基于超聲法通透化處理提高靜息細胞轉化苯丙氨酸合成苯乳酸產量

侯穎，劉洋，王浩源，劉楊韜，孫宇婷，張榮飛，周中凱，張守慶，譚之磊，賈士儒*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.天津天隆農業科技有限公司，天津 300457；3.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；4.中科藍海測試（天津）科技有限公司，天津 300457）

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）被認為是一種有效的抗菌化合物，對細菌和真菌具有廣譜抑菌作用，因此被用作抗菌劑、食品防腐劑和風味化合物[1]。PLA的生物合成方法主要包括微生物發酵和酶促/靜息細胞轉化。多種乳酸菌均具有PLA合成能力，Lactobacillus plantarum AB-1、Lactobacillus plantarum UN-30 和 Lactobacillus plantarum BLPC002在Man-Rogosa-Sharpe（MRS）培養基中發酵，PLA產量分別達到（252.44±2.63）mg/L[2]、2 930 mg/L[3]和 1.67 g/L[4]。 但是由于代謝路線較長，關鍵酶活性低，發酵法產量較低，難以工業化生產。

與純酶催化法相比，靜息細胞轉化法具有無需進行酶的純化、酶穩定性高、細胞可重復使用、產品易于分離等優點[5]。然而，靜息細胞的細胞結構阻礙了細胞催化劑的快速反應。如，大腸桿菌的細胞膜分為外膜和內膜，外膜約為6.7 μm2，含有3.5×106個脂多糖分子，占據細菌表面的四分之三，密集組裝的脂多糖是底物和產物轉運的重要屏障[6]，導致游離酶催化比細胞催化速率高10倍～100倍。因此，必須制備通透性提高的靜息細胞，以增加細胞膜的通透性，降低細胞的屏障效應及傳質阻力，在保持細胞活性的同時提高催化反應速率。

超聲波是頻率大于20 kHz的聲波，具有波動和能量的雙重特性。低頻超聲一般在20 kHz～50 kHz之間，高頻超聲一般大于50 kHz[7]。在生物領域，高頻高強度超聲一般會造成細胞結構發生劇烈的不可逆破壞，用于細胞破碎等高強度處理過程；而低頻低強度超聲借助超聲波的傳輸引起細胞膜和細胞壁附近介質的振動，因此會對細胞結構造成輕微可逆性改變，可用于增強酶活性、代謝效率、細胞傳質效率。有研究表明用20 kHz低頻率超聲處理使酵母細胞生長停滯期減少1 h[7]。Ewe等[8-9]對豆漿中的乳酸桿菌屬進行超聲處理（30 kHz、100 W），促進了乳酸桿菌的生長，β-葡萄糖苷酶活性提高了10% 。

前期研究中，我們構建了共表達L-氨基酸脫氨酶（L-amino acid deaminase，L-AAD）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和甲酸脫氫酶（formate dehydrogenase，FDH）的重組 Escherichia coli靜息細胞，催化底物苯丙氨酸（phenylalanine，PHE）生成中間體苯丙酮酸（phenylpyruvic acid，PPA），然后最終合成PLA。通過定向進化和定點突變結合高通量篩選，得到了底物結合能力和催化效率顯著提高的Proteus mirabilis來源的L-AAD突變體[10]；通過共線性分析及系統生物學的方法對LDH進行篩選，確定Lactobacillus CGMCC 9967來源的乳酸脫氫酶為最佳LDH[11]；通過消除PPA降解副反應，敲除E.coli胞內存在的3種催化PPA降解的轉氨酶[12]，輔酶合成和再生途徑改造[13]，及在轉錄水平和翻譯水平調節3種酶的表達量，PLA產量提高至43.8 g/L，這是現有報道中靜息細胞催化合成PLA的較高產量[14]。但是難以進一步提高PLA產量和底物轉化率，距離工業化仍有很大差距。

