西蘭花莖果膠的提取及理化性質研究

讓鳳菊，王俊龍，劉偉，任家璇，歐陽艷

（伊犁師范大學化學與環境科學學院新疆維吾爾自治區教育廳普通高等學校重點實驗室，新疆 伊寧 835000）

果膠是一種結構復雜的天然高分子多糖，主要以α-1，4糖苷鍵連接半乳糖醛酸組成。根據酯化程度的不同，果膠可分為兩種：酯化度（degree of esterification，DE）值高于50% 的稱為高酯果膠（high methoxyl pection，HMP），低于50% 的則稱為低酯果膠（low methoxyl pection，LMP）[1]。因其具有良好的凝膠性、乳化性和抗氧化性等功能而被廣泛應用于食品醫藥行業[2]，被糧農組織和世界衛生組織[FAO（Food&Agriculture Organization）/WHO（World Health Organization）]聯合委員會認定為一種安全無毒的食品添加劑。作為可溶性膳食纖維，果膠表現出一定的藥理活性，如降膽固醇水平、降糖及減肥[3]，提高人體免疫能力和抗癌[4]等。目前，國內果膠的產能受制于原料問題，大部分需要靠進口解決，且成本昂貴，近年來，從農副產品的生產廢料中尋找新果膠來源已成為研究熱點。如葡萄渣[5]、可可豆莢[6]和香蕉皮[7]、西紅柿渣[8]、火龍果皮[9]等等。

西蘭花，又名西藍花（Brassica oleracea L.var.Italica），是為十字花科蕓薹屬一年生植物，因其營養豐富，富含多種活性成分，備受研究者關注。近年來，隨著國際市場對西蘭花的需求量的增大，國內西蘭花的產量日益增加，2017年產量己超過1 044萬t，占世界西蘭花總產量的40.2% ，居世界第一。西蘭花的食用部分是花球，占其總重量的25% ～40% ，根莖部分則被視為廢棄物而丟棄，造成環境的污染和資源的浪費。因此研究這些廢棄物再利用既有較大經濟效益，又能減少環境污染。

目前有關西蘭花的活性成分研究多集中在硫代葡萄糖苷[10-12]，而關于果膠的研究較少[13-14]。本試驗采用正交試驗優化西蘭花莖果膠提取工藝，測定了果膠的理化性質、表觀結構，以期為西蘭花果膠的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花莖：餐廳；檸檬酸、乙酸、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、酚酞、無水乙醇（均為分析純）：上海士峰生物科技有限公司；咔唑、半乳糖醛酸：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2500紫外可見分光光度計、傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）：日本島津分析儀器廠；heidolph旋轉蒸發儀：上海鉑鱗貿易儀器；BSA124S電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；JSM-7500F掃描電鏡：日本電子株式會社；LGJ-10N冷凍干燥機：北京亞星儀科科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原材料預處理

將回收的西蘭花莖洗凈、切片，在80℃～100℃水中煮沸2 min～3 min滅酶，將滅酶后的西蘭花莖放入烘箱中90℃烘干，粉碎，過40目篩備用。

1.3.2 果膠提取工藝流程

精確稱取一定質量西蘭花莖粉末于燒杯中，加入稀鹽酸溶解，調節適當pH值，置于一定溫度的恒溫水浴鍋中加熱一定時間，趁熱用四層紗布過濾，將濾液旋轉蒸發濃縮，以粗果膠提取液的2倍的量加入95% 乙醇，置于冰箱中冷藏過夜，用紗布靜置過濾后得粗果膠，將其置于烘箱中80℃烘干，干燥，稱量粗果膠重量，計算粗果膠的得率。

1.3.3 西蘭花莖果膠提取單因素試驗

1.3.3.1 不同酸對果膠得率的影響

按照1.3.2提取果膠的工藝流程，在料液比為1∶20（g/mL）、提取溫度為 80 ℃、pH 值為 2.0、提取時間60 min條件下，分別用鹽酸、硫酸、檸檬酸、磷酸、乙酸提取西蘭花莖果膠，比較果膠得率，確定最佳提取劑。

1.3.3.2 不同pH值對果膠得率的影響

以鹽酸為提取劑，在料液比為 1∶20（g/mL）、提取溫度為80℃、提取時間60 min條件下，調節pH值分別為 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5， 按照 1.3.2 提取果膠的工藝流程提取果膠，比較不同pH值下果膠得率。

1.3.3.3 不同料液比對果膠得率的影響

以鹽酸為提取劑，在pH值為1.5、提取溫度為80℃、提取時間為60 min條件下，調節料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），按照 1.3.2 提取果膠，比較不同料液比下西蘭花莖果膠得率。

