天麻種質資源及其與雙菌共生分子機制研究

張照宇 孫建華 陳士林 董林林

(1 中國中醫科學院中藥研究所,北京,100700; 2 山東中醫藥大學藥學院,濟南,250300; 3 陜西漢王略陽中藥科技有限公司,漢中,724300)

蘭科(Orchidaceae)為與真菌形成典型菌根共生關系的高等植物類群,是探究植物-真菌相互作用的模式植物[1]。天麻(GastrodiaelataBl.)為應用廣泛的蘭科植物,又名“赤箭”“定風草”“鬼督郵”等,其生命周期高度依賴萌發菌與蜜環菌[2-4]。天麻干燥地下塊莖具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡的功效,廣泛用于降血脂、降血壓、改善失眠、緩解疲勞、鎮靜鎮痛、保護神經細胞、治療風濕痹痛和調節人體免疫,是臨床療效顯著且無明顯不良反應的傳統中藥材[4-6]。國家衛生健康委員會協同國家市場監管總局已將天麻列入藥食同源類中藥材名錄,使其成為深受廣大消費者喜愛的藥食同源品,具有藥用價值、保健價值和經濟價值[7]。

天麻野生種質經人工多代繁殖常出現品種退化、產量低而不穩、藥效降低等問題,難以滿足現階段市場需求[8]。隨著人工栽培與品種選育技術的推進,我國已培育出一批品質優良的天麻新品種[9-12]。然而,傳統育種方式周期長且隨機性大,天麻新品種培育工作面臨發展瓶頸。利用現代分子生物學技術進行分子育種將實現藥材的快速、精準改良,為種質資源優化提供啟示[13]。天麻的生活史、生長發育過程、共生時期營養關系及細胞功能分化等研究已較為深入[2-3,14]。隨著組學技術的發展,學者們已利用轉錄組學、蛋白組學等技術對天麻-真菌共生時期的分子機制進行了初步探究[15-16]。然而,目前的研究多僅局限于天麻全生育期的一個發育階段或2種共生真菌的一個共生時期,缺乏系統性的研究與總結,對現有天麻分子調控機制進行整合,將為從分子層面揭示天麻異養生活模式的機制提供啟示。

本文綜述了天麻種質資源的分布、種類以及新品種培育現狀,并對天麻-雙菌共生時期促進種子萌發、維持共生動態平衡體系、增強共生效率、物質貯存等分子機制進行了系統梳理,以期為天麻遺傳信息解析、品種選育、遺傳改良和綜合開發利用提供支撐與參考。

1 天麻本草考證

天麻在我國已有2 000多年的入藥歷史,主要為“治風”“補益”兩大功效,其用藥部位也隨著朝代的變遷有所不同。早在秦漢時期,《神農本草經》將其以“赤箭”為名列為上品,始載其功效:“氣味辛、溫,無毒,主殺鬼精物,治蠱毒惡氣。久服益氣力,長陰,肥健,輕身,增年……功同五芝,力倍五仙,為仙家服食上品。”但未言明其藥用部位[17]。魏晉時期《名醫別錄》以“三、四、八月采根”言明天麻以塊莖作為藥用部位[18]。宋代《本草衍義》中記載:“赤箭,天麻苗也。然與天麻治療不同?！睂⑻炻榕c赤箭分名別錄,言明天麻藥用部位為塊莖,赤箭為其花莖[19]?！短交菝窈蛣┚址健分杏涊d,天麻常通過與麝香、全蝎、僵蠶等息風藥配伍治療肝風內動所致疾病[20]。明代李時珍所著的《本草綱目》又云:“根、莖并皆可用。”將天麻的根、莖并為一物,并通過“天定乃定風草,治風之神藥”“上品五芝之外,補益上藥,赤箭為第一”等對天麻的分類、分布、藥性、應用詳細記載[21]。清代的《本草備要》載:“天麻,治小兒癲癇……天麻益氣強陰,通血脈,強筋力,疏痰氣?！笨梢娞炻榧仁窍L止痙常用藥,又為補益良方[22]。

隨著時代發展,目前天麻多以塊莖入藥。天麻飲片廣泛應用于醫療保健領域，傳統的天麻鉤藤飲、半夏白術天麻方等復方制劑在臨床上療效顯著，天麻果脯、天麻赤砂糖餅干等保健食品深受廣大消費者喜愛[6,23-24]。天麻產業的持續完善將創造更多的藥用價值、保健價值與經濟價值。