根據文獻報道，LDH和FDH均位于細胞質中[15-16]。根據預測軟件 TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0），P.mirabilis來源的 L-AAD是一種II型單次跨膜蛋白，氨基酸殘基1-6位于胞質，殘基7-29形成單跨膜螺旋穿過細胞膜，殘基30-471位于胞外。此外Hossain等[17]為了確定L-AAD的C末端還是N末端位于細胞膜外側，分別構建了含有外側向外和內側向外囊泡的重組靜息細胞催化劑，發現只有外側向外囊泡的重組靜息細胞具有脫氨酶活性，這一結果初步證明了軟件預測結果的正確性。因此推測，靜息細胞催化過程中底物PHE、中間體PPA和產物PLA 3種物質跨膜轉運過程：在細胞外，膜蛋白酶L-AAD催化底物PHE合成中間體PPA，PPA在膜上轉運蛋白作用下轉運進入胞內；在細胞內，LDH和FDH催化PPA合成PLA；胞內的PLA在膜上轉運蛋白作用下轉運到胞外。底物和產物的轉運可能是影響靜息細胞催化的限制性因素，難以進一步提高PLA產量和底物轉化率。

為了提高底物和產物轉運速率，本研究首先對超聲破碎條件進行優化，得到細胞通透能力顯著提高的靜息細胞，然后對靜息細胞催化條件進行優化，最后研究催化過程中胞內PHE、PPA和PLA濃度變化，確定超聲對底物和產物轉運速率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

前期研究中構建的重組E.coli BL21（pRSFDuet-2ldh-rbs2aad-fdh）作為靜息細胞催化劑[18]。胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂：賽默飛世爾科技公司；氯化鈉（分析級）：國藥集團化學試劑有限公司。

LB（Luria-Bertani）液體培養基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L， 卡那霉素 100 μg/mL，pH7.4，121 ℃滅菌 20 min；TB（Terrific Broth）培養基：酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）100 mmol/L， 無氨基酵母氮源13.4 g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇1% （體積分數），pH7.4，121 ℃滅菌 20 min；PBS 緩沖液：NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO41.44 g/L，KH2PO40.24 g/L，pH7.4。

1.2 儀器與設備

JY88-IIN超聲破碎儀（總功率為1 000 W）：中國新芝公司；TZ9S紫外可見分光光度計：上海精科實業有限公司；DNP-9162微生物恒溫培養箱：蘇州威爾實驗用品有限公司；CR21G高速冷凍離心機：日本Hitachi公司；UV-2550紫外-可見分光光度計：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 靜息細胞催化劑制備

從甘油管中吸取少量菌液置于LB搖菌管中，37℃，220 r/min的條件下培養10 h，以1% （體積分數）的接種量接種于100 mL TB培養基（含100 μg/mL卡那霉素），37℃，220 r/min培養至OD600為0.5左右，添加誘導劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 至終濃度為 0.04 mmol/L，于 20℃、220 r/min誘導表達 10 h～12 h。 8 000 r/min、4℃離心10 min并棄掉上清液。用PBS緩沖液對菌體細胞進行洗滌和重懸，8 000 r/min離心10 min棄掉上清液。根據具體試驗需求重懸并調整OD600。

1.3.2 超聲通透化處理優化

選擇操作頻率為20 kHz～25 kHz的超聲破碎儀對培養好的靜息細胞催化劑進行超聲處理。所有超聲試驗均保證使用Φ6的超聲探頭深入到PBS靜息細胞催化劑中懸液液面以下3 cm處。為防止超聲時產生的熱量破壞細胞催化劑，超聲試驗在冰盒中進行。

超聲通透化處理過程中主要影響因素有超聲波功率、處理時間和占空比等。為了得到最佳的超聲處理條件，以超聲波功率（1% 、10% 、20% 、30% 、40% ）、處理時間（30、60、120 s）和占空比（50% 、60% 、70% 、80% 、90% ）作為考察因素，以苯乳酸濃度作為試驗指標進行優化試驗。

1.3.3 細胞催化條件優化

在超聲通透化處理條件得到優化的基礎上，以溫度（25、30、35、40、45 ℃）、pH 值（5、6、7、8、9）、緩沖液種類（PBS、生理鹽水、水）為考察因素，同樣以苯乳酸產量作為試驗指標，逐步減小試驗梯度，進行細胞催化條件的優化試驗。

