超聲波輔助提取油莎豆粕水溶性多糖及其抗氧化性

吳修利，徐雷，謝英，司美雙

（長春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130022）

油莎豆為莎草科莎草屬多年生草本植物，是一種優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、綜合利用價(jià)值很高的油、糧多用新型作物[1-2]。油莎豆基本成分主要由脂肪、糖、淀粉等組成，含量分別為26.50% 、23.35% 和23.21%[3]。經(jīng)提取油和淀粉后的油莎豆粕中還含有豐富的水溶性多糖，研究表明，植物多糖具有調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活性、有效清除自由基的功能[4]。目前，多糖的抗氧化性測定主要采取體外試驗(yàn)、細(xì)胞試驗(yàn)以及活體實(shí)驗(yàn)3種方式。由于體外試驗(yàn)具有操作簡便、儀器設(shè)備要求不高、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，在多糖抗氧化性研究中被廣泛使用[5]。

近年來，多糖的提取方法有化學(xué)法、酶解法、物理強(qiáng)化法或?qū)⒉煌夹g(shù)進(jìn)行復(fù)合使用的方法[6]。普通化學(xué)法存在提取時(shí)間長、耗能高[7]等缺點(diǎn)，而酶解法存在成本高等問題[8]。超聲波輔助提取作為常用的物理強(qiáng)化法，其原理是利用超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)以及熱效應(yīng)破壞細(xì)胞，利于細(xì)胞壁破碎，加快細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放和溶解速率，與傳統(tǒng)方法相比，提取液中的雜質(zhì)較少，同時(shí)能縮短提取時(shí)間并提高有效物質(zhì)的提取率[9]。

本研究利用超聲波輔助提取油莎豆粕水溶性多糖，采用正交試驗(yàn)法對工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對油莎豆粕水溶性多糖的結(jié)構(gòu)、抗氧化性進(jìn)行研究，為油莎豆粕水溶性多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

油莎豆粕：長春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制；蒽酮：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸：西隴科學(xué)股份有限公司；硫酸亞鐵、過氧化氫：天津市福晨化學(xué)試劑廠；水楊酸：天津市華東試劑廠；三羥甲基氨基甲烷：北京沃凱生物科技有限公司；鄰苯三酚：北京偶合科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海麥克林生化科技有限公司；溴化鉀（色譜純）：天津中世沃克科技發(fā)展有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

XO-1500DN溫控型超聲波細(xì)胞破碎儀：南京先歐儀器制造有限公司；NICOLETIS5型傅里葉變換紅外光譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；UV-2700紫外可見分光光度計(jì)：島津儀器（蘇州）有限公司；TDL-50B低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 油莎豆粕水溶性多糖提取工藝

油莎豆粕→粉碎過40目篩→超聲處理→離心沉淀→取上清液→脫蛋白→過濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（濃縮至體積的1/5）→醇沉→離心→干燥→粉碎過100目篩→油莎豆粕水溶性多糖。

脫蛋白采用等電點(diǎn)法[10]進(jìn)行，即用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5，攪拌均勻后過濾除去蛋白質(zhì)沉淀，留上清液。

1.3.2 油莎豆粕水溶性多糖含量測定

多糖含量采用蒽酮-硫酸比色法測定[11]。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制：取1.0 mL不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、20、40、60、80、100 μg/mL）于試管中，加入蒽酮試劑5 mL，搖勻，沸水浴中煮沸15 min，取出立即冷卻，620 nm處測吸光度，以葡萄糖濃度（x）為橫坐標(biāo)，以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為y=0.008 7x-0.014 9，R2=0.998 7。

樣品多糖含量的測定：吸取多糖樣品溶液1.0 mL，用蒸餾水定容至100 mL。取1.0 mL定容后樣液按上述方法測定吸光度。以蒸餾水作為對照，參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品多糖濃度。按下式計(jì)算多糖提取率。

