竹節參種質資源及育種研究進展

閔欣怡 侯 聰 吳田澤 鄭雅芹 鄧 港 劉 霞

(武漢理工大學化學化工與生命科學學院,武漢,430070)

竹節參來源于五加科人參屬藥用植物竹節參PanaxjaponicusC.A.Meyer.,以干燥根莖入藥,又稱竹節三七、竹節人參、白三七等[1]。它具有人參和三七的特點,具有散瘀、止血、消腫、祛痰、止咳等作用,被稱為“草藥之王”。藥理研究表明,竹節參對心血管系統、中樞神經系統、免疫系統和消化系統均有保護作用[2-9]。長期以來,竹節參的主要來源是野生資源。由于濫采,其棲息地遭到嚴重破壞,導致竹節參野生資源瀕臨滅絕。

1 資源分布

竹節參分布區域隨時間變化較大。《中國植物志》中記載竹節參廣泛分布于我國黃河流域以南濕潤半濕潤區,分布于中國東北以及云南、貴州、陜西、湖北、四川、湖南、江西、浙江等省的北緯31°附近的地區,越南、尼泊爾、緬甸、日本和朝鮮也有分布[10]。目前，野生竹節參資源匱乏，主要分布于西南地區以及湖北[11]。見表1。

表1 竹節參分布區域變化

1.1 野生資源 竹節參野生資源匱乏,一方面由于濫采濫挖,另一方面在于其生長的自然環境受到巨大威脅。在以往調查過的竹節參野生資源生長地區,近年來的調查顯示,曾經野生竹節參的生長地區如今已經很難找到其生長蹤跡[12-16]。

1.2 人工種植 竹節參目前的人工栽培技術仍處于剛起步階段,相關專業技術人員較少,規模化種植基地極少,且缺乏標準化種植技術,導致目前竹節參種植產量少、效益低[17-21]。

2 種質鑒定

2.1 性狀鑒定 竹節參產品略呈圓柱形,略呈彎曲狀,有些帶有肉質側根。長度為5～22 cm,直徑為0.8～2.5 cm。表面為黃色或黃褐色、粗糙,有致密的縱向皺紋和根的痕跡。有明顯的節,節間長0.8～2 cm,每個切片有1個凹陷的莖痕。質地堅硬,切片呈黃白色至淡黃褐色,有黃色點狀維管束排列成環狀。無臭、味苦,后略甜[22]。

2.2 顯微鑒定 竹節參橫截面木栓層有2～10個細胞。皮層稍寬,有一些分泌道。維管束外韌型,形成層呈現環狀。木質部多數排列成2～4組的徑向鏈;木纖維通常為1～4束,有些還會有木化厚壁細胞存在。中央有髓質。薄壁細胞含有大量草酸鈣簇晶體,直徑17～70 μm,并含有淀粉粒。粉末是黃白色到黃棕色。木纖維直徑約25 μm。草酸鈣團簇更為常見,直徑為15～70 μm。網孔或邊緣口導管直徑為20～70 μm。偶爾可見樹脂束碎片,含有黃色的腫塊物。木栓組織碎片細胞多呈現矩形或不規則形,壁厚，淀粉顆粒數量眾多。

2.3 成分鑒定 Xie等[23]采用超高效液相色譜-四極飛行時間質譜(Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry，UPLC-QTOFMS)和多元統計分析技術,對人參、三七、竹節參、西洋參和高麗參等5種藥用人參進行了代謝產物分析。分析數據的主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)表明,5種人參藥材可分離為5組不同的植物化學物質。通過PCA的負荷圖確定了導致這些變化的化學標志物,如人參皂苷Rf、20(S)-假人參皂苷F11、丙二酰-人參皂苷Rb1和人參皂苷Rb2,并通過飛行時間質譜對各化學物質的含量進行了初步鑒定,并基于參考標準進行了部分驗證。結果表明,UPLC-QTOFMS對于快速分析草藥和其他天然產品中存在的一組代謝物是可靠的,并且適用于區分具有相似化學成分的人參混品。

竹節參中主要含有皂苷、糖、多炔、氨基酸、揮發油和無機元素等6種化學成分[24],其中主要活性成分為皂苷。

2.3.1 皂苷 皂苷是人參中研究最多的成分,其含量隨產地有很大的不同。竹節參以根莖入藥，其中粗皂苷的含量約23.6%，皂苷含量約5%[25]。目前從人參中分離出40多種皂苷,根據其結構的不同分為齊墩果烷型、達瑪烷型、奧寇梯木醇型及甾醇型。竹節參中皂苷類型以齊墩果烷型皂苷為主。見表2。

