補腎活血法治療腰椎間盤突出癥的用藥規律和潛在分子機制預測

劉 劍 楊 雷 沈 浮 聶 穎

(1 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙，410007； 2 湖南中醫藥大學，長沙，410208)

腰椎間盤突出癥(Lumbar Disc Herniation，LDH)是導致腰腿痛最常見的原因之一[1]，其主要病理學變化包括早期的纖維環內板層膠原網絡的紊亂加之椎間盤髓核中蛋白多糖的丟失，導致椎間盤的水分減少，隨著纖維環撕裂的加重，使得凝膠狀的髓核組織突出并壓迫腰骶神經根、馬尾神經等鄰近組織[2]。隨著社會人口老齡化和人們生活方式的改變，LDH的發病率明顯增加。LDH具有高致殘率，給社會和家庭帶來了沉重的負擔[3-4]。然而大多數的LDH患者并不需要手術治療。近年來，中醫藥治療越來越受到人們的重視。LDH歸屬于中醫學“腰痹”病范疇，病機多為本虛標實，其中以腎虛為本、瘀血為標，加之腎虛勞傷，感受寒濕之邪誘發經絡閉阻，氣血瘀滯而發病[5]。腎主骨，腎虛則元氣不足，氣血運行不暢，瘀血內生，腰府失養，日久凝結成痹，腎虛同時伴有血瘀，血瘀隨時間遷移可出現腎虛，二者又能互為因果而成惡性循環[6-7]，因此補腎活血、標本兼治為目前LDH辨證論治的基本大法。

由于醫家臨證經驗的差異性和中藥本身的復雜性，補腎活血法在治療LDH的臨床運用中處方側重各有不同，因此，從有效治療LDH的臨床方劑中挖掘用藥規律及尋找核心方藥并分析其作用機制，對于豐富補腎活血法的科學內涵及新藥的開發具有重要意義。隨著信息科學技術的高速發展，數據挖掘、生物信息學、網絡藥理學等新興技術的應用極大地促進了中醫藥的科學認識，在解決中醫藥復雜性方面發揮了重要作用[8]。數據挖掘被公認為發掘核心配伍及處方潛在關聯的重要工具[9]，為經驗用藥與現代醫學搭建了橋梁，利于名醫處方的梳理與挖掘，為方劑精準配伍與診療提供了新視角。而多組分、多靶點的中藥方劑干預疾病的多種復雜因素大大增加了中藥復方機制研究的難度，網絡藥理學作為藥理學新興分支學科，在揭示化學成分復雜的中藥復方的藥理學規律上具有獨特的優勢，并且其整體性、系統性與中醫藥的整體觀、辨證論治等基本理論趨于一致，為中藥復雜體系研究提供了新思路，為臨床合理用藥、新藥研發等提供了新的科技支撐[10-11]。本研究利用數據挖掘聯合網絡藥理學方法的新研究模式，對補腎活血法干預LDH的用藥規律及機制進行綜合分析，為補腎活血法的中醫藥經驗提供循證醫學理論支撐，為后續研究提供新的研究思路和策略。

1 資料與方法

1.1 文獻來源 本研究的所納入的處方均來自于國家知識基礎設施數據庫(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)，為保證文獻的質量，文獻的來源限定為“中國科技論文統計源期刊”“中國科學引文數據庫”或“中文核心期刊目錄總覽”3類數據庫，高級檢索條件設置為(“腰椎間盤突出癥”OR“腰椎間盤突出”)AND“腎虛”AND“血瘀”，閱讀文獻內容并提取腎虛血瘀相關LDH的中藥處方，時間設定為2000年1月1日至2020年8月1日。

1.2 納入標準 1)納入的中藥處方符合補腎活血法治療LDH的相關臨床研究文獻，包括臨床隨機對照試驗、臨床案例報道、名老中醫專家經驗等；2)納入的文獻需有“腎虛血瘀型”“腎虛血瘀證”等辨證的相關描述；3)處方中各中藥的組成需明確，對于多次復診的臨床病案只納入首次處方；4)處方的療效在文獻中應明確記載有效。