1.3.4 細胞蛋白及核酸透性檢測

細胞核酸增強率（R1）按式（1）計算。

式中：a為260 nm波長下未超聲波處理的細胞懸液上清液的吸光值；b為260 nm波長下超聲處理后的細胞懸液上清液的吸光值。

細胞蛋白增強率（R2）按式（2）計算。

式中：c為280 nm波長下未超聲波處理的細胞懸液上清液的吸光值；d為280 nm波長下超聲處理后的細胞懸液上清液的吸光值。

1.3.5 PHE、PPA和PLA的檢測方法

參考Valerio等[19]的方法，適當修改。HPLC條件：選用安捷倫反相色譜柱ZORBOX SB-C18，進樣量為10 μL，流動相為水（A）和甲醇（B），梯度洗脫程序為 0～20 min由10% B線性變化至100% ，20 min～23 min保持 100% B，23 min～25 min由 100% B 線性變化至10% 。流速為1 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30℃。

1.4 數據處理

采用PASW Statistics 18、Origin和Excel對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 超聲通透化處理條件優化

超聲通透化處理占空比、功率對PLA濃度的影響如圖1所示。

圖1 占空比、功率對PLA濃度的影響

設定處理時間為1 min，未超聲處理對照組PLA濃度為12.96 g/L，首先對超聲通透化占空比和功率進行優化。由圖1可知，當占空比為80% 時，PLA濃度普遍高于其他的占空比的組別。當功率為30% ，占空比為80% 時PLA濃度最高，為20.65 g/L，是占空比60% 、70% 和90% 的1.96倍、1.61倍和1.47倍，比對照組提高了37.53% 。當占空比低到60% 時，PLA濃度低于對照組。

由于功率和占空比對于細胞通透性的重要性，基于上述優化的初步結果，將超聲功率范圍縮小到30% 附近，占空比范圍縮小到80% 附近進一步優化這兩個條件。結果見圖2。

圖2 功率和占空比對PLA濃度的影響Fig.2 Effect of power and duty cycle on PLA concentration

如圖2所示，占空比為80% 時，功率30% PLA濃度是功率25% 和35% 的1.1倍和1.08倍。功率為30% 時，占空比80% PLA濃度是占空比70% 和90% 的1.09倍和1.1倍。

同時改變功率和超聲時間對PLA濃度的影響如圖3所示。

圖3 功率和時間對PLA濃度的影響Fig.3 Effect of power and time on PLA concentration

由圖3可知，功率為30% ，超聲時間為1 min時PLA濃度相較于功率為29% 和31% 分別提高9.5% 和9.1% 。且超聲處理時間越長PLA濃度越低，功率為30% 時延長處理時間至2 min和3 min時PLA濃度是超聲1 min的93.2% 和91.6% 。因此，超聲通透化處理最佳條件為處理時間1 min、占空比80% 、功率30% 。在此最優條件下，PHE初始濃度為30 g/L，PLA濃度達到20.65 g/L，底物轉化率為68.4% ，是未超聲處理的1.59倍。

2.2 通透化細胞催化條件優化

通過超聲通透化處理后，靜息細胞結構發生變化，其催化條件也可能發生改變。因此以未超聲處理為對照組，對催化條件（pH值、溫度、緩沖液）進行優化，結果見圖4～圖6。

圖4 pH值對PLA濃度的影響Fig.4 Effect of pH value on PLA concentration

圖5 溫度對PLA濃度的影響Fig.5 Effect of temperature on PLA concentration

圖6 緩沖液對PLA濃度的影響Fig.6 Effect of buffer on PLA concentration

由圖4可知，不同pH值下經最優超聲條件處理的試驗組PLA濃度均高于相應對照組，且在pH7時試驗組和對照組PLA濃度達到最大，分別為52.59 g/L和43.93 g/L。以試驗組為例，隨著pH值提高，PLA濃度先升高后降低，pH7時PLA濃度達到最高，是pH6時的1.09倍。進一步提高pH值為9時，PLA濃度降低為最高濃度的87.3% 。結果表明，試驗組和對照組在不同pH值條件下PLA濃度變化趨勢相同，且超聲通透作用并未改變通透化靜息細胞的較佳pH值，其較適pH值為7。

如圖5所示，試驗組和對照組PLA濃度隨溫度變化趨勢相同，且不同溫度下超聲處理的試驗組PLA濃度均高于相應對照組。隨著催化溫度提高，PLA濃度先升高后降低，35℃時，試驗組和對照組PLA濃度達到最高，試驗組PLA濃度（52.59 g/L）是對照組（43.93 g/L）的1.2倍；試驗組和對照組35℃時PLA濃度是30℃時的1.16倍和1.25倍。隨著催化溫度進一步提高，PLA濃度降低，40℃時試驗組和對照組PLA濃度比35℃分別降低4.9% 和9.1% 。結果表明，超聲通透作用并未改變通透化靜息細胞的最適溫度，較適溫度為35℃。