表2 齊墩果酸型化合物

2.3.2 糖 趙海霞等[26]測定了竹節參總糖含量、還原糖含量以及總多糖含量。見表3。Ohtani等[27]從日本生長的竹節參中和分離出了2種具有激活網狀內皮系統作用的多糖：竹節參多糖(Tochibanan)A和B。陳潔[28]等利用液相色譜-高分辨傅里葉變換離子回旋共振質譜法和高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)-紫外檢測器法定量定性了竹節參多糖組分中的單糖，是由D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖和阿拉伯糖組成的。

表3 竹節參糖類含量

2.3.3 含氮化合物 陳永波等[29]使用HPLC和紅外(Infra-red，IR)光譜,在竹節參根莖中檢測出天冬氨酸、酪氨酸、精氨酸、丙氨酸和賴氨酸等17種氨基酸,8種氨基化合物。

2.3.4 多炔類 人參屬植物含有大量的C17多炔化合物[29],也能從竹節參中分離出來,其中3種多炔化合物首次在人參屬植物中分離出來。

2.4 分子鑒定 由于土壤、氣候、水等生長環境對人參生長狀況的影響,僅依靠經驗,通過性狀鑒定人參相對困難。隨著分子生物學的發展,中藥鑒定開始進入更加科學和準確的階段,人參的現代研究變得更加真實和可靠。Tautz等[30]首次提出使用DNA序列作為生物分類系統的主要平臺。2003年,他首次提出了線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(Cytochrome C Oxidase Subunit I,COI)的前半部分,作為DNA條形碼的基礎,期望編碼所有生物物種,并將其命名為“DNA條形碼”。2004年,生命條形碼聯盟(Consortium for the Barcode of Life，CBOL)正式成立,旨在開發一套標準的DNA條形碼制備方法,建立一個全面的DNA條形碼庫。最近,生命條碼項目進入了一個新的階段,啟動了國際生命條碼(International Barcode of Life，iBOL)項目。iBOL是一個來自26個國家和地區的國際合作項目,旨在建立一個基于所有真核生物DNA條形碼文庫的自動識別系統。截至2012年9月生命條形碼數據系統(The Barcode of Life Data System，BOLD，http://www.boldsystems.org/)數據庫擁有2 410 651個標本記錄,1 737 588個標本,160 117種生物,包括動物、真菌、植物和原生生物,最終目標是為全球生物鑒定活動提供數據支持和服務。

陳鏡安等[31]利用ITS2序列對竹節參進行定向測序，從GenBank下載近緣種和摻假種的ITS2序列。對ITS2數據庫進行裁剪,得到24個物種的102條序列。應用DAMBE程序檢測ITS2序列的替代飽和。利用MEGA 6.06軟件進行序列比對,計算GC含量,分析變異位點,估算種內和種間遺傳距離,最終構建NJ樹。分析結果顯示,竹節參與其不相同的偽種或部分近緣種(秀麗假人參、三葉參、越南人參)之間存在較大差異。但該方法對竹節參及其部分近緣種(西洋參、人參、三七)的鑒別有一定的局限性。說明ITS2序列可作為竹節參及其不相同偽品鑒定的DNA條形碼之一,為竹節參及其近緣種間遺傳親緣關系的鑒定、竹節參與不相同摻假品種的鑒別以及竹節參的臨床安全性提供了依據。

3 遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的一個重要組成部分,它是生物體進化和物種分化的來源。種內遺傳多樣性是學者們經常研究的遺傳多樣性。地球上所有生物體的遺傳信息的總和是廣泛的遺傳多樣性。

Choi等[32]通過140對引物的實驗開發了70個表達序列Tag衍生的多態性簡單序列重復標記。這70個標記在4個人參品種中均表現出可重復的多態性,其中19個標記在6個人參品種。這些標記在2個P之間雜交的F2群體中以1∶2∶1的孟德爾遺傳方式分離。人參品種“Yunpoong”和“Chunpoong”,表明這些是可復制和遺傳的可映射標記。利用基因型數據進行的系統發育分析顯示有3個不同的類群:人參-竹節參分化枝、西洋參和三七,相似系數為0.70。竹節參與人參2個物種具有相似的遺傳背景。人參品種分為3個小類群:一個獨立品種“Chunpoong”,一個亞類群有3份材料,包括2個品種“Gumpoong”和“Yunpoong”以及一個長白種“Hwangsook”,另一個亞類群有2份材料,包括一個品種“Gopoong”和一個長白種“Jakyung”。每對引物產生1到4條帶,表明人參基因組具有高度復制的古多倍體基因組結構。