式中：C為根據(jù)吸光度計(jì)算得到的油莎豆粕水溶性多糖濃度，mg/mL；V為測定所用油莎豆粕水溶性多糖溶液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為稱取的油莎豆粕質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以油莎豆粕水溶性多糖提取率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)研究不同料液比、超聲時(shí)間、超聲功率對多糖提取率的影響，試驗(yàn)水平分別選取為料液比[1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）]，超聲時(shí)間（4、6、8、10、12 min），超聲功率（150、300、450、600、750 W）。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取料液比（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲功率（C）設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，以油莎豆粕水溶性多糖提取率作為考察指標(biāo)，確定油莎豆粕水溶性多糖最佳提取工藝條件。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法。將干燥的油莎豆粕水溶性多糖樣品與溴化鉀按照質(zhì)量比1∶180研磨均勻，壓成透明薄片，在400 cm-1～4 000 cm-1波數(shù)內(nèi)進(jìn)行全波段掃描，繪制紅外光譜圖。

1.3.6 油莎豆粕水溶性多糖抗氧化性測定

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力測定

分別準(zhǔn)確吸取濃度為 2、3、4、5、6 mg/mL 的多糖樣品2 mL，再吸取2 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液加入到試管中搖勻，室溫（25°C）下避光靜置30 min，在517 nm處測其吸光度。每個(gè)待測樣品平行測定3次，取平均值。以VC作為陽性對照，按照下式計(jì)算DPPH自由基清除率[12]。

式中：A0為乙醇與DPPH混合溶液的吸光度；A1為樣品與DPPH混合溶液的吸光度；A2為樣品與乙醇混合溶液的吸光度。

1.3.6.2 羥自由基清除能力測定

參考羅敬文等[13]的方法，略有改動(dòng)。向15 mL的試管中加入2 mL硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L）、2 mL過氧化氫溶液（6 mmol/L）、2 mL水楊酸溶液（6 mmol/L）和2 mL 濃度分別為 0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/mL 的多糖樣品溶液，在37℃下反應(yīng)1 h，以蒸餾水為參比，在517 nm波長處測定其吸光度，每個(gè)試驗(yàn)平行3次。以VC作為陽性對照，羥自由基清除率按下式計(jì)算。

式中：A0為蒸餾水的吸光度；A1為過氧化氫溶液和樣品溶液混合后的吸光度；A2為蒸餾水代替過氧化氫和樣品溶液混合后的吸光度。

1.3.6.3 超氧陰離子自由基清除能力測定

取濃度分別為 2、3、4、5、6 mg/mL 的多糖樣品0.5 mL，向15 mL的試管中加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH8.2），搖勻，置于 37℃條件下預(yù)熱20 min，然后加入0.5 mL在37℃條件下預(yù)熱的鄰苯三酚（3 mmol/L），搖勻后立即倒入比色皿。以HCl（10 mmol/L）溶液為參比，在325 nm波長下測吸光度，每個(gè)試驗(yàn)平行3次。以VC作為陽性對照，超氧陰離子自由基清除率按下式計(jì)算[14]。

式中：A0為蒸餾水與鄰苯三酚溶液混合后的吸光度；A1為樣品溶液與鄰苯三酚溶液混合后的吸光度；A2為樣品溶液與蒸餾水混合后的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2018 64 Bit、SPSS 21.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對油莎豆粕水溶性多糖提取率的影響

在超聲功率600 W、超聲時(shí)間6 min的條件下，考察料液比對油莎豆粕水溶性多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對多糖提取率的影響Fig.1 The effect of solid-liquid ratio on the yield of polysaccharides

由圖1可知，隨溶劑體積的增加，油莎豆粕水溶性多糖提取率呈先增大后減小的趨勢。這是因?yàn)槿軇┰龆嗪笏芤号c油莎豆粕粉末接觸更加充分，從而有利于多糖的溶出，在料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，多糖的提取率達(dá)到最大，此時(shí)多糖類物質(zhì)的溶出達(dá)到飽和。繼續(xù)增大溶劑體積時(shí)，提取率反而下降。可能的原因：一方面，隨著水溶液增多，一部分超聲波會被水溶液吸收，從而影響多糖的提取率；另一方面，溶劑體積過大還可能造成溶出的蛋白質(zhì)重新與多糖結(jié)合[15]，而且增加了后續(xù)處理時(shí)間和提取液濃縮成本。因此，選擇料液比 1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）3 個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.2 超聲時(shí)間對油莎豆粕水溶性多糖提取率的影響

