火麻籽粕多酚微波輔助提取工藝及其抗氧化活性

孫曉波，劉衛萍，王小明，張鵬，郭松*

（1.廣西科技師范學院食品與生化工程學院，廣西 來賓 546199；2.廣西科技師范學院壯瑤藥品質生物學重點實驗室，廣西 來賓 546199）

火麻又稱工業大麻、漢麻，系桑科大麻屬一年生草本植物，在我國主要種植于廣西、云南、四川、黑龍江、甘肅等地。火麻應用價值高，火麻莖皮纖維含量豐富常用于造紙。火麻籽作為一種藥食同源食材，含有豐富的蛋白質、油脂、碳水化合物、膳食纖維以及礦物質等[1-2]。火麻油是火麻籽經壓榨或浸出提取而得，是世界上少數能夠溶于水的植物油料，火麻油含有人體必需脂肪酸、多種礦物元素、植物甾醇等，其中不飽和脂肪酸中亞油酸和亞麻酸比例在3.5∶1左右，是一種脂肪酸組成平衡的高品質油脂[3]。近年研究發現，作為“長壽之鄉”廣西巴馬地區主要植物類食用油，火麻油能有效降低人體內脂質過氧化物含量，具有降血脂、預防心腦血管疾病等功效，此外還能促進兒童和青少年大腦發育，是一種新型功能性油脂[4-5]。火麻籽榨油后得到大量的火麻籽粕，其富含的火麻蛋白含有多種人體必須氨基酸，是一種優質植物蛋白質[6]。Shen等[7]研究表明體外模擬火麻蛋白消化率能夠達到90% 左右，媲美大豆蛋白，其水解肽具有多種保健作用。

近年來，圍繞火麻籽粕的研究主要集中于火麻蛋白提取和火麻蛋白產品開發[8-10]，鮮見有關火麻籽粕多酚提取及其抗氧化活性的報道。目前從植物中提取多酚方式多樣，其中微波輔助提取是向原材料中加入適合溶劑并置于微波反應儀中，該技術利用了微波能的優勢，與傳統浸提方法相比具有耗時短、浸提液受熱均勻、節省溶劑、操作簡便等優點。本文以火麻籽粕為原料，采用微波輔助提取技術結合響應面模型分析，考察乙醇體積分數、微波功率、微波時間對火麻籽粕多酚提取量的影響，并評價其抗氧化活性，旨在為火麻籽粕資源的開發利用以及火麻籽粕多酚提取物作為天然食品抗氧化劑的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火麻籽粕：市售；沒食子酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、L-抗壞血酸（VC）（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、三氯乙酸（分析純）：成都市科隆化學品有限公司；石油醚、無水碳酸鈉、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、鹽酸、30% 過氧化氫（分析純）：四川西隴科學股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）（純度>98% ）、福林酚試劑（生物試劑）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

多功能粉碎機（FW-135）：天津市泰斯特儀器有限公司；紫外-可見分光光度計（UV-9600）：北京瑞利分析儀器有限公司；電腦微波催化合成/萃取儀（XH-100B）：北京祥鵠科技發展有限公司；電子分析天平（FA2004）：上海舜宇橫平科學儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（GZX-GF101-3BS）：上海躍進醫療器械有限公司；循環水多用真空泵（SHZ-D（Ш））：鞏義市科瑞儀器有限公司；旋轉蒸發儀（R-1001VN）：鄭州長城科工貿有限公司；臺式低速自動平衡離心機（TDZ4-WS）：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 火麻籽粕粉末的制備流程

火麻籽粕除雜→恒溫烘箱（45℃）烘干至恒重→粉碎過80目篩→石油醚中回流脫脂（50℃）→過濾收集濾渣→再次恒溫干燥至恒重（45℃）→粉碎過80目篩→密封后干燥儲存備用。

1.3.2 火麻籽粕多酚的測定

1.3.2.1 沒食子酸標準曲線的繪制

準確配制0.1 mg/mL沒食子酸標準溶液（準確稱量沒食子酸25 mg，蒸餾水溶解定容至250 mL），分別移取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 上述標準溶液于10 mL具塞比色管，加入1.0 mL福林酚顯色劑，靜置顯色反應6 min后，加入2.0 mL 7.5% 碳酸鈉溶液，定容后避光反應2 h，以空白試劑為參比溶液，在765 nm波長處測定其吸光度，得到標準曲線回歸方程為A＝128.89C-0.037 9（R2＝0.999 5），式中：A 為沒食子酸吸光度；C為沒食子酸質量濃度，mg/mL。

