基于恒溫催化反應過程中吸光度實時測定的漆酶活性快速測定

田曉麗，姜文俠*，張笑然，付紹平，孫瑞雪

（1.中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308；2.天津市工業生物系統與過程工程重點實驗室，天津 300308；3.國家合成生物學技術創新中心，天津 300308）

酶活性是酶和酶制劑的挖掘、創制、研究、生產、分離純化及應用的一個必不可少的參數，以其在特定的溫度等試驗條件下所催化的反應的速率表示[1-4]。現有測定酶活性的“兩點法”從混合試液啟動酶催化反應到終止反應的酶催化反應時長往往長達數分鐘甚至數十分鐘[5-12]，不能滿足高通量測定的需要，不能實現在線監控聯動控制要求的實時分析。另一方面，如果酶催化反應時長延長到酶的初始催化反應速率以外（圖1中的BC時間段），則測定值降低，影響到酶活性檢測結果的準確性、重現性和可比性[13]。酶制劑評價體系與標準體系的不統一，尤其體現在工業酶制劑領域，酶活性標準和應用性能評價差異較大，無法客觀評價國內外酶制劑以及國內不同廠家酶制劑產品特性。

圖1 酶催化反應速率曲線Fig.1 Enzymatic reaction rate curve

本文搭建了一個在酶的恒溫催化反應過程中進行吸光度檢測的恒溫反應分光光度系統，酶的催化反應在分光光度計的比色皿中進行，以水浴恒溫比色皿架夾層的循環水準確控制比色皿內酶催化反應體系的溫度，可以精確地測定催化過程中反應體系吸光度、透光率的實時變化值。以漆酶活性的測定為研究對象，選用了漆酶活性檢測中使用最多的 2，2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽 [2，2'-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt，ABTS]作為底物，考察了ABTS濃度、溶氧濃度和酶濃度的適宜范圍，建立了基于初始催化反應速率的漆酶活性快速測定方法，大幅度簡化了操作流程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漆酶通過冬生多孔菌（Polyporus brumalis TIB.BPE 11072，中國科學院天津工業生物技術研究所保藏）液體發酵獲得，制備的原酶液濃度為n。ABTS：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

紫外-可見分光光度計（TU-1810PC）、水浴恒溫比色皿架（CH181-1）：中國PERSEE公司；恒溫循環水浴（Proline RP1845C）：德國LAUDA公司；溶氧測定儀（HQ40d）：美國HACH公司。

1.3 恒溫反應分光光度系統

紫外-可見分光光度計使用水浴恒溫比色皿架，通過管路外接高精度的恒溫循環水浴，以準確控制比色皿內反應體系的溫度。酶的恒溫催化反應進行的同時檢測該反應體系的吸光度。

1.4 漆酶催化的產物濃度、底物ABTS濃度及漆酶活性的測定

將濃度為n的原酶液適當稀釋，制備待測酶液。

取2.7 mL 0.05 mol/L pH5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和0.2mL特定濃度的ABTS溶液置于光程為1 cm的比色皿中，加入0.1mL待測酶液，振蕩混合啟動反應，將比色皿置于水浴恒溫比色皿架內，于波長420 nm實時測定酶催化反應體系的吸光度。以加熱煮沸5 min的相同濃度的滅活待測酶液作對照。

1.4.1 產物濃度

產物濃度的計算公式如下。

式中：CP為產物濃度，mmol/L；A為420 nm處的吸光度值；ε420為ABTS氧化產物的摩爾消光系數，36 000 L/（mol·cm）。

1.4.2 底物ABTS濃度

底物ABTS濃度的計算公式如下。

式中：CABTS為 ABTS 濃度，mmol/L；CABTS-i為反應體系中初始ABTS濃度，mmol/L；A為420nm處的吸光度值；ε420為ABTS氧化產物的摩爾消光系數，36000L/（mol·cm）。

