利用氧化石墨烯納米片構建黃曲霉毒素B1熒光快速檢測方法

葉華，劉洪順，俞玥，李占明，鐘建軍，郭元新

（江蘇科技大學糧食學院，江蘇 鎮江 212100）

黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產生的有毒次級代謝物，具有分布廣、毒性強的特點，常污染花生、核桃、玉米等產品[1-3]，嚴重威脅人體健康，已被世界衛生組織列為Ⅰ類致癌物質[4]。為保障食品安全和人體健康，世界各國都對AFB1在食品中的含量制定了最高限量標準，其中歐盟最為嚴格，將花生中AFB1最高限量標準定為2 mg/kg，新加坡和日本的最高限量標準分別設置為5 mg/kg和10mg/kg[5]。我國標準GB2761—2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》將花生中AFB1最高限量標準設置為20mg/kg[6]。因此，開發食品中黃曲霉快速檢測方法對食品安全監控和人體健康保障具有重要意義。傳統的真菌毒素檢測方法主要有高效液相色譜法[7-8]、質譜法[9]等，存在儀器設備昂貴、操作技術要求高、檢測費時等不足[10-11]；近年來發展的免疫分析法雖然具有靈敏度高、特異性強的優點，但同樣存在抗體制備繁瑣耗時、免疫反應需要多步遞進和反復洗滌以及成本高等缺點[12-14]。

核酸適配體，又稱“化學抗體”，是一種能折疊成特定的三維結構，以較高親和力和特異性識別各種靶標分子的單鏈寡核苷酸序列，通常通過體外合成技術——指數富集配體系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX） 制備獲得，無需動物實驗，合成方便且制備成本低[15-16]。作為一種新型分子識別探針，在食品安全檢測尤其是真菌毒素檢測方面受到廣泛關注和研究[17-18]。Zhu等[19]利用核酸適配體作為分子探針構建了一種雙競爭橫向測流試紙條并成功用于多種食品和飼料樣品中黃曲霉毒素的檢測。Geleta等[20]合成了一種還原氧化石墨烯/二硫化鉬/聚苯胺納米復合材料，并以此構建了一種電化學適配體傳感器，該傳感器對AFB1具有較好的選擇性、靈敏性和穩定性。

氧化石墨烯（graphite oxide，GO）是石墨烯的氧化產物，由于其合成方便、具有較好的親水性、分散性以及卓越的熒光猝滅能力，在食品安全檢測領域得到了廣泛應用[21-22]。本試驗以AFB1為檢測對象，利用氧化石墨烯納米片建立一種熒光核酸適配體生物傳感器，通過優化試驗條件應用于花生樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生米：市售。黃曲霉毒素核酸適配體TAF序列具體為 5'-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3'[23]，其 5'端標記有四甲基羅丹明（tetramethylrhodamine，TAMRA）熒光基團，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和純化（HPLC級）。黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、伏馬菌素（fumonisin B1，FB1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）：青島普瑞邦生物工程有限公司；氧化石墨烯水溶液：江蘇先豐納米材料科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷、氯化鉀、氯化鈉、氯化鈣、六水合氯化鎂：上海麥克林生化科技有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Spectra Max i3多功能酶標儀：美國Molecular Devices公司；HR-AFM原子力顯微鏡：美國AFM Workshop公司；Centrifuge 5427 R冷凍高速離心機：德國艾本德eppendorf公司；RS-FS1401多功能粉碎機：合肥榮事達小家電有限公司；PHS-25型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；Medium-e400 up超純水儀：上海和泰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 氧化石墨烯濃度優化

分別取100 nmol/L核酸適配體溶液200 μL加入到等體積不同濃度氧化石墨烯溶液中（0、5、10、20、30、40 μg/mL）， 并用 pH7.4 的結合緩沖溶液（binding buffer，BB，50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L MgCl2·6H2O，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl）補至總體積為 500μL，使氧化石墨烯終濃度為 0、2、4、8、12、16 μg/mL，混勻后每孔取200 μL測定其熒光強度（激發波長547 nm，發射波長584 nm），試驗設3個平行取平均值。所有操作均在避光條件下進行，以不加GO為對照組。

1.3.2 核酸適配體濃度優化

根據1.3.1結果取最佳濃度的氧化石墨烯溶液200 μL 和等體積不同初始濃度的適配體（70、80、90、100、110、120、130 nmol/L） 于 1.5 mL 棕色離心管中混合，補加BB緩沖溶液至500 μL，則適配體終濃度分別為 28、32、36、40、44、48、52 nmol/L。 室溫下避光孵育20 min后用酶標儀測定其熒光強度（激發波長547 nm，發射波長584 nm），試驗設3個平行，取平均值。