1.3.2.2 火麻籽粕多酚含量的測定

準確稱取1.0 g脫脂后火麻籽粕粉末于磨口錐形瓶中，加入適量的乙醇溶液，然后將其置于微波合成儀中，連上冷凝管，進行微波提取，之后去除濾渣將濾液定容至100 mL，即得到火麻籽粕多酚提取液。準確移取0.8 mL上述提取液，按1.3.2.1顯色方法測定其吸光度。按下式計算火麻籽粕多酚提取量。

式中：ρ為提取液中多酚質量濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；N為稀釋倍數；M為火麻籽粕粉末質量，g。

1.3.3 單因素試驗設計

其它試驗條件固定情況下，分別探究不同乙醇體積分數（30% 、40% 、50% 、60% 、70% ）、 不同微波功率（200、300、400、500 、600 W）、不同微波時間（1、2、3、4、5 min）、不同微波溫度（40、50、60、70、80 ℃）、不同液料比[30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）]下火麻籽粕多酚的提取量，確定最佳單因素工藝條件。

1.3.4 響應面優化試驗設計

對上述單因素試驗結果進行方差分析，根據方差分析結果中F值大小挑選出3個較大影響因素，分別為乙醇體積分數（A）、微波功率（B）、微波時間（C），以火麻籽粕多酚為評價指標設計響應面試驗，確定最佳火麻籽粕多酚提取工藝條件。響應面試驗設計因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 火麻籽粕多酚抗氧化活性測定

以火麻籽粕多酚對DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、鐵離子還原能力來評價其抗氧化活性，分別參考秦晶晶等[11]、謝佳函等[12]、裴斐等[13]、黎克純等[14]方法進行測定，并以L-抗壞血酸溶液作為對照。

1.4 數據處理

以上所有試驗均重復3次，采用SPSS 19.0對單因素數據進行方差分析，采用Origin 2018對單因素和抗氧化試驗繪圖，采用Design-Expert 8.0.6設計響應面試驗并對試驗結果進行回歸分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數的確定

不同乙醇體積分數下火麻籽粕多酚的提取量見圖1。

圖1 不同乙醇體積分數下多酚的提取量Fig.1 The polyphenols extraction amount under different ethanol volume fraction

由圖1可知，火麻籽粕多酚提取量在乙醇體積分數為60% 時達到峰值，為5.24 mg/g，原因可能是乙醇體積分數為60% 時，提取液極性接近于火麻籽粕中多酚極性，根據相似相溶原理，多酚在此濃度乙醇溶液中溶解度最大，因而提取量最大。當乙醇體積分數超過60% 后，多酚提取量下降較為顯著（P＜0.05），原因主要是當乙醇體積分數過大時，由于溶劑極性降低導致植物蛋白質變性，使植物細胞中多酚類物質向提取液中的擴散阻力增大，因而提取量顯著下降[15]。因此，響應面優化試驗的乙醇體積分數選擇50% 、60% 、70% 。

2.1.2 微波功率的確定

不同微波功率下火麻籽粕多酚的提取量見圖2。

圖2 不同微波功率下多酚的提取量Fig.2 The polyphenols extraction amount under different microwave power

由圖2可知，隨著微波功率由200W增大至300W，火麻籽粕多酚提取量顯著增大（P＜0.05）；在300 W時提取量達到峰值，為5.69 mg/g；之后繼續增大微波功率多酚提取量開始降低。這可能是由于增大微波功率會使火麻籽粕細胞內分子振動加快，分子間碰撞增多，因而導致多酚溶出增多，但過大的微波功率可能會破壞多酚分子結構[16]。微波功率在400 W～600 W時，多酚提取量差異不再顯著（P＞0.05）。因此，響應面優化試驗的微波功率選擇200、300、400 W。

2.1.3 微波時間的確定

不同微波時間下火麻籽粕多酚的提取量見圖3。

圖3 不同微波時間下多酚的提取量Fig.3 The polyphenols extraction amount under different microwave time

由圖3可知，隨著微波時間的不斷延長火麻籽粕多酚提取量增大較為顯著（P＜0.05）；提取量在微波時間為3 min時達到峰值，為5.68 mg/g；當微波時間超過3 min后，火麻籽粕多酚提取量開始逐步減少（P＜0.05）。原因可能是微波時間過短，火麻籽粕細胞中多酚溶出不完全；微波時間過長，細胞中其他醇溶性雜質溶出增多，且長時間的微波處理可能會破壞某些多酚類化合物的分子結構[17]。因此，響應面優化試驗的微波提取時間選擇 2、3、4 min。