1.4.3 底物ABTS的轉化率

底物ABTS的轉化率計算公式如下。

式中：R為底物ABTS的轉化率，% ；A為420nm處的吸光度值；CABTS-i為反應體系中初始ABTS濃度，mmol/L；ε420為ABTS氧化產物的摩爾消光系數，36 000 L/（mol·cm）。

1.4.4 漆酶活性

漆酶活性定義：以每分鐘氧化1 μmol的ABTS所需要的酶量為一個酶活力單位（U）。漆酶活性計算公式如下。

式中：U為待測酶液的漆酶活性，U/mL；V為反應總體積，mL；A1和A2為兩個不同檢測時間點的420 nm吸光度值；v為待測酶液的體積，mL；t為檢測時長，即A1和A2兩個檢測時間點之間的時間間隔，min；L為比色皿的光程，cm。

1.5 漆酶催化反應體系中溶氧濃度的測定

將裝有0.05 mol/L pH5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和特定濃度ABTS溶液的試劑瓶充分振蕩后置于設定溫度的恒溫水浴中，將溶氧測定儀探頭浸于試劑瓶的液體中，待溶氧濃度恒定后，加入1 mL待測酶液，振蕩混合，連續測定反應體系中的溶氧濃度。

2 結果與分析

2.1 酶活性檢測過程中底物和溶氧濃度的適宜范圍

在不同溫度考察漆酶活性檢測的反應體系中，當ABTS濃度足夠大時溶氧的變化，以及當溶氧濃度足夠大時ABTS的變化規律，尋找在設定的酶活性測定反應過程中適宜的溶氧濃度范圍和適宜的ABTS濃度范圍，結果見圖2。

圖2 不同溫度的漆酶活性測定體系中溶氧濃度、ABTS濃度及產物濃度的變化Fig.2 Changes of dissolved oxygen concentration，ABTS concentration and product concentration in laccase activity detection system at different temperatures

由圖2可知，反應體系中的ABTS濃度和溶氧濃度表現出一致的變化趨勢：起初其濃度足夠高時，漆酶催化反應速率最大并在短時間內保持不變，此時的催化反應速率為初始催化反應速率；在試驗溫度范圍內，隨著溫度的升高，初始催化反應速率增大；但隨著反應的進行，ABTS或溶氧消耗，催化反應速率逐漸減小，甚至趨向于零；在圖2a中，由于溫度升高反應體系中初始溶氧濃度呈現顯著的降低趨勢。對比圖2a和圖2b，當ABTS濃度足夠大時，溶氧含量逐漸趨近零；而即便溶氧濃度足夠大也不能使ABTS全部被催化氧化成產物。

酶濃度（Clac）和 ABTS 的初始濃度（CABTS-i）對 ABTS氧化產物最高生成濃度（CP-h）和ABTS最高轉化率（Rh）的影響見表1。

表1 Clac和 CABTS-i對CP-h和Rh的影響Table 1 Effects of Clacand CABTS-ion CP-hand Rh

由表1可知，Clac對Rh無影響；但是當CABTS-i增加時，CP-h逐漸增加，但增幅逐漸變小，Rh逐漸減小。漆酶催化氧化作用符合乒乓機制[14-17]，圖2和表1結果顯示，ABTS氧化產物升高至一定程度時會抑制該催化氧化反應的進行，因此，ABTS無法全部被催化氧化；而溶氧被還原并與氫離子結合形成的水分子不會反映抑制反應的進行，當ABTS濃度足夠大，反應時間足夠長時，溶氧會全部被還原形成水分子。

