豬皮明膠肽對肌肉的抗凍保護作用

路晶，王穎，聶文，謝勇，陳博，徐寶才

（合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230031）

我國是世界豬肉生產和消費大國，豬肉供應以國內生產為主。豬肉具有肉質鮮美、營養價值高的特點。有研究發現，豬肉中富含各類氨基酸，是人體所需蛋白的良好來源[1]，豬肉從新鮮屠宰到運輸至銷售點過程中，尤其是海外進口生鮮豬肉，肉質的保鮮及安全問題成為重點關注的對象。冷凍肉品是目前全球最普遍使用的用于長期運輸、貯藏肉品的方法，相應也有大量全程低溫冷鏈運輸產業的出現。然而，在低溫冷鏈運輸過程中，由于低溫冷凍及溫度的不斷波動，導致肉及肉制品肌肉纖維間隙產生許多冰晶，并隨溫度變化而發生冰晶聚集、膨大等重結晶現象，刺穿并擠壓了肌肉組織，導致細胞汁液流失、色素流失及營養流失的現象發生，同時還會造成肉品蛋白質變性、脂肪過度氧化及色澤劣變等不良影響，使肉品整體品質下降[2-4]。基于以上所述，科學家及相關從業者一直在尋找可以降低肉品冷凍損傷的保護方法。抗凍蛋白是一種能夠降低溶液冰點，卻幾乎不影響其熔點的帶有一定熱滯活性的物質，將其添加到冷凍肉品中，可以有效抑制冰晶生長聚集，進而減少肉品的滴水損失、營養流失[5]。傳統的商業抗凍劑還會采用糖類、醇類及鹽類物質作為冷凍保護劑，如蔗糖、山梨糖醇、磷酸鹽等化學物質及其復配產物。但此類抗凍劑卻有高糖、高熱量及高鹽等健康安全問題存在，不符合現代消費者對食品健康的要求。抗凍多肽，以食源性蛋白質如明膠、膠原蛋白等物質作為原料，通過酶解得到水解多肽，具有可控、可大規模生產及安全的特點，主要從食用明膠[6-7]、動物皮膚組織[8-9]及魚鱗[10]等副產物中提取，可以顯著提高原料的生產利用率，促進綠色環保事業發展，因而成為近年來有望替代糖類等傳統抗凍劑的有效低溫保護劑。

本研究中，用堿性蛋白酶水解豬皮明膠得到酶解物，將其超濾得到一個具有抗凍活性的組分，并將該組分注射到豬肉中，以空白組、未冷凍組及商業抗凍劑組作為對照，通過測定豬肉解凍損失探究其對肌肉的影響，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）來探究肌原纖維蛋白的降解情況，通過拉曼光譜、熒光光譜分析蛋白二級、三級結構情況，檢驗與評價豬皮明膠肽的抗凍活性及其對肌肉的冷凍保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬皮明膠B：漯河市五龍明膠有限公司；堿性蛋白酶（264 U/g）：諾維信（中國）生物技術有限公司；蔗糖（食品級）：成都太古糖業有限公司；氯化鈉、氯化鎂、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸[ethylenebis（oxyethylenenitrilo）tetraacetic acid，EDTA]、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、山梨糖醇、哌嗪-1，4-二乙磺酸（piperazine-1，4-bisethanesulfonic acid，PIPES）：中國索萊寶試劑有限公司；乙腈、濃鹽酸：中國醫藥集團。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

YP6001N電子天平：上海精密科學儀器有限公司；HH-8數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；Masterflex Model 07514-10 超濾機：Pall公司；FD-1A-50冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器公司；HCS321Gi-Y冷臺電子顯微照相系統：Instec公司；GL-21M高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；FA25高剪切乳化機：上海弗魯克流體機械制造有限公司；LabRam HR Evoulation顯微共焦激光拉曼光譜儀：法國Horiba Jobin Yvon公司；F-7100熒光光譜儀：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 抗凍活性檢測體系的確定

冷-熱循環檢測系統與多倍低溫顯微鏡和電子拍照系統聯合使用，檢測提取所得抗凍肽的抗凍活性。整個操作過程中，利用液氮來維持試驗所需的低溫環境，并以50℃/min的降溫速率，將放置樣品的樣品槽急速降溫至-60℃，平衡5 min。測定冰晶大小時，將每組樣品都溶解于生理鹽水中，并吸取5 μL置于載玻片上，隨后將載玻片快速放入冷臺樣品槽中封好，再以10℃/min的速率將樣品升溫至-8℃，保留30 min，以觀察冰晶的生長狀況。利用多倍顯微鏡觀察樣品中冰晶的變化，并用電子拍照系統實時拍照記錄冰晶生長情況，隨后，利用ImageJ軟件記錄并計算樣品中生長的冰晶平均直徑，若樣品中的冰晶平均直徑、數目對比空白對照組（生理鹽水）有明顯改善，則說明該樣品抑制冰晶生長的抗凍活性較高。多倍顯微鏡放大100倍來記錄。

