多組學技術在葛根品質提升研究中的應用進展

胡心怡 吳田澤 侯 聰 鄭雅芹 鄧 港 劉 霞

(武漢理工大學化學化工與生命科學學院,武漢,430070)

葛根為豆科葛屬植物葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根，習稱野葛。葛根性味甘、辛、涼，歸脾、胃、肺經，具有解肌退熱、生津止渴、解酒毒等諸多功效[1]，是一味常用的傳統中藥材，藥用歷史可以追溯到東漢時期的《神農本草經》。此外葛根中富含異黃酮，可用于降低血脂、血壓、血糖，具有保健功能，是原衛生部首批發布的藥食兩用植物[2]。

近年來對于葛根的化學成分、藥理藥效等的研究已經具體深入，對于育種栽培以及分子生物學研究也逐年增多。本文將對葛根資源分布、質量控制、多組學研究、栽培育種和品質提升等方面的研究進展進行綜述，對多組學研究在葛根品質提升方面的應用進行總結展望，以期推動對葛根的進一步開發利用。

1 葛根的資源與分布

全世界葛屬植物35種，主要分布在溫帶和亞熱帶地區，中國有8種，在貴州有分布[3]。野葛和粉葛2種葛屬植物常作藥用，在《中華人民共和國藥典》(2005版)之前并無區分，顧志平[4]在全國各地進行了實地調查，發現野葛在全國絕大多數地區均有分布，而粉葛則主要分布于廣西和廣東，人工栽培粉葛較為常見[4-5]。其調查到的我國葛屬植物分布見表1。

表1 我國葛屬植物分布

2 葛根的質量控制

2.1 化學成分 葛根的主要成分包括異黃酮類化合物和三萜類化合物，除此之外還富含生物堿類、皂苷類、香豆素類和多糖類化合物等多種化學成分[6]，還富含人體必需氨基酸、礦物質和微量元素等[7]。葛根的這些主要成分使其同時兼具藥用和使用價值，因此對葛根的質量控制尤其重要。

2.2 藥理學作用 葛根作為重要的藥食同源中藥材，其諸多有效成分能夠發揮多種藥理活性，如降低血壓、抗腦梗死、抗動脈粥樣硬化、抗心律失常、抗糖尿病、抗腫瘤、解熱鎮痛、抗氧化、抗阿爾茨海默病、抗帕金森癥、抗抑郁、預防骨質疏松、保護肝臟、解酒等作用。見表2。

3 葛根的多組學研究

近年來，分子生物學技術發展迅速，隨著高通量測序技術的出現，藥用植物的基因組學、轉錄組學、代謝組學和蛋白質組學隨之發展迅速，研究者們對于葛根的多組學研究也逐漸被報道。接下來將對近年來葛根的多組學研究進行總結。

3.1 葛根的基因組學研究 Zhang等[27]利用Illumina HiSeq X Ten測序獲得了葛根葉綠體基因組，得到了全長153 411 bp的基因組，由一個84 131個堿基的大單拷貝區和一個17 990個堿基的短單拷貝區組成，中間隔著一對25 645個堿基的反向重復序列；葉綠體全基因組包含111個基因，其中77個為蛋白質編碼基因、30個為tRNA基因，4個為rRNA基因；總GC含量為35.4%；系統發育分析表明，野葛與豆薯比較接近。

Cao等[28]對葛根的完整葉綠體基因組進行了組裝，得到了全長153 442 bp的基因組，包含84 162個大的單拷貝區和17 998個小的單拷貝區，25 641個堿基的反向重復序列，GC含量為35.41%；葉綠體全基因組共編碼129個基因，其中84個為蛋白質編碼基因，37個為RNA基因，8個為rRNA基因。注釋后的基因組序列提交GenBank，登錄號為MT818508；此外還通過對豆科鳳蝶亞科48種植物的系統發育樹分析證明，葛根屬于豆科蝶形花亞科，與豆薯(P.erosus)、赤豆(V.angularis)和菜豆(P.vulgaris)親緣關系較近。