程揚等[33]開發和鑒定了竹節參SSR分子標記,深入研究了竹節參遺傳多樣性。基于竹節參轉錄組數據,利用MISA軟件對SSR序列進行搜索和分析。根據SSR兩翼序列設計SSR引物,并對反應體系進行優化。以5個不同種群為模板,對SSR引物進行多態性檢測。共發現12 244個SSR位點,分布在66 403個unigenes基因10 299個單基因中,SSR頻率為15.51%。SSR重復序列最多的分別為AT/AT(44.87%)、AAG/CTT(24.00%)、AAAAT/ATTTT(19.28%)和AAAAAT/ATTTTT(6.54%)。最后,通過對竹節參樣品的引物多態性檢測,獲得18對穩定的SSR引物。

竹節參SSR位點豐富而密集,為竹節參及其近緣種的分子鑒定和遺傳多樣性研究奠定了分子基礎。

4 育種研究

4.1 繁殖方式 竹節參有無性繁殖和有性繁殖2種繁殖方式[34]。竹節參一般采用種子播種繁殖方法,可以在8月中旬,選擇在年末生長強勁,無病蟲害,大顆粒,成熟早的4年以上的植物果實收集種子,去掉果皮,用0.3%高錳酸鉀溶液或3.5%～4%的甲醛水溶液浸泡10 min,沖洗后取出,再用濕沙保存,種子∶河沙為1∶4。在保存期間,應注意防止濕沙干燥。一般來說,濕沙子應該揉成一個球。保存好的種子也需要在播種前挑選好,除去小或者保存過程中有霉變或失水的種子,然后用上述方法進行1次消毒處理,即可播種。周益權等[35]對竹節參無性繁殖技術進行了研究，以不同位置育苗的人參為研究對象,研究了不同基質和頂芽保留對人參出苗和多芽形成的影響。結果表明,隨著齡期的增加,出苗數量和出苗率降低;有機質含量高的基質可促進多芽的形成。頂芽的保留對竹節參復芽的形成有很大的影響。去頂芽處理顯著提高了竹節參的復芽率,最高為30.00%。通過處理頂芽和增加基質養分可以提高竹節參的多梢發生率。陳士林等[36]在研究中公開了一種利用芽莖組織培養人參的方法,提高了竹節參人工栽培的成活率，增加竹節參產量的問題。

4.2 種植方法 林下栽培是竹節參種植生產的最重要的途徑之一。根據徐燃等[37]的研究,竹節參生產基地應遠離城市、公路、工業區及周邊污染源,生產環境、空氣質量、種植土壤、灌溉水質、地下水水質均符合現行國家標準,水資源水質、空氣水質、土壤水質定期檢測評價。根據周益權等[38]的研究,選擇闊葉林或針寬混交天然次生林,遠離重工業污染和沒有化學除草劑、稀疏而高大的樹木,在森林樹冠下開墾；高封閉的針葉林或大量的竹鞭表土不適宜。選擇陰坡或半陰坡,坡度為5%～25%的山坡中段種植。選擇松散、肥沃、濕潤、排水良好,表面腐殖質大于5 cm。氣候寒冷潮濕,年平均氣溫約10 ℃,極端最高氣溫小于35 ℃,極端最低氣溫大于-12 ℃;10 ℃以上的年活動累積溫度大于2 700 ℃,年平均降水量大于1 500 mm。每年9月初至10月底種植前,砍伐0.6～0.7 m距離茂密的樹木和小灌木,清除1.5 m以下的雜草和灌木,清除林地清潔材料;準備深度25～35 cm,清除土壤屑,施用殺蟲劑,使用有機肥,每隔667 m使用全腐豬、牛、羊糞施用2 000 kg,按自然地形逐耕混土,箱寬1～1.2 m,箱長1.2 m,開溝起壟深15～25 cm,寬25～35 m。竹節參苗體形態自然、根較長、無病、無機械損傷,單重量大于10 g,有發芽;第1種參苗為分苗,為根頂端,頂芽清晰生長良好(該苗保證第2年出苗),然后剪長2～4 cm。如果沒有頂芽,可以根據根芽的痕跡將每段切成1個芽,在苗圃中栽培1年,然后進行下林移栽。第2種竹節參幼苗種植種子苗,種子幼苗大于2年生,單株重量在5 g以上,種植前用多菌靈溶液1∶800,或甲基溶液1∶800浸泡約45 min,或在塊莖苗切口位置浸入植物灰分種植到林地。人工栽培竹節參可以保持豐富的營養,一般來說,野生竹節參的產量以及品質遠低于栽培竹節參。

4.3 組織培養 竹節參的市場需求量日益增加，匱乏的野生資源無法滿足市場需求,對人參資源育種,人工栽培是解決這一問題的重要途徑,組織培養有利于實現規模、標準化種植,有利于種質資源的有效利用,可以解決育種時間、幼苗短缺等問題。羅正偉等[39]以人參胚、莖和葉為外植體,研究分離培養和植物再生技術,優化培養條件,應用正交法篩選竹節參最佳愈傷組織誘導分化培養基。