1.3.2 抗凍多肽的超濾截留

向豬皮明膠中加入堿性蛋白酶，酶與豬皮明膠比為 1∶50（mL/g），pH9.0，37 ℃酶解 3 h，結束時將酶解液置于沸水浴中加熱至沸10 min以完全滅活蛋白酶。酶解物冷凍干燥得到粉末后，以1∶2（g/mL）的比例溶于蒸餾水中，形成穩定的溶液。將溶液先用纖維濾膜過濾，除去不溶的雜質顆粒，以免堵塞過濾柱。將過濾后的豬皮明膠酶解物（pigskin gelatin hydrolysate，PGH）溶液利用超濾機，分別用10 kDa分子量截留柱、3 kDa分子量截留柱和1 kDa分子量截留柱超濾。最后，將截留得到的蛋白質濾液分別獨立分裝，進行冷凍干燥，并將所得到的粉末裝入自封袋，做好標記，以備后續試驗使用。之后，將每個組分的樣品放置于冷臺觀察冰晶的生長，以冰晶的平均尺寸來表示其抗凍活性的大小。將抗凍活性最好的組分以4 mL/100 g注射到豬肉塊[每塊質量為（30±0.5）g]中，放置于-20 ℃冰箱 24 h，并過夜解凍，進行后續試驗測定。本試驗中將樣品分為4組：未冷凍組、空白組（冷凍，樣品不處理）、商業抗凍劑組（4 mL/100 g山梨糖醇+4 mL/100 g蔗糖）和抗凍肽組（4 mL/100 g的抗凍肽）。

1.3.3 肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）的提取

采用Li等[11]的方法提取豬肉肌原纖維蛋白。分別稱取各組經解凍樣品后（100±5）g，用4倍體積的分離緩沖液（0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，10 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4，pH7.0）混合，放入均質機均質。將混合的豬肉肉糜勻漿液在2 000×g、4℃條件下離心15 min，去除沉淀，刮去上層脂肪部分及底層結締組織，收集剩余部分，重復3次。將得到的沉淀用4倍緩沖液（0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.0）再次分散，在 2 000×g、4℃條件下離心 15 min，棄去上清取沉淀，重復洗滌3次。參照李春強[12]的方法，在最后一次離心前，利用0.1 mol/L HCl調節蛋白質混合液pH值為6.25。將蛋白質混合液用4層白色紗布過濾以去除多余結締組織及脂肪，再離心取沉淀，即得到粗提豬肉肌原纖維蛋白，并將其儲存于4℃冰箱中，在48 h內使用。蛋白質濃度利用雙縮脲法進行測定，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）標準蛋白為參照，調節蛋白質的濃度。

1.3.4 解凍損失

解凍損失是由豬肉樣品在冷凍前及冷凍后質量差占凍前質量的百分比來衡量的。將肉樣在冷凍前進行稱重，裝入自封袋中標記好，冷凍后將肉樣取出，用廚房用紙擦干肉樣表面的多余水分，此時再稱重每個肉樣。測量解凍損失全程都處于室溫中，并用Kong等[13]提出的公式（1）來計算。

式中：m1為冷凍前鮮肉樣品的質量，g；m2為冷凍后鮮肉樣品的質量，g。

1.3.5 SDS-PAGE凝膠電泳

各組肌原纖維蛋白用PIPES緩沖液稀釋至濃度為1 mg/mL，以1∶5（體積比）的比例與上樣緩沖液混合均勻，沸水加熱10 min。制膠利用預制膠試劑盒方法進行，配制5% 的濃縮膠和10% 的分離膠。制好膠后，用電泳緩沖液注滿電泳槽，濃縮膠中樣品上樣量為10 μL，Marker上樣量為 5 μL。 電泳時，當樣品跑濃縮膠時將電壓調到80 V，持續約25 min；當跑分離膠時將電壓調到110 V，持續60 min。電泳時，當溴酚藍到達分離膠接近底部1 cm時，停止電泳。最后，將凝膠用考馬斯亮藍染色液浸染1 h，然后用蒸餾水浸沒脫色至蛋白條帶清晰可見，拍照記錄。

1.3.6 拉曼光譜

參考Xiong等[14]的方法采用顯微共焦激光拉曼光譜儀測定樣品。具體操作參數：用532 nm的綠色二極管激光作為激光光源，樣品掃描范圍為400 cm-1～3 600 cm-1，樣品在掃描前先用激光光源照射30 min以去除肉樣中蛋白質的熒光背景干擾。每次掃描進行10次，采集時間為25 s，分辨率為2 cm-1，使用內標對1 004 cm-1峰處出現的苯丙氨酸殘基進行標準化。具體試驗條件：間隙寬度為200 μm，光柵為600 g/mm，采集時間為10 s，掃描累積為10次，分辨率為2 cm-1，采集計數為8。每個樣品的最終光譜信息通過Lab Spec 6進行校準。每個樣品的二級結構含量通過Alix等[15]描述的方法進行量化。