1.3.3.4 不同提取溫度對果膠得率的影響

以鹽酸為提取劑，在 pH1.5、料液比為 1∶25（g/mL）、提取時間為60 min條件下，調節提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃，按照 1.3.2 提取果膠，比較不同溫度下西蘭花莖果膠得率。

1.3.3.5 不同提取時間對果膠得率的影響

以鹽酸為提取劑，在 pH1.5、料液比為 1∶25（g/mL）、提取溫度為90℃條件下，調節提取時間分別為35、50、65、80、95 min，按照 1.3.2 提取果膠，比較不同提取時間下西蘭花莖果膠得率。

1.3.4 正交試驗優化西蘭花莖果膠提取工藝

在單因素試驗的基礎上，以pH值、料液比、提取溫度、提取時間為考察因素，果膠的得率為指標，進行正交試驗，優化西蘭花莖果膠提取的最佳工藝參數。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factor level of orthogonal test

1.3.5 西蘭花果膠得率的計算

西蘭花果膠得率按式（1）計算。

式中：P為果膠得率，% ；m為提取得到的粗果膠質量，g；W為西蘭花莖粉末質量，g。

1.3.6 西蘭花理化性質指標的測定

1.3.6.1 半乳糖醛酸含量

標準曲線的繪制：參考侯彩云[15]和侯玉婷等[16]的方法略微改動，稱取0.100 g D-半乳糖醛酸標準品于水中溶解，在100 mL容量瓶中定容混合均勻得到半乳糖醛酸標準品。用移液槍移取不同體積標準溶液分別注入10 mL容量瓶中定容，得到不同質量濃度半乳糖醛酸標準溶液。依次取1 mL上述半乳糖醛酸標準溶液于50 mL比色管中，再加入一定體積的濃硫酸，在100℃加熱20 min，降溫至室溫后分別加入0.15% 咔唑-乙醇溶液，在暗處顯色1 h，在528 nm出測定其吸光度，以半乳糖醛酸質量濃度為橫坐標（x），以吸光度為縱坐標（y），繪制標準曲線。得標準曲線回歸方程：y=0.018 2x-0.019 8，R2=0.999 3。

果膠半乳糖醛酸含量的測定：按照1.3.2提取一定量果膠，參照上述比色法測定吸光度，并依據式（2）計算西蘭花樣品中半乳糖醛酸含量（GA）。

式中：m1為標準曲線方程計算出的每毫升稀釋液中所含半乳糖醛酸的含量，mg/mL；v為西蘭花果膠提取液體積，mL；k為西蘭花莖果膠提取液稀釋倍數；m2為所稱取的西蘭花莖果膠粉末的質量，g。

1.3.6.2 西蘭花莖果膠溶解度的測定

參考鄒榮[17]的方法并改進，取果膠樣品0.5 g，加入75 mL蒸餾水，于40℃下振蕩2 h，懸浮液離心（5 000 r/min，15 min），取上清液，置于 105℃烘箱中烘至恒重，按式（3）計算果膠溶解度。

式中：S為溶解度，% ；M1為西蘭花莖果膠的原始質量，g；M2為西蘭花莖果膠恒重后質量，g。

1.3.6.3 西蘭花莖果膠灰分含量的測定

根據GB 25533—2010《食品安全國家標準食品添加劑果膠》[18]中灰分的測定方法分析西蘭花中灰分含量。按式（4）計算灰分含量。

式中：m1為坩堝和果膠樣品總質量，g；m2為灰化的坩堝和粗果膠質量，g；m0為西蘭花莖果膠的質量，g。

1.3.6.4 西蘭花果膠酸不溶物的測定

參考辛明等[19]的方法，根據干燥后濾渣的質量計算西蘭花莖中果膠酸不溶物的含量，按式（5）計算果膠酸不溶物含量。

式中：m1為西蘭花果膠濾渣恒重質量，g；m0為西蘭花果膠的質量，g。

1.3.6.5 西蘭花莖果膠pH值的測定

用熱蒸餾水配制0.1% 西蘭花莖果膠溶液，冷卻至室溫后，用pH計測定其果膠的pH值。

1.3.6.6 西蘭花莖果膠酯化度的測定

西蘭花果膠酯化度的測定方法參考郭興峰等[20]的方法。稱取西蘭花果膠提取物0.5 g左右，先加少量濃度為95% 的乙醇將其潤濕，再加少量的熱蒸餾水溶解。待西蘭花莖的果膠完全溶解后，滴加2滴酚酞指示劑，再加入0.1 mol/L的NaOH溶液，滴定至剛有顏色變化時記錄下NaOH溶液消耗體積（V1）。在西蘭花莖果膠溶液中再加入10 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液混勻，酯化反應2 h，加入0.1 mol/L的HCl溶液10 mL，最終再使用1 mol/L的NaOH溶液滴定至溶液剛有顏色變化，記錄NaOH消耗的溶液的體積（V2），西蘭花莖的酯化度（DE）按照式（6）計算。