2 天麻種質資源及新品種

中國是世界上野生天麻資源分布最廣泛的國家,具有豐富的種質資源[25]。然而,天麻的真菌異養型生存機制以及市場需求量的逐漸升高使其野生資源處于瀕危狀態,且野生種質經數代繁殖后多出現種群退化、病蟲害侵襲和品質下降等問題,栽培價值降低[26]。為保障天麻產業持續發展,我國以現有種質為基礎培育了一批品質優良、產量穩定的新品種[8,27]。

2.1 天麻種質資源及分布 植物學研究顯示,全球天麻屬植物共30余種,但中藥材天麻的基原僅為天麻(G.elata)一個物種[1,25]。該物種的分布遍及亞洲,南至尼泊爾、不丹,東至日本、朝鮮半島,北至西伯利亞地區,西至中國西藏的錯那[25]。在中國境內,天麻在各省市均有分布,南起云貴山區,北至黑龍江省,東起臺灣省,西至西藏,主要聚集在長江中游兩岸的山區[25]。根據花色、莖稈顏色以及塊莖形狀和含水量的不同,天麻下分6個不同變型(變種),其形態特征及分布情況見表1。紅天麻(G.elataBl.f.elata)為原變型,花與莖皆呈橙紅色,根莖呈啞鈴形,主要分布于黃河及長江流域諸省;綠天麻(G.elataBl.f.viridisMakino)花呈淡綠色至白色,莖呈淡藍色,根莖為長橢圓形或倒圓錐形,產于東北至西南諸省;烏天麻(G.elataBl.f.glaucaS.Chow)花呈藍綠色,莖為灰棕色帶白色縱條紋,主產于我國西南部的貴州省、云南省;黃天麻(G.elataBl.f.flavidaS.Chow)花與莖均呈淡黃色,根狀莖卵狀長橢圓形,主產于我國河南、湖北、貴州及云南諸省;松天麻(G.elataBl.f.albaS.Chow)花呈白色或淡黃色,莖為黃白色,根狀莖常為梭形或圓柱形,主產于云南西北部;卵果天麻(G.elatavar.obovataY.J.Zhang)的花色、莖稈顏色及塊莖形狀與紅天麻相似,區別在于其花呈螺旋排列,果實相對較短,分布于陜西省[25,28]。

2.2 天麻新品種 培育高品質新品種是天麻產業持續發展的保障。天麻6種變型(變種)在全國均有馴化栽培(表1)。其中,紅天麻為原變型,因生長速度快、適應性強、產量高等特點而廣泛栽培,為目前種植面積最大的天麻品種;烏天麻折干率較高、麻型較好且藥性較強,為目前公認品質較好的天麻品種[8,27]。紅天麻和烏天麻分別因高產和品質優良的特點成為育種的常用親本植物材料。見表2。1997年,宜昌市林校以宜昌紅天麻與云南烏天麻為親本,通過正反交培育出我國第一代雜交天麻——“鄂天麻1號”和“鄂天麻2號”,并于2002年通過湖北省品種審定[9,29]。雜交后的品種生長速度快、適應性強、藥用價值高,為我國常規天麻品種的更新換代開拓了光明前景。楊文權等[30]通過將天麻不同變型雜交證實烏天麻與紅天麻的雜交后代品質最佳。西南交通大學對川西南天麻野生混合種質的自然變異株進行系統選育,得到適宜四川及相似生態區種植的新品種——“川天麻金烏1號”,該品種平均畝產較其基原烏天麻增加超過70%,推動了我國天麻的育種工作[10]。夏守平等[11]采集長白山地區的野生綠天麻,經人工馴化栽培,選育出適宜吉林省栽培的高產、優質、抗逆性強的新品種——“翡翠1號”,挖掘了長白山地區天麻產業的發展潛能。紅天麻為陜西省道地藥材且有自然分布,陳士林課題組通過將野生紅天麻自交選育出品質優良、分生速度快、抗逆性強的新品種——“略麻-1號”(ZYXP-2020-006),目前已在陜西略陽、湖北武夷山等地區廣泛種植,取得了顯著的經濟、社會和生態效益[12]。

表1 天麻種植資源形態特征及分布情況

將天麻經典品種的優良性狀結合是現階段天麻育種的主要思路,然而傳統育種方式的周期性和隨機性使育種工作面臨瓶頸,利用現代分子生物學技術實現分子育種將精準調控天麻性狀,指導天麻良種繁育的快速發展。