如圖6所示，使用PBS緩沖液洗滌細胞并作為超聲組催化緩沖液時PLA濃度最高，是使用生理鹽水和蒸餾水時PLA濃度的1.28倍和1.49倍。說明緩沖液類型也會影響靜息細胞催化狀態。因此PBS是最合適的靜息細胞洗滌和催化緩沖液。

綜上，最優通透化細胞操作和催化條件：在PBS緩沖液（pH7，35℃）中洗滌并重懸細胞，然后加入底物，在pH7，35℃下催化。在最佳催化條件下，PLA濃度從43.93 g/L提高到52.59 g/L，是原來的1.2倍，底物轉化率從78.70% 提高到94.59% 。

2.3 超聲處理對靜息細胞底物和產物轉運速率的影響

根據超聲處理對PLA濃度和底物轉化率的影響，推斷超聲處理影響了靜息細胞底物和產物轉運速率。為了驗證推斷，檢測催化過程中3種物質在胞內胞外的濃度變化情況并分別進行比較。以未超聲處理為對照組，以最優超聲條件處理為試驗組，在相同最優靜息細胞催化條件下進行催化，結果見圖7、圖8。

圖7 靜息細胞催化過程中胞外PHE、PPA和PLA濃度變化Fig.7 Changes in the concentrations of extracellular PHE，PPA and PLA

圖8 靜息細胞催化過程中胞內PHE、PPA和PLA濃度變化Fig.8 Changes in the concentrations of intracellular PHE，PPA and PLA

如圖7所示，胞外PHE初始濃度為60 g/L，0～8 h，PHE濃度迅速降低，此期間試驗組胞外的PHE濃度一直低于對照組，6 h時試驗組和對照組胞外的PHE濃度差距最大，6 h時試驗組胞外的PHE濃度是對照組的56.8% ，說明超聲處理提高了胞外PHE的消耗速率。如圖8所示，0～8 h期間試驗組胞內的PHE濃度一直低于對照組，6 h時試驗組和對照組胞內的PHE濃度差距最大，6 h時試驗組胞內的PHE濃度是對照組的58.9% 。結合胞內外PHE濃度變化趨勢結果，又由于低頻超聲對蛋白結構影響可能性不大，說明超聲處理提高了底物PHE由胞外向胞內的轉運速率。

如圖7所示，0～8 h，PPA濃度升高較快，此期間試驗組胞外的PPA濃度一直低于對照組，12 h時試驗組和對照組胞外的PPA濃度差距最大，12 h時試驗組胞外的PPA濃度是對照組的40% 。如圖8所示，隨時間延長胞內PPA濃度逐漸提高，催化前期0～8 h內，試驗組和對照組胞內PPA濃度基本相同，可能是由于催化前期L-AAD氧化脫氨基反應速率是反應限制性因素，胞外積累的PPA濃度較低，向胞內轉運的PPA較低，因此試驗組和對照組PPA濃度差距不大。10h～14h，試驗組胞內PPA濃度明顯高于對照組，12 h時，試驗組和對照組胞內的PPA濃度差距最大，12 h時試驗組胞內PPA濃度是對照組的1.29倍。結合胞內外PPA濃度變化趨勢結果，說明超聲處理提高了中間體PPA由胞外向胞內的轉運速率。

如圖7所示，0～8 h，PLA濃度迅速提高，14 h時，對照組PLA濃度達到最高，為43.93 g/L；12 h時，試驗組PLA濃度達到最高，為52.59 g/L。6 h時，對照組和試驗組PLA濃度差距最大，試驗組PLA濃度是對照組的1.49倍。如圖8所示，0～8 h，對照組和試驗組胞內PLA濃度差距不大，可能是由于催化前期LDH反應速率是反應限制性因素，胞內積累的PLA濃度較低，向胞內轉運的PLA較低，因此試驗組和對照組PLA濃度差距不大。結合胞內外PLA濃度變化趨勢結果，說明超聲處理提高了終產物PLA由胞內向胞外的轉運速率。