1.3 排除標準 1)動物細胞實驗、理論總結、系統綜述等非臨床相關研究文獻；2)中藥外治、離子導入等非口服藥物治療文獻；3)方劑中藥物組成不全面或單味用藥的文獻；4)剔除相同用藥文獻。

1.4 研究方法

1.4.1 藥名規范化標準處理 依據2020版《中華人民共和國藥典》對納入藥物名稱標準化處置[12]，而炮制方法具有差異的或者同類藥物不同稱呼的進行名字的統一規范。

1.4.2 數據錄入與核對 將篩選并規范后的處方錄入中醫傳承計算平臺V3.0(TCMICS V3.0)中的數據采集模塊中，為避免錄入時可能出現的紕漏，由2人負責核準相關數據，來確保數據錄入準確性。

1.4.3 藥物頻次屬性統計 依據藥物出現的頻次高低進行排序，并統計藥物的四氣、五味、歸經信息，進行可視化展示。

1.4.4 組方關聯規律分析 設置TCMICS V3.0平臺中的“支持度個數”參數為17，“置信度”參數為0.5，點擊用藥模式、規則分析、網絡拓撲并導出Excel及可視化，用以分析方劑藥物的組方關聯規律。

1.4.5 組方聚類規律分析 k均值聚類算法(k-means Clustering Algorithm)是基于迭代求解進行聚類算法的分析方法，其把任意研究對象支配于其距離最短的聚類中心，以達到最佳的聚類選擇[13]。利用TCMICS V3.0平臺中的k均值聚類算法與回歸模型對處方進行聚類規則分析，聚類個數設置為5個，進行核心類方組合提取，并在核心類方的基礎上模擬出新處方。

1.5 網絡藥理學研究

1.5.1 核心藥物組合及類方的成分及靶點篩選 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18篩選核心藥物的活性成分及對應靶點，與GeneCards、在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)數據庫中獲取的LDH靶基因相映射，獲取核心處方干預LDH的潛在靶標，并建立藥物-活性成分-靶標網絡模型。

1.5.2 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建 將潛在靶點導入STRING 11.0，進行蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)分析，將結果導入Cytoscape 3.7.1軟件，在Network Analyzer插件中以拓撲參數度值(Degree)大于中位數的2倍為關鍵靶蛋白，繪制核心PPI網絡圖。

1.5.3 基因本體富集分析和京都基因和基因組百科全書富集分析 利用R語言(clusterProfiler包)完成潛在靶點的基因本體(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，并進行可視化展示。

2 結果

2.1 藥物頻次統計分析 共篩選并整理出104首補腎活血法治療LDH的中藥方劑，共涉及中藥233味，其中使用頻次最高的分別是當歸、牛膝、甘草、川芎、地龍。38味藥物的使用頻次大于10，小于10的藥物有195味。藥物使用頻次超過15的藥物見表1。

表1 補腎活血法治療LDH處方中高頻藥物頻次分布(頻次≥15次)

2.2 藥物性味歸經功效統計 233味藥的屬性中，性溫的中藥所占比例最多，約50.6%；五味中味苦的最多，占32.5%；歸經多屬于肝、脾、腎，其占比分別為30.3%、16.3%、15.9%；功效多屬于補虛類、活血化瘀類，其占比分別為28.7%、26.7%。見圖1。

圖1 補腎活血法治療LDH用藥性味歸經功效規律統計

2.3 組方關聯規律分析結果 關聯較為密切的藥物組合共44組。在藥對組合模式中當歸、牛膝的出現頻次最高，為36次；在多味藥組合模式中，當歸、牛膝、川芎出現的次數最高，為23次；當歸、川芎、紅花、桃仁在4味藥組合模式出現的頻次最高，為18次。按藥物組合出現頻次由高到低排序見表2。核心藥物網絡展示見圖2。

表2 補腎活血法治療LDH處方中的藥物組合分布情況(支持度≥17次)