3 天麻-雙菌共生分子調控機制

天麻是與真菌共生的異養草本植物,其無根無葉,無法進行光合作用,也不能從土壤中吸收大量水分和營養物質[8]。天麻生活史為:種子→原球莖→米麻→白麻→箭麻→種子[2]。見圖1。種子至原球莖階段為種子共生萌發階段,此過程天麻需小菇屬(Mycena)真菌與其共生并提供營養物質,此階段共生真菌統稱為萌發菌[14];原球莖后期,蜜環菌(A.mellea)逐漸取代萌發菌成為天麻的主要營養來源,并與天麻共生至再次結種[3]。這種先后與不同真菌共生的生存機制成為天麻區別于其他蘭科植物的特征,為天麻-雙菌共生研究提供了生理學依據。

表2 天麻新品種培育現狀

圖1 天麻生活史

采用天麻全基因組測序對天麻真菌異養模式的分子機制進行初步探究。天麻基因組(1.06 Gb)通過假基因化與基因重排淘汰大量基因,僅有187 969個蛋白編碼基因被注釋,是迄今為止最小的理論蛋白質組。光合作用相關基因在缺失基因中占比極高,標志著天麻光合系統的嚴重退化;而線粒體基因組顯著擴張,并主要富集于代謝功能。此研究結果表明,天麻利用基因可塑性調整全基因組結構,使其在無法自身進行光合作用的情況下能夠進行正常生理活動,為天麻-雙菌共生研究提供了分子依據[31]。

3.1 天麻-萌發菌共生時期分子機制 天麻種子由種皮、分生細胞、原胚細胞、柄狀細胞及已退化的胚柄殘跡構成,因無胚乳而缺乏營養供應,小菇屬(Mycena)真菌為其萌發提供信號與營養,此機制稱為共生萌發[32-33]。萌發菌以菌絲形態由柄狀細胞侵入種子并使胚分生細胞分化為天麻與菌絲共生的主要場所——菌絲結細胞,以及水解菌絲并為天麻提供營養的場所——消化細胞[14]。種子由消化細胞水解菌絲獲得營養,胚分生細胞旺盛分裂,膨脹的胚突破種皮形成原球莖[34]。

共生萌發前期,天麻與萌發菌為保證種子萌發均產生分子調節機制。天麻種皮由木質素形成疏水屏障,限制水分而導致種子發育不良[35]。Ren等[34]的轉錄組學研究結果顯示,與純菌絲比較,共生菌絲中降解木質素的錳依賴性過氧化物酶(Manganese-dependent Peroxidase,MnP)與漆酶(Laccase)表達均顯著上調,協助降解天麻種皮并促進水分吸收。植物激素脫落酸(Abscisic Acid,ABA)為種子萌發抑制劑,在種子至原球莖階段,5種參與ABA生物合成的基因表達顯著下調,30個參與ABA信號轉導的基因表達水平較低且無顯著變化,降低了ABA對天麻種子萌發的抑制。因此,共生體系建立后,宿主與真菌均通過調整基因表達量促進種子萌發。

天麻與萌發菌共生是建立信號轉導與物質運輸途徑的復雜過程。內吞作用又稱入胞作用,該過程多依賴網格蛋白,是宿主與真菌建立共生關系的橋梁,具有激活共生信號通路、環境溝通、物質運輸等作用[36-38]。轉錄組學結果表明,原球莖中有16個(共26個)網格蛋白介導的內吞作用相關基因較種子時期顯著上調表達,此結果與該團隊蛋白組學結果一致[32-33]。原球莖后期,促進信號復合物形成并誘導防御素表達的絲氨酸與蘇氨酸激酶高度表達,提高了信號轉導效率[33]。在共生萌發過程中,天麻通過調節信號轉導與物質運輸途徑促進天麻-萌發菌共生體系的建立并增強了二者的共生效率。

在長期進化過程中,天麻建立了抵御菌絲過度侵染的多重機制。真菌細胞壁主要由多糖構成,其水解產物寡糖可作為激發子誘導宿主細胞產生防御與免疫反應[39]。轉錄組學結果顯示,在種子至原球莖階段,天麻編碼多糖水解酶的基因顯著上調[32]。這一機制促進了菌絲細胞壁降解,產生寡糖,并誘導防御與免疫相關基因的表達上調[34]。根據多項轉錄組學結果,抗病相關蛋白在種子萌發后顯著上調,共生萌發關系建立后,原球莖中的上調基因數目遠高于下調基因數目,且多聚集于植物防御、能量代謝、次生代謝等途徑,而共生菌絲下調基因數目始終高于上調基因數目[31-33,40]。這標志著共生關系的建立，使宿主開始隨著消化菌絲獲得營養物質,并隨著旺盛的生命活動生長,而萌發菌則受到限制和消化,生理活性與生命活動較共生關系建立前顯著降低,二者處于動態平衡狀態。