在漆酶活性檢測過程中，當ABTS和溶氧濃度均足夠大時，曲線斜率最大并保持不變[18]，此時的催化反應速率是初始催化反應速率，可以代表漆酶的催化能力，體現了該酶分子的特性，這樣的檢測結果重現性好，使不同來源、不同酶學性質、不同純度的漆酶及其酶制劑的酶活性數據更具可比性。隨著催化反應的進行，任何一種底物無論ABTS還是溶氧降低到一定濃度，均會降低催化反應速率，因而此時ABTS與溶氧的消耗速率均無法真正反映漆酶的催化能力[13]。溶氧的濃度直接影響漆酶的催化反應速率[19]，在測定漆酶活性的實踐中，通常不再通過攪拌或通入氧氣等手段提高反應體系的溶氧濃度，而是采取降低酶濃度的方式使之與溶氧和ABTS的濃度相匹配，檢測漆酶的初始催化反應速率。為此，考察了不同酶濃度的酶活性檢測體系中溶氧濃度及ABTS濃度隨檢測時間的變化規律，結果見圖3；同時通過圖3得到了酶濃度（Clac）對初始催化反應速率（VO2-i和VABTS-i）、使漆酶保持初始催化反應速率的ABTS的最低濃度（CABTS-l）或溶氧的最低濃度（CO2-l）以及使漆酶保持初始催化反應速率的最長檢測時間（T）的影響，結果見表2和表3。

圖3 檢測體系中不同漆酶濃度對溶氧濃度及ABTS濃度隨檢測時間變化的影響Fig.3 Influences of different laccase concentrations in the detection system on the changes of DO concentration and ABTS concentration with the test time

表2 Clac對 VO2-i、CO2-l和 T 的影響Table 2 Experimentally observed VO2-i，CO2-l，and T for different Clac

表3 Clac對 VABTS-i、CABTS-l和 T 的影響Table 3 Experimentally observed VABTS-i，CABTS-land T for different Clac

通過比較圖3a和圖3b發現，溶氧濃度的變化趨勢與ABTS相似，即隨著酶濃度的增加，初始曲線斜率增大，代表初始催化反應速率升高，而且初始催化反應速率與酶濃度呈正比關系（表2和表3），進一步證實了準確測定初始催化反應速率對于酶活性定量測定的重要性。使漆酶保持初始催化反應速率時ABTS的最低濃度（CABTS-l）和溶氧的最低濃度（CO2-l）是漆酶活性檢測的關鍵參數，隨著酶濃度（Clac）的增加，CABTS-l和CO2-l逐漸增大（表2和表3），這是由于酶濃度越高，使酶飽和所需要的溶氧濃度和ABTS濃度越高。由圖3a和圖3b可以看出，隨著反應的進行，當ABTS濃度低于CABTS-l或溶氧低于CO2-l，曲線斜率開始變小，催化反應速率下降。因此，在酶活性測定過程中，溶氧及ABTS濃度均不應低于使漆酶保持初始催化反應速率時所要求的最低濃度。

通過表2和表3還發現，隨著酶濃度的增加，T逐漸減小，在本試驗條件下，當Clac增加至0.062 5n，T僅為9 s。當檢測時間大于T時，得到檢測結果就不是酶的初始催化反應速率。該結果進一步說明：現有的“兩點法”測定漆酶活性（ABTS法），多規定反應的兩個檢測時間點之間的檢測時長為3 min，得到的結果或許并非初始催化反應速率。

本研究通過在恒溫反應過程中實時測定吸光度，可以連續得到多個產物或ABTS的濃度，如果發現ABTS濃度已降低至CABTS-l以下，則可截取曲線前段的直線部分的數據進行計算，從而避免由于溶氧或ABTS濃度降低而引起的誤差。

2.2 溫度的控制

利用恒溫反應分光光度系統測定漆酶活性，反應體系經混合均勻才開始測定吸光度，因此，我們從理論上預期，在漆酶活性測定的前期，ABTS和溶氧濃度相對酶的濃度足夠大，催化反應速率保持最大，曲線的斜率不會發生變化（如圖1的A和B點之間），即ABTS氧化產物生成量與檢測時間呈線性關系。但在試驗中發現在420 nm處測定的代表產物生成量的吸光度隨檢測時間變化（圖4）的斜率是變化的，與預期的直線不同。