2.1.4 微波溫度的確定

不同微波溫度下火麻籽粕多酚的提取量見圖4。

圖4 不同微波溫度下多酚的提取量Fig.4 The polyphenols extraction amount under different microwave temperature

由圖4可知，微波溫度在40℃～80℃時，對火麻籽粕多酚提取量的影響不太明顯；微波溫度在50℃時，多酚提取量達到峰值，為5.72 mg/g；微波溫度超過50℃后，多酚提取量開始緩慢降低。這可能是因為火麻籽粕中某些多酚類化合物穩定性受溫度影響敏感，較高溫度下容易被分解，導致多酚提取量不升反降[18]。因此，響應面優化試驗的微波溫度選擇50℃。

2.1.5 液料比的確定

不同液料比條件下火麻籽粕多酚的提取量見圖5。

圖5 不同液料比下多酚的提取量Fig.5 The polyphenols extraction amount under different liquidmaterial ratio

由圖5可知，在一定液料比范圍內火麻籽粕多酚提取量隨著液料比的不斷加大呈現顯著增大趨勢（P＜0.05）；多酚提取量在液料比為 50∶1（mL/g）時達到峰值，為5.84 mg/g；之后繼續增大液料比，火麻籽粕多酚提取量逐步減少（P＜0.05）。原因主要是液料比較小時，火麻籽粕粉末與提取液接觸不夠充分，固液間傳質動力較小，影響細胞中多酚類物質的溶出[19-20]；液料比為50∶1（mL/g）時，火麻籽粕多酚已基本溶出完全，繼續增大提取液體積不僅導致溶劑浪費，還會增大某些醇溶性雜質的溶解，影響火麻籽粕多酚的提取。因此，響應面優化試驗的液料比選擇50∶1（mL/g）。

2.2 響應面工藝優化

2.2.1 回歸模型建立及顯著性檢驗

響應面優化火麻籽粕多酚提取工藝試驗結果見表2。

表2 響應面分析試驗設計及結果Table 2 The analysis results of response surface experiment

采用Design expert 8.0.6軟件對表2數據進行回歸分析，得出火麻籽粕多酚提取量（Y）與乙醇體積分數（A）、微波功率（B）、微波時間（C）3個自變量因素之間的二次多項式回歸方程：Y=5.87-0.064A+0.016B+0.030C+0.017AB-0.025AC+0.045BC-0.17A2-0.11B2-0.088C2，回歸方程方差分析結果見表3。

表3 回歸方程方差分析結果Table 3 The results of regression equation variance analysis

由表3中方差分析結果可知，該模型F值為118.82、P＜0.000 1，模型差異極顯著，失擬項 P=0.829 6＞0.05，差異不顯著，說明所建模型受其他因素影響較小，回歸方程能較好的預測出火麻籽粕多酚提取量；相關系數R2=0.993 5，說明在所選試驗范圍內真實值與預測值擬合良好。從F值大小可以得出，各因素對火麻籽粕多酚提取量的影響由大到小依次為A＞C＞B。其中一次項 A、C、交互作用項 BC、二次項 A2、B2、C2對火麻籽粕多酚提取量有極顯著影響（P＜0.01），一次項B、交互作用項AC有顯著影響（P＜0.05），交互作用項AB無顯著性影響（P＞0.05），由此看出火麻籽粕多酚提取量與各因素間不是單純線性關系。

2.2.2 響應面試驗各因素間交互作用分析

在響應面三維立體圖和等高線圖中，某因素方向響應面陡峭說明其對多酚提取量影響較大，反之則影響較小；等高線呈橢圓，說明因素間交互作用明顯，反之則交互作用不明顯[21-22]。響應面試驗各因素間交互作用分析結果見圖6。

圖6 各因素響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of various factors

由圖6所示，各響應面曲面開口向下且曲面上均存在最大響應值。A（乙醇體積分數）曲面較其他因素曲面陡峭，說明3個因素中A因素對火麻籽粕多酚提取量影響最明顯。交互項AC、BC等高線呈橢圓形，說明乙醇體積分數和微波時間、微波功率和微波時間交互作用顯著；交互項AB等高線接近圓形，說明乙醇體積分數和微波功率交互作用不顯著。

2.2.3 驗證試驗

由回歸模擬方程得出火麻籽粕多酚最優提取工藝參數為乙醇體積分數58.02% ，微波功率310.99 W、微波時間3.23 min，此時火麻籽粕多酚提取量的預測值為5.88 mg/g。實際操作過程中結合試驗操作便利性，設定乙醇體積分數58% 、微波功率311 W、微波時間 3.2 min，同時，固定最優液料比 50∶1（mL/g）、微波溫度50℃，重復3次驗證試驗得出火麻籽粕多酚實際提取量為5.86 mg/g，與理論提取量相對誤差僅為0.34% ，說明模型擬合良好，工藝可靠。