共生萌發后期,蜜環菌開始侵染天麻并伴隨活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的產生[41]。蛋白組學結果表明,與早期原球莖比較,天麻于原球莖后期上調植物防御、代謝、分子信號相關基因。其中,增強真菌抗性的致病相關蛋白，保護組織免受氧化損傷的過氧化物相關酶高度表達,這表明蜜環菌的侵染觸發了天麻的代謝與防御反應[33]。共生萌發后期天麻-萌發菌共生平衡狀態被打破,蜜環菌將逐漸取代萌發菌與天麻形成新的共生體系。

綜上所述,天麻-萌發菌共生時期主要有促進種子萌發、提高共生效率、維持共生平衡，以及共生后期打破動態平衡4類調控機制。見表3。天麻種子-萌發菌建立共生關系后,宿主與真菌分別通過降低種子萌發抑制劑的合成與協助降解種皮以促進種子萌發形成原球莖。形成穩定共生體系后,天麻-萌發菌通過建立信號轉導與物質運輸途徑提高天麻-真菌共生效率,天麻將菌絲限制于皮層區域并不斷消解菌絲以維持菌-麻動態平衡狀態。共生萌發后期,蜜環菌的侵染使天麻產生應激與防御反應并打破共生體系動態平衡,為下一階段天麻-蜜環菌共生體系的建立創造條件。

表3 天麻-萌發菌共生階段分子機制

3.2 天麻-蜜環菌共生時期分子機制 天麻-萌發菌共生后期,編碼器官形態變化的相關基因高度表達,原球莖頂端的分生組織逐漸分化出新生麻[31]。此階段僅依靠萌發菌已無法滿足天麻分化生長出新生麻的需求,蜜環菌侵染并取代萌發菌為天麻的生長發育提供營養。見圖1。萌發菌與蜜環菌均為天麻與其共生期間的唯一營養來源,然而二者在侵染方式及侵入位置等方面有所不同[14]。見圖2。

圖2 萌發菌、蜜環菌與天麻共生期間的異同

蜜環菌菌絲通過機械力量和分泌化學物質突破表皮,直達大型細胞層外的一層皮層細胞并形成菌絲流細胞層。菌絲由菌絲流細胞層向外侵染并消化宿主細胞的細胞器,菌絲纏繞形成天麻與蜜環菌共生的場所——菌絲結細胞,向內侵染被消化細胞層徹底水解。天麻由消化細胞層水解菌絲獲得營養,進而發育為箭麻[2-3,14]。經過低溫休眠越冬,箭麻抽薹出土,形成花莖并開花、結種。至此,天麻完成由種子到種子的生活史[8]。

與萌發菌相似,天麻-蜜環菌共生體系需多種機制共同調節。宿主可通過Ca2+激增過程調節真菌定殖,獨腳金內酯對菌絲具有分枝誘導作用[42]。根據全基因組結果,與近緣物種比較,天麻擴張了參與Ca2+激增過程的鈣調素依賴蛋白相關基因和用于合成、分泌獨腳金內酯的關鍵基因[31]。組織特異性實時定量PCR分析結果表明,獨腳金內酯相關基因在菌絲定殖的皮層中表達量最高,線粒體基因組中37個代謝相關基因中的36個在皮層中高度表達,這與宿主細胞與菌絲在皮層處建立共生關系的功能需求高度相關[14,31]。天麻利用其基因可塑性擴張菌絲調節相關基因,并通過組織特異性表達調節菌-麻共生區域的代謝過程,增強了天麻-蜜環菌共生關系的效率。