圖2 補腎活血法治療LDH處方中核心藥物網絡

2.4 基于聚類分析的方劑組方規律分析 本研究前期進行聚類模擬中發現，將處方組合分為5類時，得到的聚類選擇的處方最佳，其核心類方組合見表3。以當歸、紅花、川芎、桃仁、甘草為核心的活血化瘀類方組合的支持度最高，其代表方為身痛逐瘀湯和桃紅四物湯加減，其次為牛膝、當歸、川芎、獨活、杜仲為核心的補腎活血類方，代表方為補腎活血湯。用不同顏色的節點表示不同類方的聚類藥物，本研究納入的處方藥物基本在回歸曲線的周圍分布較為集中，表示本聚類可信度較高。見圖3。

表3 補腎活血法治療LDH處方中的核心藥物類方

圖3 補腎活血法治療LDH處方中的核心藥物類方回歸模型

2.5 核心藥物組合的成分及靶點篩選 核心藥物組合以及核心類方進行網絡藥理學分析發現，當歸(Danggui)、牛膝(Niuxi)、甘草(Gancao)、川芎(Chuanxiong)、杜仲(Duzhong)、紅花(Honghua)、桃仁(Taoren)、黃芪(Huangqi)、秦艽(Qinjiao)、沒藥(Moyao)、乳香(Ruxiang)、獨活(Duhuo)12位藥物處于核心地位，對其進行活性成分篩選，核心藥物共涉及活性成分178個，甘草、杜仲、沒藥活性成分占比較高，分別為29.3%、20.4%、14.3%。見圖4A。核心藥物的活性成分與LDH的交集靶標共有52個。見圖4B。“藥物-活性成分-疾病靶標”網絡中共有節點244個，邊839條，平均度值為6.8。其中MOL000098(槲皮素)、MOL000006(木犀草素)、MOL000422(山柰酚)、MOL000358(β-谷固醇)、MOL000173(漢黃芩素)、MOL002773(β-胡蘿卜素)為關鍵活性成分，其度值分別為47、20、19、17、16、15。關鍵靶基因為環氧合酶-2、雌激素受體1、雄激素受體、誘生型一氧化氮合酶、乙酰膽堿酯酶，度值分別為102、91、76、75、35。見圖5。

圖4 補腎活血法治療LDH處方中的核心藥物的活性成分分布情況及與LDH疾病的交集靶標韋恩圖

圖5 補腎活血法治療LDH的核心藥物的“藥物-活性成分-疾病靶標”網絡模型

2.6 PPI網絡構建 PPI網絡中共有節點46個，邊126條，得到度值的中位數為5.3，以該值的2倍為核心靶蛋白，JUN、AKT1、IL6、MAPK1、VEGFA、FOS、MAPK14給出中文如IL(白細胞介素6)的度值符合核心靶蛋白的標準，成為補腎活血法干預LDH的核心靶蛋白。見圖6。

圖6 補腎活血法治療LDH的PPI網絡

2.7 GO及KEGG富集分析 預測得出潛在靶點的生物過程(Biological Process，BP)527條，細胞組分(Cell Component，CC)33條，及分子功能(Molecular Function，MF)82條，按照富集的基因數目進行排序，對排名前10位的條目進行柱狀圖展示。見圖7。

共富集到135條信號通路。前15條通路見表4。補腎活血法核心藥物干預LDH的潛在通路與TNF Signaling Pathway(腫瘤壞死因子信號通路)、IL-17 Signaling Pathway(IL-17信號通路)、MAPK Signaling Pathway(MAPK信號通路)、PI3K-AKT Signaling Pathway(PI3K-AKT信號通路)、HIF-1 Signaling Pathway(HIF-1信號通路)等炎性相關通路密切相關，在Th17 Cell Differentiation(Th17細胞分化相關通路)、T Cell Receptor Signaling Pathway(T細胞受體信號通路)等免疫相關通路基因富集數目較多。