1.3.7 內源熒光光譜

蛋白質樣品的內源熒光光譜采用熒光分光光度計測定，參照曹云剛等[16-17]的方法稍加修改。將蛋白溶液用PIPES緩沖液調至0.2 mg/mL，激發波長設定為295 nm，狹縫寬度設定為10 nm，采集區間設定為300 nm～400 nm，記錄樣品波長吸收情況，每組做3次平行。

1.4 數據分析

每組試驗樣品為3個，每個樣品有3份重復，最終取重復的平均值作為結果數據。本研究中獲得的數據以平均值±標準差表示。不同的處理被包括為固定效應和重復作為隨機效應。使用SPSS 19.0（SPSS Inc.，Chicago，USA）軟件對數據進行方差分析（ANOVA），并進行鄧肯檢驗（Duncan）（P＜0.05為差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 抗凍多肽的超濾分離

抗凍多肽超濾各組分冰晶情況見圖1和圖2。

圖1 超濾各組分冰晶情況Fig.1 Ice crystal situation diagram of each component of ultrafiltration

圖2 超濾各組分冰晶尺寸大小Fig.2 Ice crystal size of each component of ultrafiltration

圖1和圖2可知，利用超濾系統得到的不同分子量范圍的豬皮明膠抗凍多肽，包含4組樣品：分子量＞10 kDa組、3 kDa＜分子量≤10 kDa組、1 kDa＜分子量≤3 kDa組和分子量＜1 kDa組。經過冷臺的冰晶大小觀察，發現1 kDa＜分子量≤3 kDa組的豬皮明膠抗凍多肽冰晶的平均尺寸最小，為（83.28±2.13）μm。而以生理鹽水作為空白對照組的冰晶尺寸則達到（145.27±5.15）μm，幾乎為1 kDa＜分子量≤3 kDa組豬皮明膠抗凍多肽的冰晶尺寸的兩倍。由此可以得出結論，經超濾分離得到的1 kDa＜分子量≤3 kDa組的豬皮明膠抗凍多肽的抗凍活性最好，后面將選取1 kDa＜分子量≤3 kDa組的抗凍多肽來繼續進行分離。

2.2 解凍損失

解凍損失通常會影響肉類和肉制品的各個方面，如外觀、感官品質、質量變化和營養價值[3]。肉品的解凍損失同時也反映了其保水性的好壞，而保水性直接影響了肉品的嫩度、肉質、顏色及風味等食品感官品質。不同處理組的肌肉解凍損失見圖3。

圖3 不同處理組的肌肉解凍損失Fig.3 Thawing loss of each muscle in different treatment groups

由圖3可以看出，空白組樣品經冷凍后的解凍損失顯著高于其他處理組樣品，這可能是由于空白組缺乏抗凍劑保護，大冰晶的生成損傷了肌肉組織及部分肌肉細胞，導致更多的細胞汁液、水分等流失。然而豬皮明膠多肽的添加可以顯著減少冷凍肉的解凍損失，與商業抗凍劑組相比，凍融循環后添加抗凍肽組肌肉的解凍損失較低（P＜0.05）。 根據Wang等[18-19]的研究表明，豬皮明膠抗凍多肽具有高度靈活的二級結構，當它接近冰晶與水的界面時可以調整其骨架的構象并重新排列其含氧基團以利于吸附在冰面上。豬皮明膠抗凍多肽的這一特性意味著抗凍多肽在冷凍過程中也與水分子競爭結合到冰晶表面，抑制其再結晶過程，同時形成細小均勻的冰晶。因此，大冰晶膨脹的現象大幅減少，對細胞膜的刺穿少，肌肉組織的保水能力得以保留，從而減少了冷凍肉的解凍損失。

2.3 SDS-PAGE結果

通過測定肌原纖維蛋白的SDS-PAGE結果，可以了解到經不同處理的豬肉肌原纖維蛋白在冷凍后的蛋白質分子的交聯及降解情況。各組的SDS-PAGE結果如圖4所示。

圖4 不同處理組的肌原纖維蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.4 SDS-PAGE gel electrophoresis of myofibrillar protein in different treatment groups