為了進一步研究細胞通透化處理對細胞的影響及量化細胞通透化的程度，進行了催化過程中細胞蛋白及核酸透性檢測，結果見圖9、圖10。

圖9 細胞蛋白質通透性（R1）檢測Fig.9 Detection of cellular protein acid permeability（R1）

圖10 細胞核酸通透性（R2）檢測Fig.10 Detection of cellular nucleic acid permeability（R2）

如圖9和圖10所示，靜息細胞超聲通透化處理后，R1和R2分別為19.48% 和19.69% 。在靜息細胞轉化過程中，隨著催化時間的延長，R1和R2逐漸提高，10 h時R1達到最大值，是催化初始時的1.87倍；12 h時R2達到最大值，是催化初始時的1.84倍。說明超聲處理提高了細胞膜通透性，導致細胞內物質外泄，催化過程中機械攪拌等作用也會加劇細胞通透性。0～4 h，R1和R2從初始19% 左右迅速提高到30% 以上，4 h～12 h R1和R2的增加速率明顯放緩，分別從30.26% 和32.46% 提高到35.16% 和36.23% 。這說明細胞膜通透性不會無限增加，可能是由于細胞自身具有某種修復機制，可以控制細胞通透程度，Avhad等[20]利用超聲處理球形芽孢桿菌MTCC 3672增加了細胞滲透性，改善了底物攝入并促進了微生物細胞的新陳代謝，進而促進纖溶酶的合成，這與本研究結果類似。然而，利用掃描電子顯微鏡觀察發酵后期菌體結構時，未發現菌體表面出現大面積的孔洞與間隙，研究人員認為這與細胞膜自我修復機制有關。這說明合理適當程度的超聲通透化處理使靜息細胞細胞膜產生可逆的孔洞和間隙，這些“通道”的存在使細胞膜通透性提高。但是細胞膜具有自我修復的能力，細胞膜膜通透性不會一直提高，細胞不會一直向外泄露蛋白質和核酸。

3 討論與結論

超聲處理在強化生物技術過程（包括發酵、提取、生物催化和廢物處理）方面具有巨大潛力，Behzadnia等[21]發現超聲處理（25 kHz）能將植物乳桿菌ATCC 8014生產生物表面活性劑產量提高30% 。Dong等[22]發現超聲處理60 min能將重組大腸桿菌生產D-酒石酸的轉化效率提高兩倍。Huang等[23]發現超聲[（28±2）kHz]處理60 min能使熱帶假絲酵母的膜滲透性和細胞生長率提高142.5% 。Sun等[24]發現超聲處理（40 kHz）可以強化真菌細胞生物量，使得竹紅菌甲素產量提高77.2% 。總之，超聲波對微生物代謝的有利影響包括：（1）消除微生物細胞團，提高微生物的表面積/體積比，進而提高胞內外物質交換；（2）增加細胞膜的滲透性，從而提高通過細胞膜的營養吸收，促進細胞生長和增殖；（3）改變微生物酶表面結構，提高酶催化能力[25]。

超聲處理效果受到多種不同因素影響。其中，革蘭氏染色性質在超聲處理效果中起著重要作用。一般革蘭氏陽性菌由于具有由磷壁酸和肽聚糖組成的更堅固的細胞壁，比革蘭氏陰性菌更能抵抗超聲波。此外，細菌的形狀也會影響超聲處理效果。長桿狀的桿型菌由于具有更大的表面積/體積，比球型菌更容易受到超聲波的影響。因此，大腸桿菌作為一種桿狀的革蘭氏陽性菌，是進行超聲處理的很好選擇。

正確使用超聲參數，如超聲功率、占空比和超聲時間，對控制其催化能力至關重要。盲目增加超聲功率和時間會導致細胞內物質擴散，局部加熱，產生自由基，導致細胞失活或死亡。因此應在超聲處理產生結構上的改變并維持靜息細胞催化能力兩者之間找到平衡。

本研究使用超聲破碎儀對靜息細胞進行通透化處理，優化得到最佳超聲處理條件：處理時間1 min、占空比80% 、功率30% ；對通透化細胞催化條件進行優化，得到較佳催化條件：pH7、35℃、緩沖液為PBS。此條件下最終PLA的濃度從43.93 g/L提高到52.59 g/L，底物轉化率從78.7% 提高到94.59% 。最后，研究發現超聲處理可以提高PHE、PPA和PLA 3種物質轉運速率，從而提高整個反應的催化效率。