圖7 補腎活血法方劑核心藥物干預LDH的GO富集分析

表4 補腎活血法方劑核心藥物干預LDH組相關KEGG富集分析

2.8 補腎活血類方干預LDH的網絡藥理學機制 “藥物-活性成分-靶點模型”中，類方的度值排名前5的活性成分均為：山柰酚、槲皮素、豆甾醇、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇。見圖8。補腎活血類方中特有活性成分為當歸素(Angelicone)、歐前胡素(Ammidin)等。活血化瘀類方中特有活性成分有紫花前胡苷(Nodakenin)、赤霉酸(Gibberellin)等。健脾補腎類方中特有活性成分有綿馬酚(Aspidinol)、柚苷素(Naringenin)、佛手內酯(Bergapten)等。活血通絡類方中特有活性成分為：蚓堿(Lumbritin)、溶蚓素(Lumbrolysin)、蚯蚓解熱堿(Lumbrifebrine)等。見表5。

類方中共有活性成分干預LDH的靶蛋白中IL6、AKT1、IL1B、VEGFA、MAPK1、JUN給出中文如IL(白細胞介素6)的度值最高。而補腎活血類方、滋陰補腎類方、活性化瘀的特征性靶蛋白分別為多巴胺D3受體、胰島素、維生素D受體，健脾補腎類方與白細胞介素17A、腫瘤壞死因子關系密切。活血通絡類方中核心靶蛋白為C-X-C基序趨化因子配體8、核因子κB亞基1。見圖9。

圖8 補腎活血類方干預LDH的“藥物-活性成分-靶點模型”

表5 補腎活血相關類方干預LDH的特征性活性成分

圖9 補腎活血類方干預LDH的PPI模型

3 討論

LDH作為一種退行性疾病，是長期腰腿痛、下肢神經功能受損的重要原因之一。大多數LDH患者可以通過藥物、物理療法以及類固醇注射等非手術治療取得良好的臨床效果，而強調辨證論治的中醫藥療法作為我國傳統醫藥的寶貴財富，其根據發病季節、特點和個體差異采用的個性化治療策略在臨床治療LDH中具有獨特療效，且避免了西藥的不良反應[14]。本病的病機主要由于腎精虧虛、生化乏源，腎精虧虛而主骨無力，從而出現下肢麻痛等不適[15]，中醫認為“痹久多瘀”“血瘀”與“腰痹”互為因果關系，故“腎虛”為本，“血瘀”為標而發為腰痹[16]，因此，肝腎虧虛、瘀血內停為LDH的重要病機，所以施以補腎活血之法正切病機。

從宏觀角度來探討補腎活血法干預LDH的用藥規律，本研究以腎虛血瘀型LDH為研究對象，對距今20年以內的相關核心雜志文獻進行處方收集，利用中醫傳承計算平臺軟件進行藥物頻次統計分析得出，當歸、牛膝、甘草、川芎、地龍的使用頻次最高，在藥物的屬性中，四氣歸屬性溫的中藥占比最多，且歸經多屬于肝、脾、腎經，功效多屬于補虛類、活血化瘀類，這與本研究納入的LDH屬于腎虛血瘀的證型相符合。在中藥的功效分析中，除補腎活血類中藥以外，亦多見配伍祛風除濕、解表散寒之藥，體現LDH病性多屬于本虛標實、虛實夾雜，病機在本為肝脾腎不足，在標為寒濕之邪閉阻絡脈。基于關聯規則對補腎活血法治療LDH進行組方規律分析，發現當歸、牛膝藥對出現頻次最高。現代藥理學研究表明，當歸具有良好的抗炎活性及神經保護功效，當歸提取物可降低脂多糖誘導的RAW264小鼠巨噬細胞一氧化氮和腫瘤壞死因子-α的產生以及誘導型一氧化氮合酶和環氧合酶-2的表達，從而發揮抗炎作用[17]，且當歸酮對小鼠成纖維細胞中神經生長因子的產生有促進作用[18]。牛膝總皂苷作為牛膝的主要活性成分，可通過沉默信息調節因子1自噬信號通路促進大鼠椎間盤髓核細胞存活和細胞外基質合成[19]。在4味藥組合模式中，當歸、川芎、紅花、桃仁的組合處于核心地位，為《醫宗金鑒》中桃紅四物湯的主要成分，動物實驗研究表明，能夠顯著降低血瘀模型大鼠全血、血漿及血清的黏度比，具有較好的抗血小板活化及抗血栓作用，從而達到中醫意義上的活血化瘀作用[20]。因此，采用數據挖掘方法得出的高頻中藥，其治療LDH亦有現代醫學的基礎。此外，采用k均值聚類算法得出的聚類方案中，將補腎活血法治療LDH的處方用藥分為5類時，回歸模型提示，納入藥物集中分布于核心類方曲線周圍，說明所得核心類方最具有代表性。核心類方的來源多為補腎活血湯、身痛逐瘀湯以及六味地黃湯中的藥物，并且聚類處方除活血化瘀、補腎活血法支持度最高以外，通絡、健脾、滋陰之法常配合補腎活血協同運用，體現補腎活血法干預LDH治法的靈活性。