在料液比1∶30（g/mL）、超聲功率 600 W的條件下，考察超聲時(shí)間對油莎豆粕水溶性多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharides

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長多糖提取率先增大后減小，當(dāng)超聲時(shí)間為8 min時(shí)多糖提取率達(dá)到最大。足夠的超聲時(shí)間有助于促進(jìn)多糖從細(xì)胞中溶出，提高多糖提取率。當(dāng)超聲時(shí)間超過8 min時(shí)，造成多糖提取率下降，原因可能是由于超聲時(shí)間過長，導(dǎo)致細(xì)胞完全破裂，細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)也會溶入水中，從而使多糖的溶解減少[15]。此外，長時(shí)間超聲處理，較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用使溶出的大分子多糖更加不穩(wěn)定，糖苷鍵斷裂，從而導(dǎo)致多糖提取率下降[16]。因此，選擇超聲時(shí)間6、8、10 min 3個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.3 超聲功率對油莎豆粕水溶性多糖提取率的影響在料液比1∶30（g/mL）、超聲時(shí)間8 min的條件下，考察超聲功率對油莎豆粕水溶性多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲功率對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharides

由圖3可知，隨著超聲功率增大，多糖提取率先增大后減小，當(dāng)超聲功率為450 W時(shí)提取率達(dá)到最大。這是因?yàn)槌暡óa(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)具有空化效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞，加快溶質(zhì)擴(kuò)散和溶解滲透，從而加速了多糖的溶出，超聲波的功率越高空化作用越強(qiáng)，多糖的提取率越高。當(dāng)超聲功率大于450 W時(shí)，提取率下降，可能是由于超聲功率過高對多糖結(jié)構(gòu)具有破壞性作用[17]。 因而，選擇超聲功率300、450、600 W 3個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析結(jié)果如表2和表3所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 The variance analysis result of orthogonal test

通過表2極差分析可知，影響油莎豆粕水溶性多糖提取率的因素主次順序?yàn)锳＞B＞C，即料液比＞超聲時(shí)間＞超聲功率。提取油莎豆粕水溶性多糖的最優(yōu)工藝組合為 A2B1C2，即料液比 1∶30（g/mL）、超聲時(shí)間 6 min、超聲功率450 W。此最優(yōu)組合恰好為正交試驗(yàn)表中的試驗(yàn)4（提取率最大），因此油莎豆粕水溶性多糖提取率為30.49% 。

2.3 油莎豆粕水溶性多糖紅外光譜分析

圖4為油莎豆粕水溶性多糖的紅外光譜圖。

圖4 油莎豆粕水溶性多糖紅外光譜Fig.4 FT-IR spectra of water-soluble polysaccharide of Cyperus esculentus meals

由圖4可知，位于3 384 cm-1附近較寬的吸收峰為O—H或分子間氫鍵的伸縮振動(dòng)，2 937 cm-1處為—CH2和—CH的C—H伸縮振動(dòng)，1 660 cm-1處強(qiáng)吸收峰歸因于結(jié)合水，1 415 cm-1處為C—H的彎曲振動(dòng)，均為多糖類物質(zhì)的特征峰。1 130、1 060、992 cm-1處的3個(gè)吸收峰可以證明多糖樣品含有吡喃環(huán)[18]，而916 cm-1處為典型的D-吡喃葡萄糖吸收峰，846 cm-1的吸收峰可以確定樣品含有α-糖苷鍵[19]，綜上說明油莎豆粕水溶性多糖是以α-吡喃糖為骨架的多糖。

2.4 油莎豆粕水溶性多糖抗氧化性分析

2.4.1 油莎豆粕水溶性多糖對DPPH自由基清除能力的影響

DPPH自由基作為一種比較穩(wěn)定的自由基，能快速地反映樣品的抗氧化性[20]。油莎豆粕水溶性多糖對DPPH自由基清除能力的影響見圖5。

圖5 VC與油莎豆粕水溶性多糖對DPPH自由基清除能力的影響Fig.5 The scavenging effect of VCand water-soluble polysaccharide of Cyperus esculentus meals on DPPH free radicals