為抵御蜜環菌過度侵染,天麻于共生階段產生自我保護機制。代謝產物分析表明,4-羥基芐基醇(4-Hydroxybenzyl Alcohol,p-HA)僅分布于宿主,然而天麻通過向共生菌絲運輸具有p-HA骨架的植物抗毒素S-(p-HA)-glutathione抵御菌絲進一步侵染[31]。通過轉錄組學將共生菌絲與純菌絲轉錄物進行比較,結果顯示共生菌絲中93.16%的差異基因表現為下調;其中與蜜環菌生命活動高度相關的纖維素酶、木聚糖酶等胞外酶相關基因全部呈下調表達[43-44]。天麻通過向菌絲運輸植物抗毒素、抑制共生菌絲生命活動等自我保護機制減弱菌絲的侵入能力,抵御了蜜環菌對宿主的過度侵染并不斷消化菌絲,使天麻-蜜環菌呈動態平衡狀態。

共生天麻能否合成并累積足夠營養貯存物質及能量物質是箭麻品質的關鍵。劉云霞等[45]通過轉錄組學比較共生天麻與商品箭麻的生長代謝差異,并選擇了植物生長過程中至關重要的氮、碳和能量代謝過程中的關鍵酶進行差異基因分析。氮素代謝是植物生長發育的關鍵生理過程[46]。在共生天麻中,谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase,GS)與天冬酰胺合成酶(Asparagine Synthetase,ASNS)編碼基因表現為顯著上調,分解氨基酸的谷氨酸脫氫酶(Glutamate Dehydrogenase,GDH)與精氨酸酶編碼基因均表現為下調,為天麻積累了氮素營養[47-49]。淀粉是高等植物的營養貯存形式[50]。轉錄組分析結果顯示,共生天麻中的可溶性淀粉合成酶(Soluble Starch Synthase,SSS)、提供淀粉底物的蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SuSy)與淀粉合成的限速酶——腺苷二磷酸-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose Pyrophosphorylase,AGPase)編碼基因均表現為上調,而具有水解功能的淀粉酶(Amylase,AMS)相關基因表現為下調[43,51-52],為天麻的生長發育貯存了營養物質。糖酵解與檸檬酸循環為產能途徑?；谵D錄組數據分析結果,共生天麻的己糖激酶(Hexokinase,HK)、丙酮酸脫氫酶(Pyruvate Dehydrogenase,PDH)、蘋果酸脫氫酶(Malate Dehydrogenase,MDH)、異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate Dehydrogenase,IDH)基因表達均上調。這表明在天麻-蜜環菌共生期間,糖酵解與檸檬酸循環代謝旺盛,由此產生大量腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)并通過顯著上調的ATP酶(Adenosine Triphosphatase,ATPase)水解,為共生天麻的成熟提供大量能量[18]。共生階段天麻大分子物質的合成及累積,為其生長發育提供了足夠的營養與能量。

綜上所述,天麻-蜜環菌共生體系具有提高共生效率、維持共生平衡、物質貯存3類共生機制。見表4。天麻與蜜環菌共生時期可通過組織特異性表達及物質運輸等途徑調節共生體系以提高共生效率并維持菌-麻體系動態平衡;同時,宿主可通過調節代謝相關基因貯存營養及能量物質以保障箭麻的成熟。

4 展望

天麻為我國傳統的珍貴藥材,其悠久的藥用歷史和顯著的臨床療效吸引著學者們的逐漸關注。目前天麻種質資源、遺傳信息與菌-麻共生體系的分子調控機制相關研究已初見成果。為充分發揮天麻藥用價值與經濟價值,天麻物種相關研究應重點關注以下幾點。

4.1 遺傳信息的合理利用 天麻的遺傳信息是天麻分子育種的寶貴資源。對不同天麻種質進行遺傳多樣性分析,建立天麻DNA種質資源庫,為不同種質資源的區分鑒定與優良品種遺傳特質的確定提供可靠的分子依據。在此基礎上高效利用優良性狀的控制基因,通過分子設計與全基因組分子標記輔助選育,可助力培育優良新品種。

4.2 組學技術的整合利用 當前天麻的分子生物學研究多基于基因組、轉錄組、蛋白組等單一組學技術進行,應采用多組學技術,從多層次、多因素的全局性角度進行整合研究,建立并完善基因-表型組數據庫,系統闡述天麻共生體系的調控機制。

表4 天麻-蜜環菌共生階段分子機制

4.3 天麻產業的持續完善 目前,天麻產業已逐漸由粗加工飲片向精細加工產品轉變。通過加強優良品種選育、種植基地建設確保天麻的產量和質量,并以此為基礎開展產品多元化研究,將天麻產業拓展到除食品、藥品、保健品以外的煙、酒、茶、化妝品各領域,將助力天麻產業創造更多的經濟效益、社會效益。