1.3.7 西蘭花果膠的純化

參照張士凱等[21]果膠純化方法，在西蘭花莖的粗果膠中加入95% 的乙醇，使用磁力攪拌器以500 r/min攪拌20 min使雜質溶出，然后以5 000 r/min離心10 min去上清液收集沉淀，使用95% 乙醇重復上述步驟3次，以此保證可以獲得較為純凈的果膠。使用95% 乙醇洗滌所獲得的果膠沉淀，靜置使乙醇揮發，再用少量蒸餾水溶解，裝入3 500 Da的透析袋中，以蒸餾水為透析液透析24 h，每4 h更換一次透析液。純化后的果膠冷凍干燥24 h后備用。

1.3.8 西蘭花果膠掃描電鏡測定

根據王文駿[22]的方法并加以改進優化，取適量冷凍干燥的西蘭花莖果膠，用瑪瑙研缽將其研磨成粉末，檢驗粉末無磁性后，將其放到樣品臺的雙面膠上并涂薄金層，用10 kV的加速電壓掃描電鏡拍攝樣品的形貌特征，放大倍數為13 000倍。

1.3.9 西蘭花果膠紅外光譜的測定

參考王煒清等[23]的方法測定，稱取質量為0.100 g的溴化鉀粉末，西蘭花莖果膠粉末0.001 g，將二者混合均勻，用瑪瑙研缽研磨5 min。將研磨好的混合物樣品置于60℃干燥箱里干燥1 h，制成透明壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀于400 cm-1～4 000 cm-1范圍內進行光譜掃描。

1.4 數據處理

所有試驗均重復3次，結果用平均值±標準差表示。運用Microsoft Excel 2016進行數據處理。用Origin 8.0軟件繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取酸的選擇

以西蘭花果膠得率、半乳糖醛酸含量為指標，用鹽酸、硫酸、檸檬酸、磷酸、乙酸提取果膠，結果見圖1。

圖1 不同酸對果膠得率及半乳糖醛酸含量的影響Fig.1 Effect of different acids on pectin yield and galactolic acid content

由圖1可知，檸檬酸組的果膠得率最多，為5.80% ；磷酸、乙酸較少不考慮；鹽酸組果膠得率為4.75% ，而硫酸組果膠得率為4.82% ，二者差別不大，但是用硫酸提取出的果膠顏色較深；通過比較鹽酸、檸檬酸提取粗果膠中半乳糖醛酸的含量發現，檸檬酸為提取劑果膠產率高但其半乳糖醛酸含量較低，為32.27% ，鹽酸的半乳糖醛酸含量為56.54% ；綜上，選用鹽酸作為提取劑。

2.1.2 pH值對果膠得率的影響

pH值對果膠得率的影響見圖2。

圖2 pH值對果膠得率的影響Fig.2 Effect of pH value on the yield of pectin

由圖2可知，西蘭花果膠得率隨著pH值的升高先增加后減小，在pH2.0時果膠得率最大，為4.60% ，后又緩慢上升。這可能是酸度增強有利原果膠的水解，使更多的原果膠轉化為水溶性的果膠，但當pH小于2.0時，果膠得率較低，原因是溶液中的水溶性果膠在強酸條件下會進一步脫脂裂解，從而使果膠得率下降。所以，較適合的pH值為2.0。

2.1.3 料液比對果膠得率的影響

料液比對果膠得率的影響如圖3所示。

圖3 料液比對果膠得率的影響Fig.3 Effect of feed-liquid ratio on the yield of pectin

由圖3可知，隨著提取溶劑的逐漸增加，果膠得率先增大后減小。由于果膠在水中的溶解度較小，當提取溶劑用量較小時，果膠分子不能很好的擴散溶出，導致果膠得率不高；而提取溶劑用量過多，增加后續濃縮時間，醇沉成本，綜合考慮，選擇料液比1∶20（g/mL），進行后續試驗。