1.3.3 孵育時間優化

采用酶標儀熒光動力學模式進行氧化石墨烯和適配體孵育時間的優化，具體程序設置如下：延遲3 s，振板5 s，運行時長5 min，檢測間隔20 s。取一定體積最佳濃度適配體溶液先進行動力學試驗5 min后，立即快速加入等體積最佳濃度氧化石墨烯溶液，然后按照上述程序進行熒光動力學試驗。

1.3.4 檢測時間優化

最佳檢測時間同樣采用動力學試驗進行優化。設置程序如下：延遲3 s，振板5 s，運行時長45 min，檢測間隔20 s。在1.3.3步驟優化結果基礎上，向氧化石墨烯/適配體孵育體系中加入一定體積AFB1溶液（終濃度為0.5 μg/mL），按照上述程序進行熒光動力學試驗。

1.3.5 檢測靈敏度分析

在優化試驗基礎上，分別取等體積氧化石墨烯溶液和適配體溶液于1.5 mL離心管中混勻，室溫下避光孵育最佳時間后，加入100 μL一系列不同濃度AFB1（終濃度分別為 0、1、5、10、50、100、200 ng/mL），繼續混勻避光孵育最佳時間后，每孔分別取200 μL測定其熒光強度，試驗設置3個平行，取平均值。記對照組（不加AFB1組）的熒光強度為F0，試驗組熒光強度為Fi。以ΔF（ΔF=Fi-F0）為縱坐標，以AFB1濃度為橫坐標作標準曲線，根據標準曲線計算檢測限。

1.3.6 特異性分析

以與AFB1結構或功能類似的FB1、OTA、ZEN 3種真菌毒素代替靶標進行試驗方法的特異性分析。取最佳濃度的氧化石墨烯溶液和適配體溶液各200 μL，待孵育完全后分別加入上述3種毒素（終濃度500 ng/mL）和AFB1各100 μL，室溫混勻孵育后分別測定其熒光強度記為Fi。對照組以100 μL BB緩沖溶液代替毒素，其熒光強度記為F0。根據熒光強度變化情況ΔF（ΔF=Fi-F0）分析檢測方法的特異性。

1.3.7 樣品檢測

花生米樣品預處理參考Ye等[24]的方法進行處理，略有改動。將花生米樣品用粉碎機粉碎，再用研缽搗碎較大顆粒后研磨成粉末。準確稱取粉末樣品5.0 g于50 mL透明離心管中，并加入25 mL 50% 甲醇溶液渦旋振蕩30 min，室溫靜置25 min后在4℃下冷凍離心20 min（5 000 r/min），收集上清液過濾后即為花生米空白提取液。在空白提取液中加入不同濃度（5、50、200 ng/mL）的AFB1溶液，充分振蕩。按照1.3.5步驟進行檢測，根據所得檢測值和實際添加濃度計算回收率?；厥章拾匆韵鹿竭M行計算。

1.4 數據分析

試驗均設置3個平行，熒光強度值采用平均值±標準差表示，試驗所得數據利用Origin 8.5軟件進行分析作圖。

2 結果與分析

2.1 檢測原理

本試驗所構建的檢測方法原理如圖1所示。

圖1 氧化石墨烯-核酸適配體傳感器檢測原理Fig.1 Schematic presentation of graphene oxide-based fluorescence aptasensor assay

因為氧化石墨烯表面存在著含氧官能團和共軛結構，它能夠將TARMA熒光基團標記的核酸適配體通過π-π堿基堆積作用非共價固定在氧化石墨烯表面，這樣由于熒光基團與GO靠近而發生熒光共振能量轉移，適配體上的熒光被猝滅。在體系中沒有AFB1的情況下，核酸適配體仍然被吸附在GO表面，熒光強度基本保持不變。當體系中存在AFB1時，由于適配體與AFB1的高親和性，使得適配體從GO上解離下來而與AFB1結合，熒光基團遠離GO，從而熒光強度得到恢復。因此，可以根據體系熒光強度前后變化與AFB1濃度之間的關系實現AFB1的檢測。

2.2 氧化石墨烯納米片表征及濃度優化

氧化石墨烯納米片的原子力顯微鏡表征及濃度優化結果見圖2。

圖2 GO表征及濃度優化結果Fig.2 Characterization and concentration optimization of graphene oxide

由圖2a可以看出，氧化石墨烯呈明顯的片狀單層結構，其平均寬度約為0.5 μm，平均厚度為2 nm，平均徑厚比為250∶1，有利于核酸適配體的吸附。

由圖2b可以看出，隨著氧化石墨烯濃度的增加，核酸適配體熒光強度逐漸降低，當氧化石墨烯濃度大于12 μg/mL時，核酸適配體的熒光強度下降不明顯，基本保持不變。這說明12 μg/mL的氧化石墨烯基本能將40 nmol/L濃度核酸適配體的熒光信號猝滅完全。因此，確定氧化石墨烯的最佳終濃度為12 μg/mL。