由圖5可知，VC對DPPH自由基具有很強(qiáng)的清除能力，當(dāng)VC濃度為2 mg/mL時(shí)，清除效果已經(jīng)達(dá)到94% 。油莎豆粕水溶性多糖濃度在2mg/mL～6mg/mL時(shí)，多糖對DPPH自由基的清除率隨著多糖濃度的升高而增大，并且呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，當(dāng)濃度為6 mg/mL時(shí)，油莎豆粕水溶性多糖對DPPH自由基的清除率達(dá)到98.7% 。由此可見，油莎豆粕水溶性多糖對清除DPPH自由基有明顯的效果。經(jīng)分析，油莎豆粕水溶性多糖對DPPH自由基清除能力的IC50值為2.203 mg/mL，其IC50值小于10 mg/mL[21]，說明油莎豆粕水溶性多糖具有較好的抗氧化效果。

2.4.2 油莎豆粕水溶性多糖對羥自由基清除能力的影響羥自由基是生物系統(tǒng)中最具活性的自由基，能導(dǎo)致生物體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷，引發(fā)各種疾病，因此羥自由基的清除率是評價(jià)抗氧化性的重要指標(biāo)[22]。油莎豆粕水溶性多糖對羥自由基清除能力的影響見圖6。

圖6 VC與油莎豆粕水溶性多糖對羥自由基清除能力的影響Fig.6 The scavenging effect of VCand water-soluble polysaccharides of Cyperus esculentus meals on hydroxyl radicals

由圖6可以看出，油莎豆粕水溶性多糖在0.5mg/mL～1.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，羥自由基的清除率隨著多糖濃度的升高而逐漸增大，當(dāng)多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)，油莎豆粕水溶性多糖對羥自由基的清除率為30.0% ，濃度為1.5 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率增大到98.0% ，與該濃度下VC對羥自由基的清除能力比較接近，可見油莎豆粕水溶性多糖對羥自由基有明顯的清除效果。油莎豆粕水溶性多糖對羥自由基清除能力的IC50值為0.726 mg/mL。

2.4.3 油莎豆粕水溶性多糖對超氧陰離子自由基清除能力的影響

超氧陰離子自由基是生命代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的自由基[23]。油莎豆粕水溶性多糖對超氧陰離子自由基清除能力的影響見圖7。

圖7 VC與油莎豆粕水溶性多糖對超氧陰離子自由基清除能力的影響Fig.7 The scavenging effect of VCand water-soluble polysaccharide of Cyperus esculentus meals on superoxide anion radicals

由圖7可以看出，VC對超氧陰離子自由基具有很強(qiáng)的清除能力，當(dāng)VC濃度為2 mg/mL時(shí)，清除率已經(jīng)達(dá)到90% 。與VC相比，油莎豆粕水溶性多糖的濃度在2 mg/mL～6 mg/mL時(shí)，其對超氧陰離子自由基的清除率隨濃度增大而逐漸升高，從27% 上升到96.8% ，有明顯的線性趨勢。油莎豆粕水溶性多糖對超氧陰離子自由基清除能力的IC50值為3.228 mg/mL，對超氧陰離子自由基有較強(qiáng)的清除作用。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用超聲波輔助法提取油莎豆粕水溶性多糖，通過L9（33）正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，各因素影響油莎豆粕水溶性多糖提取率的大小順序?yàn)榱弦罕龋ˋ）＞超聲時(shí)間（B）＞超聲功率（C）。 油莎豆粕水溶性多糖的最佳提取工藝條件為料液比1∶30（g/mL）、超聲時(shí)間6 min、超聲功率450 W；在此工藝條件下，油莎豆粕水溶性多糖提取率為30.49% 。傅里葉變換紅外光譜分析表明，油莎豆粕水溶性多糖具有典型的α-吡喃糖特征吸收峰。此外，抗氧化試驗(yàn)初步驗(yàn)證了油莎豆粕水溶性多糖對DPPH自由基、羥自由基以及超氧陰離子自由基具有較強(qiáng)的清除能力，IC50值分別為2.203、0.726、3.228 mg/mL。油莎豆粕水溶性多糖可以作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)，具有一定的開發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值。