對補腎活血法干預LDH的核心藥物進行提取，發現當歸、牛膝、甘草、川芎、杜仲、紅花、桃仁、黃芪、秦艽、沒藥、乳香、獨活12位藥物處于核心地位，在“藥物-活性成分-疾病靶標”網絡模型中，槲皮素、木犀草素、山柰酚為關鍵活性成分，并作用于環氧合酶-2、雌激素受體1、雄激素受體等多個靶基因，體現補腎活血法干預LDH具有多成分、多靶點的特點。槲皮素、木犀草素均為抗氧化作用較強的黃酮化合物，槲皮素不僅具有神經保護功效，還能提高肌肉的抗疲勞耐性[21]，研究證實槲皮素在氧化損傷介導的神經退化模型中發揮神經保護作用，還可以通過抑制核因子κB通路激活減輕周圍神經缺血再灌注損傷[22]，其可抑制Toll樣受體4/核因子κB信號通路介導的炎癥反應以及C-胱天蛋白酶3和Bax的表達水平，從而抑制細胞凋亡以減輕神經損傷[23]。槲皮素可通誘導過氧化物酶體增殖物激活受體輔激活物-1α的表達，調節線粒體氧化酶的活性從而提高機體肌肉的疲勞耐受力[24]。木犀草素的多種藥理活性被證實與其抗炎作用有關，其結構含有一定數目的酚羥基，可通過抑制一氧化氮合酶來減少一氧化氮的合成以發揮抗炎及抗氧化的作用[25]。山柰酚具有多種成骨生物活性，如抑制破骨細胞生成和誘導軟骨生成[26]，其可通過降低炎癥介質水平和通過抑制核因子κB P65的核移位來增加抗炎細胞因子(白細胞介素-10)以減輕炎癥[27]。在類方的特征性活性成分中，蟲類藥物的使用使作用于LDH的靶點更為豐富，活血通絡類方中的地龍含有豐富的蚓素，不僅具有良好的解熱鎮痛功效，還具有抗凝、促進血液循環的作用[28]。本研究對補腎活血法核心藥物活性與潛在靶點有較高親和力的成分進行預測，但未被報道的成分可后期開展藥效實驗加以驗證，可為中藥功效及標志物的發現奠定基礎。