2.3 核酸適配體TAF濃度優化

圖3是核酸適配體熒光強度在最優氧化石墨烯濃度條件下的猝滅效果圖，即核酸適配體TAF濃度的優化結果圖。

圖3 核酸適配體TAF濃度優化結果Fig.3 Concentration optimization of TAF aptamer

從圖3可以看出，在氧化石墨烯濃度12μg/mL猝滅條件下，隨著核酸適配體TAF濃度的增加，熒光強度逐漸增大，當適配體濃度大于36nmol/L時，體系的熒光強度逐漸增加，而當繼續增加適配體的濃度至44 nmol/L時，熒光強度迅速上升。這說明36 nmol/L是適配體TAF的熒光被12 μg/mL濃度氧化石墨烯基本猝滅的臨界點。但為了確保適配體的熒光能完全被氧化石墨烯猝滅，最終確定32 nmol/L為適配體最佳終濃度。

2.4 孵育時間優化

氧化石墨烯與核酸適配體TAF孵育時間熒光動力學試驗結果見圖4。

圖4 氧化石墨烯猝滅適配體熒光時間動力學試驗結果Fig.4 Real-time fluorescence kinetic test of aptamer by graphene oxide

從圖4可以看出，在未加入氧化石墨烯時（前300 s），適配體的熒光強度較強，當加入氧化石墨烯后，體系熒光強度迅速降低，至550 s后體系熒光強度降到最低并保持穩定。這說明加入氧化石墨烯后，經過約250 s后TAF適配體熒光強度基本被猝滅完全，即此時核酸適配體基本完全吸附在氧化石墨烯表面。因此，扣除加注氧化石墨烯時間（10 s），核酸適配體和氧化石墨烯的最佳孵育時間為240 s，即孵育4 min后可進行下一步試驗。

2.5 檢測時間優化

熒光動力學試驗優化確定最佳檢測時間結果如圖5所示。

圖5 檢測時間優化動力學試驗結果Fig.5 Real-time fluorescence kinetic test of the detection

由圖5可以看出，在GO/適配體孵育體系中，沒有AFB1存在情況下（前5 min），由于TAMRA熒光標記的適配體已經被完全吸附在氧化石墨烯表面，熒光被猝滅并處于一個較低值水平；當向體系中加入AFB1后，其熒光強度隨著時間的延長而不斷增強，當時間達到32 min后，熒光強度趨于平緩，基本不再增強。這主要是由于核酸適配體TAF與AFB1具有較強的親和性，適配體逐漸被AFB1從氧化石墨烯表面解離下來而特異性結合，熒光得到增強。因此，當加入待分析樣品27 min后（扣除加入樣品前5 min的動力學試驗時間），體系熒光強度基本不再增強，而趨于穩定，可進行樣品分析檢測。考慮到優化的GO/適配體最佳孵育時間4 min，因此整個方法從上樣到出檢測結果約需30 min左右，檢測時間相對較快。

2.6 方法性能分析及應用

標準曲線及特異性試驗結果見圖6。

圖6 標準曲線及特異性試驗結果Fig.6 Results of standard curve and specificity test

從圖6a可以看出，ΔF與AFB1濃度具有良好的對數關系，其方程為y=4 295.23lnx+5 662.90，R2=0.972 7。根據國際純粹與應用化學聯合會（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）標準計算得該方法的檢測限為2.37 ng/mL，檢測范圍為2.37 ng/mL～200.00 ng/mL。從圖6b可以看出，OTA、FB1和ZEN對體系熒光強度恢復基本上無影響，說明本方法特異性較好，具有較好的選擇性。

花生實際樣品加標回收試驗結果見表1。

表1 花生樣品AFB1加標回收試驗結果Table 1 Recovery of aflatoxin B1in peanut samples

由表1可知，在3種不同加標濃度條件下，回收率為85.0% ～114.4% ，說明本方法具有較好的回收率，可用于花生實際樣品中AFB1檢測。本方法的檢測靈敏度和回收率均低于王琦等[25]的研究結果，這可能有兩個原因，一是兩者所用的適配體序列不一致（相差3個堿基）且標記熒光基團不一樣；二是本試驗所使用的是花生樣品提取液，而文獻使用的是白酒樣品，無需進行提取預處理，干擾因素相對較少。

3 結論

本試驗利用氧化石墨烯納米片構建了一種AFB1的熒光分析檢測方法。經過優化試驗條件，該方法的檢測范圍為2.37 ng/mL～200.00 ng/mL，檢測限為2.37 ng/mL，能滿足日常檢測限量要求。同時該方法具有較好的選擇性，基本不受OTA、FB1、ZEN等真菌毒素存在的影響。該方法操作簡便、檢測耗時短，整個檢測完成只需約30 min左右時間，對花生實際樣品加標分析，回收率為85.0% ～114.4% ，結果比較可靠，具有潛在的實際應用前景。