由圖4可知，豬肉肌原纖維蛋白的主要電泳條帶為肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC，245 kDa），肌動蛋白（42 kDa），原肌球蛋白（36 kDa）和肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC，20 kDa～30 kDa），此結果與Cai等[20]的研究結論一致。各組的MHC和肌動蛋白的條帶顏色最深、最寬，說明肌原纖維蛋白主要是由肌球蛋白和肌動蛋白所構成的。在4組處理中可以看出，空白對照組的MHC、MLC條帶和肌動蛋白條帶的顏色明顯低于其他各組，而在電泳道上樣時，每個泳道的蛋白量是相同的，由此可以推出，在冷凍解凍后空白組中蛋白質分子的空間構象發生了改變，導致蛋白質分子聚集并立即降解[21]。同時，由于空白組的肌原纖維蛋白在冷凍時沒有抗凍劑的保護，使冰晶不斷生長、聚集，對肌原纖維蛋白產生擠壓、斷裂等機械損傷，破壞了肌肉組織及細胞的完整性和穩定性，使蛋白質發生氧化、變性及降解，造成電泳條帶顯著淺于其他處理組。相比之下，抗凍多肽組的MHC、MLC及肌動蛋白條帶顏色與未冷凍組最為接近，且肌動蛋白條帶顯著深于商業抗凍劑組，因此可以推斷，經豬皮明膠抗凍多肽處理的豬肉肌原纖維蛋白，可以在冷凍后保持較高的完整性，有效抑制肌球蛋白和肌動蛋白的聚集、氧化及降解。

2.4 肌原纖維蛋白的二級結構分析

不同處理組樣品的拉曼光譜（400 cm-1～3 600 cm-1）結果如圖5所示。

圖5 不同處理組的拉曼光譜圖Fig.5 Raman spectra of different treatment groups

圖6 不同處理組的二級結構含量情況Fig.6 The secondary structure content of different treatment groups

從圖6中可以觀察到，除未冷凍組外，添加抗凍多肽的肌原纖維蛋白二級結構中的α-螺旋含量最多，為29.19% ，且明顯高于空白組和商業抗凍劑組，而無規卷曲的含量則最低，由此可知，添加抗凍多肽的豬肉樣品肌原纖維蛋白的二級結構在凍融后能最好地保持其規律性、完整性。這可能是因為抗凍多肽的添加抑制了豬肉肌肉組織及細胞在冷凍過程中形成的大冰晶，從而最大限度地減少了對肌原纖維蛋白二級結構的冷凍損傷破壞。因此，向豬肉中添加抗凍多肽可以有效保護豬肉肌原纖維蛋白的完整性，顯著提高其α-螺旋含量，保留肌原纖維蛋白的二級結構完整性、穩定性。

2.5 內源熒光光譜

內源熒光因其主要激發色氨酸殘基，可以監測蛋白質的氨基酸殘基及周邊微環境的變化，因此可以用來表征蛋白三級構象的變化情況[24]。各組樣品的熒光光譜情況如圖7所示。

圖7 不同處理組的內源熒光光譜圖Fig.7 Endogenous fluorescence spectra of different treatment groups

由圖7可以看出，4組樣品的最大熒光強度都出現在334 nm波長處，由此說明每組的肌原纖維蛋白的色氨酸殘基都處于相對疏水環境下。在4組樣品中，除了未冷凍組，抗凍多肽組的最大熒光強度明顯高于商業抗凍劑組和空白對照組，而空白對照組的最大熒光強度最低。由先前的研究中發現，蛋白質的熒光強度較弱可能是由羥自由基氧化所導致，羥自由基通過攻擊蛋白質的肽鏈，使蛋白質的空間構象展開，暴露了埋藏于內部的色氨酸殘基，導致蛋白分子表面色氨酸殘基含量增加，使能夠被激發的內源性色氨酸含量減少，最終導致蛋白熒光強度下降[25]。因此，空白組的熒光強度下降可能是由于冷凍期間冰晶的生長帶來的機械損傷、氧化損傷等，致使肌原纖維蛋白結構被展開，內源性色氨酸熒光強度相應下降。以上結果表明，豬肉中添加豬皮明膠抗凍多肽可以有效緩解冷凍過程中肌原纖維蛋白的氧化損傷，降低蛋白的變性程度。

3 結論

將豬皮明膠酶解物經超濾分離的方法，得到的1 kDa～3 kDa組分抗凍活性最強，冰晶尺寸最小。向豬肉中添加4 mL/100 g豬皮明膠抗凍多肽，其肌肉解凍損失顯著降低，同時也抑制了肌球蛋白和肌動蛋白的降解，肌原纖維蛋白在冷凍過程中因冰晶生長帶來的擠壓、斷裂等產生的氧化、聚集得到了明顯改善，保持了肌原纖維蛋白的二、三級結構的完整性。豬皮明膠抗凍多肽可以作為冷凍保護劑添加到豬肉中，在代替傳統的糖類商業抗凍劑應用于肉類工業中具有一定的合理性和潛力。