PPI網絡模型提示補腎活血法核心藥物組合通過JUN、蛋白激酶B1、白細胞介素6、促分裂原活化的蛋白激酶1、血管內皮生長因子A、FOS、促分裂原活化的蛋白激酶14干預LDH的可能性較大。JUN是一種快速反應早期基因，c-Jun氨基端激酶是促分裂原活化的蛋白激酶家族的重要成員，并參與病理性神經痛的發生[29]。椎間盤組織中的白細胞介素-6炎癥介質在椎間盤退變的早期可顯著增加，其在LDH神經損傷和病理性疼痛的發生中起重要作用，白細胞介素-6抑制劑可顯著減輕慢性壓迫模型大鼠的疼痛[30]。有學者利用白細胞介素-6基因沉默治療LDH，可顯著減輕脊髓神經早剝模型大鼠的機械性痛覺過敏[31]。蛋白激酶B1在退化椎間盤組織的新生血管的生長中也起著重要作用，而新的血管生成可能是一個負性因素，它可以招募炎癥介質和細胞，加速基質破壞和退化過程[32]。血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)在椎間盤退變及病程進展中起關鍵作用，目前有學者提出VEGF的過表達可能是退變模型的椎間盤組織退變的始發因素，亦可能是自我修復以及自噬的結果[33]。而在類方的作用靶蛋白的結果中，五大類方所得共有的作用靶蛋白與核心藥物組合的靶點類似，而每類處方作用的特征性靶點則各有不同，補腎活血類方、滋陰補腎類方、活性化瘀的特征性靶蛋白分別為多巴胺D3受體、胰島素、維生素D受體，健脾補腎類方與白細胞介素17A、腫瘤壞死因子關系密切。活血通絡類方中核心靶蛋白為C-X-C基序趨化因子配體8、核因子κB亞基1核因子κB亞基1，其中白細胞介素17A、腫瘤壞死因子均與炎癥反應相關。有研究報道核因子κB亞基1在鼠髓核細胞炎癥反應和凋亡中發揮促進作用[34]，維生素D受體的基因多態性同樣影響著椎間盤退變的發生率[35]，而CXC趨化因子配體8以及多巴胺D3受體尚無文獻報道其為LDH的相關靶點。

綜上分析，補腎活血法干預LDH的靶點較為豐富，也側面印證了中藥復方干預疾病的復雜性。

在補腎活血法干預LDH的GO及KEGG通路分析中，關鍵通路主要與腫瘤壞死因子信號通路、白細胞介素-17信號通路、PI3K/AKT等炎癥相關通路密切相關，在Th17細胞分化相關的免疫相關通路基因富集數目較多。現代研究證實了本預測結果中相關炎癥通路在椎間盤退變中的關聯性，白細胞介素-17A與椎間盤退變密切相關，其可通過介導腫瘤壞死因子-α信號上調退變模型小鼠髓核細胞ADMA-TS-7的表達來影響免疫缺陷病(Immunodeficiency Disease，IDD)的發生[36]，并且白細胞介素-17A可通過激活人退變髓核細胞中的磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase-protein Kinase B Pathway，PI3K/AKT)信號通路來抑制自噬，可能有助于開發未來的靶向治療方法[37]。在髓核所處的復雜的細胞外基質微環境中，含有高水平的硫酸化蛋白聚糖，其通過與陽離子的相互作用，為組織提供其特有的生物力學特性，現代研究證實，PI3K/AKT激活能調節細胞生長、增殖、遷移和黏附，是控制聚集蛋白聚糖合成的重要途徑[38]。自身免疫學說是LDH發病機制的重要組成部分，Th17細胞在許多免疫介導疾病的發病機制中起重要作用，Th17相關的細胞因子通過上調退變椎間盤細胞CC趨化因子配體20的分泌而形成一個正相趨化性反饋環，從而在退變椎間盤的發育中起作用[39]。因此，補腎活血法治療LDH作用機制不僅涉及抑制局部組織的炎癥反應，還可能通過調節全身免疫平衡的途徑進行綜合干預，這與中醫藥治療疾病的整體觀念不謀而合，亦體現了補腎活血法在痹證治療中的科學內涵。

本研究亦有諸多不足之處。首先，本研究基于CNKI進行文獻的收集，且納入的數量有限，而對于補腎活血法的理解著眼于各醫家自身的理解，以各醫家醫案處方的核心藥物來代表補腎活血法，難免存在偏倚。其次，本研究納入的核心藥物的活性成分均來自TCMSP，由于TCMSP的局限性，地龍藥物尚未納入其中，且數據庫并不能完全代表某個藥物的所有活性成分，亦是本研究的局限之處。本研究的預測結果仍需要實驗進一步驗證。

綜上所述，本研究運用數據挖掘和網絡藥理學方法，收集各醫家補腎活血法干預LDH的處方進行用藥規律及機制預測，一定程度上科學闡述了補腎活血法的科學性，對于后續機制探討有一定的參考意義。