圖4 未經預熱的漆酶活性檢測體系的吸光度變化Fig.4 Absorbance changes of laccase activity detection system without preheat

由圖4可以看出，反應初期的曲線斜率呈逐漸增大趨勢，在68 s以后斜率穩定。這可能是由于酶催化反應的試液、待測酶液的溫度是室溫，而酶催化反應的設定溫度為55℃。將上述室溫的液體在比色皿中混合均勻即放入水浴恒溫比色皿架開始吸光度的測定，吸光度測定開始后反應體系的溫度逐漸上升，在68 s以后達到設定溫度，是反應體系的溫度影響了催化反應速率。

為驗證該設想，研究了當Clac為0.025 000n時，酶活性測定所用試液未經預熱，不同催化反應溫度反應體系的吸光度值隨檢測時間的變化，結果見圖5a，并將所用試液預熱后重新測定的不同催化反應溫度反應體系的吸光度值隨時間的變化結果見圖5b。

圖5 不同溫度有無預熱漆酶活性檢測體系的吸光度變化Fig.5 Absorbance changes of laccase activity detection system with and without preheat at different temperatures

由圖5a可知，在酶活性測定所用試液未經預熱的情況下，隨著設定溫度的提高，曲線斜率達到穩定值所需要的時間延長，即設定溫度與室溫差距越大，體系達到設定溫度所需的時間越長。我們將酶活性測定所用的試液和待測酶液置于與催化反應溫度相同的水浴中進行充分預熱，使其溫度達到酶活性檢測的設定溫度。重新測定的不同催化反應溫度反應體系的吸光度值隨時間的變化結果見圖5b。由圖5b可知，曲線均為一條斜率幾乎無變化的直線（R2≥0.999 9）。這一結果再次證明了溫度對酶活性測定的影響。

2.3 檢測時長的縮短

多數文獻將測定漆酶活性所用的“兩點法”的檢測時長定為180 s或更長[11，20-21]。由于在初始催化反應階段產物的生成量與時間呈線性關系，只需任意截取其中的一段直線，即可計算得到基于初始催化反應速率的酶活性。因而設想是否可以僅用兩個相鄰的吸光度檢測點的吸光度值來計算酶活性，從而大幅度縮短酶活性的檢測時長。

為此，在相同的反應條件下開展了不同檢測時長的多組試驗，每組3個平行，各組試驗酶活性測定結果的平均值見表4。

表4 不同檢測時長對酶活性測定結果的影響Table 4 Effect of test duration on the detection results of laccase activity

本試驗的檢測系統讀取吸光度值的最小時間間隔為1 s。由表4可知，即使將檢測時長縮短至1 s（吸光度值的讀取時間點可以是第0 s和第1 s），酶活性的測定值與檢測時長為180 s的測定值無差異，檢測時長的縮短對測定結果無影響。這不僅顯著提高測定效率，而且這樣短的檢測時長更能使酶保持初始催化反應速率，進一步避免了酶濃度和底物濃度給檢測結果帶來的影響。

3 結論

以恒溫反應分光光度系統測定漆酶活性，酶的恒溫催化反應與吸光度的實時檢測在同一時空進行，實現了檢測過程中酶催化反應溫度的精確控制及催化反應時長的精確計量，大幅度降低因計量而引起的誤差。而且，由于可以在酶恒溫催化反應的同時實時監測產物或底物濃度及催化反應速率的變化，一方面，可以避免反應過程中因ABTS和溶氧的消耗而引起測定結果的誤差，確保通過初始催化反應速率計算酶活性，測定結果準確。另一方面，由于初始催化反應速率是酶的特征指標，因而重現性好，更便于不同漆酶及其制劑酶活力的比較。在此基礎上，本研究建立的“三點法”，不僅顯著縮短了檢測時長，而且大幅度降低了ABTS和待測酶液的濃度，節省試劑成本。由于該方法不需要在催化反應后進行終止反應的操作，簡化了操作程序，進一步縮短了檢測全過程消耗的總時長。