2.3 火麻籽粕多酚抗氧化試驗結果

2.3.1 DPPH自由基清除能力

火麻籽粕多酚和VC對DPPH自由基的清除能力見圖7。

圖7 火麻籽粕多酚和VC對DPPH自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of DPPH radicals by polyphenols from hemp seed meal and VC

如圖7所示，在0.003 mg/mL～0.03 mg/mL濃度范圍內，火麻籽粕多酚對DPPH自由基的清除率隨著溶液濃度的增大而明顯增大；在0.03 mg/mL～0.05 mg/mL濃度范圍之間，火麻籽粕多酚的清除率逐步趨于平穩；溶液濃度為0.05 mg/mL時，火麻籽粕多酚和VC對DPPH自由基的清除率分別為94.63% 、74.57% ，經計算得出二者的半數抑制濃度（IC50值）分別為0.012、0.033 mg/mL，表明此濃度范圍內，火麻籽粕多酚對DPPH自由基有較強的清除能力，且清除效果優于VC。

2.3.2 羥基自由基清除能力

火麻籽粕多酚和VC對羥基自由基的清除能力見圖8。

圖8 火麻籽粕多酚和VC對羥基自由基的清除率Fig.8 Scavenging rate of hydroxyl radicals by polyphenols from hemp seed meal and VC

如圖8所示，在0.02 mg/mL～0.2 mg/mL濃度范圍內，隨著火麻籽粕多酚濃度的增大，其對羥基自由基的清除能力明顯增強；溶液濃度為0.2 mg/mL時，火麻籽粕多酚和VC對羥基自由基的清除率分別為94.93% 、20.10% ，經計算得出二者的IC50值分別為0.080、0.33 mg/mL，表明火麻籽粕多酚清除羥基自由基的能力遠大于VC。

2.3.3 超氧陰離子自由基清除能力

火麻籽粕多酚和VC對超氧陰離子自由基的清除能力見圖9。

圖9 火麻籽粕多酚和VC對超氧陰離子自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of superoxide anion radicals by polyphenols from hemp seed meal and VC

如圖9所示，在0.02 mg/mL～0.20 mg/mL濃度范圍內，火麻籽粕多酚對超氧陰離子自由基清除能力隨其濃度的增大而明顯增強，而當濃度大于0.20 mg/mL后，清除能力增強不再明顯；相同濃度范圍內，VC的清除能力增強相對緩慢，清除效果明顯低于同濃度火麻籽粕多酚。火麻籽粕多酚對超氧陰離子自由基清除率的IC50值為0.10 mg/mL，表明火麻籽粕多酚對超氧陰離子自由基有較強的清除能力。

2.3.4 鐵離子還原能力

火麻籽粕多酚和VC對鐵離子還原能力見圖10。

圖10 火麻籽粕多酚和VC對鐵離子還原能力Fig.10 Ferric reducing ability of polyphenols from hemp seed meal and VC

如圖10所示，隨著火麻籽粕多酚濃度的增大，其對鐵離子的還原能力明顯增強，且火麻籽粕多酚還原能力整體高于VC。在0.02 mg/mL～0.23 mg/mL濃度范圍內，將溶液濃度（Y）和還原能力（X）線性擬合，得出火麻籽粕多酚和VC的擬合方程分別為Y1=6.469X1+0.165 6（R2=0.979 4）、Y2=6.690X2+0.030 2（R2=0.992 3）。表明火麻籽粕多酚和VC對鐵離子的還原能力在一定濃度范圍內呈現良好線性正相關，火麻籽粕多酚還原能力大于VC。

3 結論

以廣西巴馬地區火麻籽粕為原材料，采用微波輔助法并運用響應面模型進一步優化火麻籽粕中多酚的提取工藝。在最優工藝參數乙醇體積分數58% 、微波功率311 W、微波時間3.2 min、微波溫度50℃、液料比50∶1（mL/g）條件下，火麻籽粕多酚實際提取量為5.86 mg/g，與理論提取量相對誤差僅為0.34% 。火麻籽粕多酚對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有較強的清除能力，IC50值分別為0.012、0.080、0.10 mg/mL，清除能力大于VC；同時還具有較強的還原能力。抗氧化試驗結果表明：火麻籽粕多酚具有較強的抗氧化能力，可作為天然抗氧化劑應用于食品領域。