礙、內分泌失調等引起乳腺導管引流不暢，管腔纖維組織增生，周圍組織抗原反應、漿細胞浸潤[16-18]。付嘉等[19]證實PCM 患者外周血中調節性T 細胞CD4+CD25+CD127-Treg 明顯下降。張少波等[20]發現PCM 的發生、發展與Th17 細胞功能紊亂及重新分布有關。孫厚啟[21]證實，PCM 患者機體細胞因子IL-2 處于優勢狀態，而IL-4 處于劣勢狀態，這些研究都提示細胞因子活性在PCM 損傷中所發揮的重要作用。乳癖散結膠囊的36 個潛在靶點具有調控細胞因子活性的作用，其核心靶點中IL-6 已被證實為信號轉導子和轉錄激活子3（transcriptional activa tor，STAT3）的有效激活劑，PCM 患者IL-6 顯著高表達，且IL-6/STAT3 信號通路被激活[22-23]，提示乳癖散結膠囊可能通過調控IL-6 來發揮對PCM 的抗炎治療作用。

KEGG 通路富集分析顯示，乳癖散結膠囊發揮作用與多條信號通路有關，主要涉及NF-κB、IL-17、Toll 樣受體、MAPK 等信號通路。NF-κB 通路可能是促進漿細胞性乳腺炎炎癥損傷的因素之一，反過來可能會觸發炎癥反應并在乳房中形成肉芽腫[24-25]。分析潛在治療靶點，發現NF-κB 為顯著富集通路，提示乳癖散結膠囊通過作用于NF-κB 通路進行PCM 治療的潛在性。需指出的是，由于篩選條件的限制，本文僅分析了乳癖散結膠囊中說明書所公布的主要化合物，因此研究結果可能具有一定局限性。