4.4 品質提升 竹節參的次生代謝產物作為主要有效成分,利用基因工程技術對其代謝途徑進行定向調控，提升相關有效成分的產量，從而提高竹節參的產品品質。Rai等[40]描述了基于Illumina的RNA測序分析,以表征竹節參及其與其他人參屬植物的比較RNA測序和從頭轉錄組組裝。竹節參共產生135 235個單基因,其中78 794個(58.24%)單基因被NCBI nr數據庫注釋。5種組織的轉錄組分析和基因本體富集分析結果表明,盡管整個過程在所有組織中都是均勻保守的。然而,每個組織都有幾個獨特的單基因,在所研究的組織中,葉子顯示出最獨特的單基因。對竹節參轉錄組與其他人參屬物種的公開轉錄物組裝,即人參、竹節參和西洋參在所有人參屬物種中也表現出高度的序列相似性。竹節參轉錄組鑒定出編碼三萜主鏈生物合成途徑中所有酶的推定基因,并分別鑒定出24個和48個單基因,分別被注釋為細胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)和糖基轉移酶(Glycosyltransferase，GT)。這些CYP和GT注釋的單基因在所有人參屬物種中都是保守的,并與參與三萜類主干生物合成途徑的其他轉錄物共同表達。確定的單基因是參與三萜皂苷生物合成的有力候選基因,可以作為未來驗證研究育種的基礎。

Zhang等[41]對野生珠子參(竹節參的一種變種)的根莖節和節間進行了比較代謝產物和轉錄組分析,以揭示它們在三萜皂苷生物合成中的不同作用。結果表明,節點是根莖中人參皂苷合成的關鍵部位。節點中齊墩果酸型人參皂苷的含量遠高于節間。大多數類異戊二烯生物合成相關基因在淋巴結中高度表達。此外,還發現候選尿苷二磷酸糖基轉移酶(Uridine Diphosphate Glucuronosyltransferase,UGT)基因在節點和節間之間存在差異表達。這些均有助于更好地了解竹節參及其變種根莖中人參皂苷的代謝以及后續對相關基因進行調控以幫助品質的提升。

Tang等[42]通過比較竹節參莖尖的內部解剖結構、激素含量、淀粉含量和分子轉錄水平的差異,探討了根狀莖膨大的機制。Illumina測序產生了1 333個差異表達基因(Differentially Expressed Genes，DEGs),這些基因在2個樣本之間差異表達。通路富集分析表明,參與淀粉和蔗糖代謝、二萜生物合成和植物激素信號轉導通路的DEGs顯著富集。此外,淀粉測定結果表明,膨脹部分的淀粉含量顯著高于細長部分的淀粉含量。此外,激素測定結果表明,赤霉素A1(GA1)、赤霉素A53(GA53)、吲哚-3-乙酸(IAA)和茉莉酸(JA)含量負相關,而順式玉米素(cZ)含量與根莖膨大正相關。結果篩選出了幾個DEGs和潛在的根狀莖膨大候選基因,為人參屬植物膨大基因的鑒定以及后續提高產量等奠定了基礎。

Xu等[43]利用代謝產物分析,分析顯示齊墩果酸型和達馬拉型皂苷在竹節參的3種組織(幼根組織、次根組織、老根組織)中分布不均。單分子實時(Single Molecule Real-time，SMRT)測序和下一代測序(Next Generation Sequencing,NGS)數據揭示了與這2種皂苷的產生相關的不同的組織特異性轉錄組模式。在共表達網絡和層次聚類分析中,發現1個3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A Reductase,HMGR)和2個1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate Synthase,DXS)等轉錄物分別是與竹節參齊墩果酸和達馬烷型皂苷生物合成相關的關鍵基因。此外,還發現CYP和UGT家族蛋白作為皂苷生物合成相關基因的調節因子,表現出組織特異性表達模式。這些結果共同提供了竹節參的全面代謝組學和轉錄組學概述，為竹節參定向育種奠定基礎。

5 結論

在現代中藥研究領域中,人參皂苷等提取物的藥理作用豐富,對新藥研發具有重要的指導價值。它值得進一步研究,在衛生保健產品、食品等領域的價值也在逐步發展。目前,人參分布廣泛,具有較高的人工栽培價值,遺傳多樣性豐富,其潛在應用價值值得進一步開發。近年來,由于竹節參需求的增加,野生竹節參資源稀缺。除了保護竹節參資源和尋找新資源外,還可以從其他植物中尋找替代藥用資源,填補高活性成分的藥用資源的空白,解決市場供需矛盾。