表2 葛根的藥理作用

Sun等[29]也對葛根的葉綠體基因組測序，并利用這些數據對基因組資源進行了評估，得到葉綠體基因組全長共153 411個堿基，包含84 142個大的單拷貝區和17 998個小的單拷貝區；重新組裝和注釋表明，共編碼112個基因，其中78個為蛋白質編碼基因，30個為tRNA基因，4個為rRNA基因；總GC含量為35.4%。

3.2 葛根的轉錄組學研究 對葛根的轉錄組學研究始于2015年，近年來越來越多的研究者將目光投向葛根的轉錄組學研究。研究內容及結果總結見表3。

表3 葛根的轉錄組學研究

續表3 葛根的轉錄組學研究

3.3 葛根的代謝組學研究 Shang等[39]使用長閱讀的單分子測序和Hi-C技術組裝了高質量的葛根基因組。基因組大小為1.37 GB，由5 145個重疊群組成，重疊群N50為593.70 kb；基因組結構注釋產生了869.33 Mb的重復區域，占基因組62.70%，編碼蛋白質的基因45 270個；進化分析表明，葛根與大豆的親緣關系最近，經歷了2次古老的全基因組復制事件——一次是在豆科物種的共同祖先中，另一次是在大約720萬年前物種形成后獨立發生的；與其他5種豆科植物相比，葛根共有2 373個基因家族是獨一無二的；還對與葛根素含量相關的基因和代謝產物進行了鑒定，共鑒定了572個在葛根素生物合成途徑中上調的基因，235個候選基因通過組學數據進一步豐富；此外，還鑒定了6個與葛根素代謝密切相關的8-C-葡萄糖轉移酶(8-C-GT)候選基因，填補了豆科植物基因組的一個重要空白，為葛根的遺傳改良提供了有價值的多基因組資源。

Shang等[40]還進行了基于超高效液相色譜-串聯質譜儀的廣靶代謝組學分析，共鑒定了614種代謝物，其中包括初生代謝物和次生代謝物，不同品種積累特異代謝物；進行了主成分分析、聚類分析、KEGG富集分析來進行代謝組學分析，用Log2FC≥3和VIP≥1來進行營養成分分析，結果表明，葛根與其變種之間的營養差異可以用氨基酸、核苷酸、糖類和脂類豐度的差異來解釋，而葛根與其變種之間藥用品質差異則是由異黃酮類、異黃酮類、酚酸、有機酸和香豆素含量的差異造成的；此外，還確定了對3個葛根品種進行分類的關鍵代謝物。

3.4 葛根的蛋白組學研究 暫時未發現相關研究。

4 葛根的育種栽培

4.1 葛根的種植技術 葛根在中國的栽培歷史悠久，最常見的葛屬植物有常作藥用的野葛和常做食用的粉葛。野葛在中國分布廣，除新疆、西藏外其余各省皆有分布，而粉葛更是以栽培為主，因此出現了多個有“粉葛之鄉”之稱的粉葛種植地，葛根的栽培技術在實踐中積累經驗不斷完善提升，從土地選擇、精細整地、堆捂營養土、種藤選取、芽節扦插、防治病蟲害等各個方面進行了具體而科學的規范，以達到高產高抗的種植目標[41]。

葛根喜溫喜濕，大多生長在海拔1 600～2 100 m的背陰坡地，適宜生長溫度為12～16 ℃。葛根于2月上旬開始萌芽，4～9月生長旺季，11月中旬生長減緩直至不再生長，在12月到次年2月之間為采收期，越冬率可達100%[42]。葛根耐寒耐干旱，對土壤的要求不高，因此在國內種植范圍十分廣闊。

4.2 葛根的新品種選育 近年來，人們對藥食藥膳、綠色食品等健康飲食的需求越來越高，對葛根的食品開發和育種栽培等的研究也逐漸增多；另一方面，國家對葛根的加工工藝和流程等制定了相關的標準，使食用葛根的質量和食品安全大大提高[43]。各研究所和藥企也開始開展葛根新品種選育相關工作，雖然目前我國葛根新品種報道較少，選育進程緩慢，但也有了一定成效，選育出一系列優良葛根新品種，如湘葛系列、贛葛系列、宋葛系列、橫峰系列、“恩葛-08”“桂葛1號”“桂粉葛1號”以及木生葛根、糯粉葛、菜粉葛和綠健葛根等[44-48]。