2.1.4 提取溫度對果膠得率的影響

提取溫度對果膠得率的影響結果如圖4所示。

圖4 提取溫度對果膠得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of pectin

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，果膠產率先降低后增大最后降低，當提取溫度升高至90℃時，果膠的產率最高，為5.73% 。提取溫度影響物質的擴散系數、大分子溶液的黏度以及某些物質的溶解度，較高的提取溫度可以降低體系的黏度，加快傳質速率，提高果膠多糖的溶解度，從而提高果膠的得率。但是過高的提取溫度，又會導致糖苷鍵水解，故選擇提取溫度90℃進行后續試驗。

2.1.5 提取時間對果膠得率的影響

提取時間對果膠得率的影響如圖5所示。

圖5 提取時間對果膠得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of pectin

由圖5可知，隨著提取時間不斷延長，果膠產率先降低后增加再降低。可能是由于提取時間過長，將果膠溶解為更小的分子而被過濾，使果膠的產率降低。因此選提取時間80 min進行后續試驗。

2.2 正交試驗結果

西蘭花莖果膠提取工藝正交試驗結果如表2所示。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

由表2可知，由極差R分析得到4個因素中，影響果膠得率的順序是提取溫度＞提取時間＞pH值＞料液比。由K值得到最佳的工藝組合為A1B3C3D2，即最佳工藝條件：pH1.5，料液比 1∶25（g/mL），提取溫度 90℃，提取時間80 min。在最佳提取條件下對西蘭花莖果膠得率進行驗證，平均果膠得率為9.42% 。

2.3 西蘭花莖果膠的理化性質

西蘭花莖果膠的理化性質如表3所示。

表3 西蘭花莖果膠的理化性質Table 3 Physical and chemical properties of pectin extracted from broccoli stalk

由表3可知，采用酸水法提取的西蘭花莖果膠的溶解度、半乳糖醛酸含量，符合GB 25533—2010《食品安全國家標準食品添加劑果膠》的有關規定。所提取果膠的酯化度為46.70% ，屬于低酯化果膠（DE＜50% ）。低酯果膠形成凝膠時不受體系pH值和可溶性固形物含量影響，可以用于低糖、無糖食品的增稠劑[24]。與COR相比，pH值、灰分和酸不溶物含量指標差距較大，推斷是西蘭花莖中無機物的含量較高或粗果膠提取純化工藝有待改進。

2.4 西蘭花莖果膠的掃描電鏡圖

果膠樣品的掃描電鏡圖見圖6。

圖6 果膠樣品的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopy（SEM）of pectin samples

由圖6可知，13 000倍電鏡下西蘭花莖果膠（Brassica oleracea L.pectin，BOP）與商品橘子皮果膠（commercial orange pectin，COR）相對照，可以看出西蘭花莖果膠和商品果膠均為片狀結構，但商品果膠排列的更加緊密、縫隙小，西蘭花莖果膠的片層相比于商品果膠更大，排列也不緊密，有較多的縫隙。果膠來源、提取方法以及后期處理方法的不同都會造成其表觀顆粒形態的差異。

2.5 紅外光譜

FTIR測定結果如圖7所示。果膠的得率為9.42% ；所得果膠為低酯果膠，其半乳糖醛酸含量，溶解度達到國家標準，灰分和酸性不溶物質含量較高，且有待進一步純化。

圖7 果膠樣品FTIR譜圖Fig.7 The FTIR spectrum of pectin

由圖7可知，兩種果膠在4 000 cm-1～400 cm-1處輪廓基本一致，均有糖類[25]的特征吸收峰，說明兩種果膠多糖的類型基本相同。3 422 cm-1處峰來自—OH的伸縮振動，在2 918 cm-1處是—CH2的吸收峰，為C—H伸縮振動，在2 350 cm-1處為CO2雜質的吸收峰。在1 740 cm-1吸收峰是酯化的羧基官能團（—COOR）C—O的伸縮振動，1 648 cm-1附近的吸收峰為自由羧基官能團（—COO）CO的非對稱伸縮運動，這兩個吸收峰是果膠多糖特征峰，說明提取多糖為果膠多糖[26]。BOP在1 740 cm-1處左右處的吸收峰低于1 648 cm-1左右處的吸收峰[27]，代表著此樣品是低酯果膠。兩種果膠在800 cm-1～1 300 cm-1處的吸收峰有差異，表明兩種果膠在結構和單糖組成上有差異。

3 結論

本研究采用傳統酸提醇沉法獲取西蘭花廢棄莖果膠，并初步探究其理化性質。首先以西蘭花莖果膠的得率為指標，考察酸的種類、pH值、料液比、提取溫度、提取時間等因素對其的影響，并在此基礎上進行正交試驗，得出最佳工藝條件：pH1.5，料液比 1∶25（g/mL），提取溫度90℃，提取時間80 min，此條件下驗證試驗