5 組學研究在品質提升方面的應用

葛根的有效成分絕大多數是它的次生代謝產物，代謝途徑需要多種酶催化，找到合成有效成分的關鍵酶，就能了解在藥材有效成分合成的分子機制和調控機制，進而利用基因工程技術對有效成分進行調控和生產。

5.1 藥用有效成分葛根素 葛根素是葛根中最主要的藥用活性成分，近年來對葛根素合成相關的研究逐漸增多，找到了一些與葛根素合成相關的基因、轉錄因子和酶等，在3.2中進行了詳細論述。Wang等[31]對PlUGT43(一種葛根葡糖基轉移酶)進行了分子克隆和功能鑒定，生化分析表明，PlUGT43具有大豆苷元C-糖基化為葛根素的活性，對異黃酮類大豆苷元和染料木素具有活性，但對包括黃酮類在內的其他潛在受體沒有活性，證實了PlUGT43在葛根素生物合成中的作用。

5.2 膨大機制和淀粉合成 葛根作為重要的藥食同源植物，富含淀粉、黃酮和葛根素等成分，除可作藥用治療多種疾病，其食用價值也很高。葛根除了可以作為蔬菜鮮食、炒菜、煲湯之外，最常見的是加工成為葛根粉，還可做成葛根面條、饅頭、果糕、酒、茶、飲料等特色食品[2]。粉葛生長快、塊莖大且富含淀粉，是人工種植最多的葛根品種，因此對葛根的膨大機制和淀粉合成相關基因的研究也不在少數。劉冬梅等[49]選取了普通葛根和塊根膨大的野生型突變型葛根，運用cDNA-AFLP技術進行差異分析，分析結果篩選出5個特異表達片段，發現它們參與了信號轉導、抗脅迫應答、電子傳遞和光合代謝等反應。郭麗君[50]為了提高葛根產量，克隆了淀粉合成關鍵酶腺苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose Pyrophosphorylase，AGPase)小亞基基因(sAGP)和大亞基基因(LAGP)，探究其對葛根塊根長度、粗細、重量和產量的影響機制，發現AGPase基因表達變化是植物通過自身信號網絡相互作用調控，進而調控淀粉合成關鍵酶活性變化，從而影響淀粉成分及含量變化。

5.3 抗逆 葛根喜愛濕潤溫暖的環境，干旱、低溫等環境因素會對葛根的生長帶來影響，因此可以利用溫度、光照、水分等非生物脅迫或者病蟲害等生物脅迫來篩選葛根相關的抗逆基因，為抗逆性強的葛根品種選育打下基礎，以提高葛根的品質性狀和產量性狀。

6 展望

近年來，對葛根的分子研究逐漸增多，多組學研究特別是轉錄組學研究十分火熱。研究者主要專注于葛根異黃酮類化合物合成相關的基因和代謝通路進行研究，獲得了長足進展。然而，葛根的基因組學研究進展緩慢，蛋白質組學的研究更是尚未起步。因此，可以利用多組學聯合技術，挖掘葛根素等有效成分生物合成相關的基因、調控蛋白、酶、轉錄因子以及次生代謝途徑等，從而從分子層面對葛根分子研究的短板進行填補。

多組學研究可以從基因水平對葛根的品質提升進行指導，目前大部分研究針對的是葛根素合成相關的基因和酶，還有一部分研究專注于葛根膨大機制和淀粉合成，對于葛根抗逆方面的研究還有待提升。因此，可以利用溫度、光照、水分等非生物脅迫或者病蟲害等生物脅迫來篩選葛根相關的抗逆基因，從而提升葛根的抗逆性。

在葛根的種植和新品種選育方面，相對于常見的蔬菜水果等，葛根的品種選育進展較為緩慢，全國報道的葛根新品種不多，且推廣種植面積較小。另外，最主要的藥用成分葛根素在野葛中含量較高，在粉葛中含量較低，但是主要選育和種植的葛根絕大部分為淀粉含量高、食用價值高的粉葛，其葛根素含量很難達到藥典規定的標準。因此，對于富含藥用有效成分葛根素的野葛的新品種選育有待加強。