防風藥材多指標綜合質量評價及指紋圖譜研究

陳 昊 李心愿 劉 霞 張雪瓊 姚子豪 汪沁柔 熊富良

(1 武漢理工大學，武漢，430070； 2 武漢同濟中維醫(yī)藥有限責任公司，武漢，430056)

防風是傘形科植物防風Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，習稱公防風，最早收載于《神農本草經》，被列為上品，具有祛風解表、勝濕止痛、止痙的功效，主要用于治療外感風寒、頭暈目眩、風濕痹痛、骨節(jié)疼痛等病癥[1-2]。防風含有色原酮類、香豆素類、多糖類等多種化學成分[3-9]，防風功效包括抗氧化、解熱鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤等[10-11]。

目前防風主要以產地進行區(qū)分，主要參考依據為《七十六種藥材商品規(guī)格標準》，如把產于東北三省、內蒙古、河北張家口、山西雁北及陜西榆林者稱“北防風”；產于河南、山西運城、陜西扶風者稱“水防風”；產于云南者稱“云防風”；產于四川東部萬縣、涪陵、宜賓者稱“川防風”；產于青海、甘肅、寧夏者稱“西北防風”；質量等級劃分不合理，未進行純度、有效成分含量、安全性等指標限量規(guī)定，導致防風質量參差不齊，影響了臨床用藥的安全有效[12-13]。

為客觀、有效地評價不同產地防風藥材的質量，研究收集了15批不同產地防風藥材，結合防風含量測定、水分、灰分及浸出物等理化指標及防風指紋圖譜，通過主成分分析等藥理方法，構建防風藥材綜合質量評價方法，對防風藥材進行多指標數據質量評價，為藥材的質量評價提供更加直接的量化指標[14]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津公司，日本，型號：Shimadzu LC-16)；萬分之一電子天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型號：ME-204)、十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型號：XS205)、超聲儀(昆山美美超聲儀器有限公司，型號：KQ-3200B)、粉碎機(浙江紅景天工貿有限公司，型號：DE-100)、烘箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號：101-1)、水浴鍋(常州國華電器有限公司，型號：HH-4)、電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號：DZTW-2000)。

1.2 試劑與藥材 甲醇(AR，成都科隆化學品有限公司，批號：2021111702)、乙醇(AR，湖南匯虹試劑有限公司，批號：202002251)、甲醇(HPLC，康科德，批號：2022MG001)、升麻素苷(純度94.6%，中國食品藥品檢定研究院，批號：111522-201913)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(純度97.4%，中國食品藥品檢定研究院，批號：111523-201811)、升麻素(中國食品藥品檢定研究院，批號：111710-200602)、純水(娃哈哈，批號：202110122106HT)，其他試劑均為分析純。

防風藥材經武漢理工大學化學化工與生命科學學院劉霞副教授鑒定為防風Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.。防風藥材信息見表1。

表1 防風藥材信息

2 方法與結果

2.1 水分、浸出物、總灰分及酸不溶性灰分測定 按照《中華人民共和國藥典》(2020版)對15批防風藥材的水分、浸出物、總灰分以及酸不溶性灰分進行測定，15批防風藥材的水分：含水量為8.7%～9.7%，平均含水量為9.3%，含水量均小于10.0%，符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。15批防風藥材的浸出物：浸出物含量為29.8%～36%，平均浸出物含量為33.3%，浸出物含量均大于13.0%，符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。15批防風藥材中的總灰分：總灰分為5.30%～6.38%，平均灰分為5.88%，總灰分均小于6.5%，符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。15批防風藥材中的酸不溶性灰分：酸不溶性灰分為0.8%～1.59%，酸不溶性灰分平均為1.41%，酸不溶性灰分均小于1.6%，符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。見表2。

表2 15批防風藥材的水分、浸出物、總灰分及酸不溶性灰分測定及RSD(%)

2.2 防風藥材中升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：依利特Supersil ODS2 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-水為流動相，檢測波長為254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，分析時間30 min。

2.2.2 對照品溶液的制備 取升麻素苷對照品及5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，分別加甲醇制成每毫升各含60 μg的溶液，即得[1]。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品細粉約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定重量，水浴回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[1]。

2.2.4 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液各3 μL與供試品溶液2 μL，注入液相色譜儀，測定，即得[1]。15批防風藥材中升麻素苷的含量為0.187 6%～0.590 5%，平均值為0.348 9%；5-O-甲基維斯阿米醇苷含量為0.219 4%～0.408 0%，平均值為0.295 5%；二者總含量為0.428 4%～0.992 7%，平均值為0.644 3%；15批防風藥材中升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷總含量均大于0.240 0%，符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。見表3。

表3 15批防風藥材的含量測定及RSD(按干燥品計算)(%，n=2)

2.3 多指標成分分析 采用SPSS 22.0統計軟件對15批防風藥材的浸出物、升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷3個指標進行標準化(Z-score法)處理。主成分分析數據見表4。提取特征值≥1的前2個成分，累計貢獻率達到92.751%，結果表明前2個成分基本能代表原始數據所反映的信息，分析得到的線性組合表達式為：Y1=-0.659 9×X1+0.213 1×X2+0.720 3×X3；Y2=0.391 7×X1+0.915 9×X2+0.088 0×X3；F=0.571 18×Y1+0.356 33×Y2，將15批藥材樣品進行線性計算后，帶入綜合評價函數，計算綜合得分值，分值越高，說明樣品的綜合品質越高。15批防風藥材樣品的綜合得分見表5。FF-3批樣品的綜合得分最高，綜合質量最優(yōu)。

表4 主成分分析數據(%)

表5 15批防風藥材樣品綜合得分值

2.4 防風指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件 采用Agela Innoval C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)以甲醇(A)-水(B)為流動相，梯度洗脫，0～10 min，B相70%～55%；10～20 min，B相55%；20～30 min，B相55%～35%；30～45 min，B相35%～10%；45～60 min，B相10%；60～65 min，B相10%～70%；65～80 min，B相70%；流速為1.0 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測波長為254 nm；進樣體積為10 μL。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取升麻素、升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，加甲醇溶解，制成每毫升含50 μg的溶液作為對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取防風藥材粉末(過5號篩)約1.0 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定重量，超聲30 min，放冷至室溫后用甲醇補足減失重量，搖勻后濾過，用0.45 μm有機濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.4.4 精密度實驗 取防風藥材粉末(編號：FF-1)，按“2.4.3”制備供試品溶液，色譜條件按“2.4.1”，連續(xù)進樣6次，記錄圖譜，導入2004 A版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》軟件，顯示各圖譜間相似度均為1，各峰保留時間RSD值均小于3%，峰面積RSD均小于3%，說明該指紋圖譜方法的精密度良好。

2.4.5 重復性實驗 取防風藥材粉末(編號：FF-1)，按“2.4.3”制備供試品溶液，平行6次，按“2.4.1”下色譜條件方法進樣，記錄圖譜，導入2004 A版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》軟件，顯示各圖譜間相似度均為1，峰保留時間RSD值均小于3%，峰面積RSD值均小于3%，說明該指紋圖譜方法的重復性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性實驗 取防風藥材粉末(編號：FF-1)，按“2.4.3”制備供試品溶液，按“2.4.1”下色譜條件方法，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄圖譜，導入2004 A版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》軟件，顯示各圖譜間相似度均為1，共有峰保留時間RSD值均小于3%，共有峰峰面積RSD值均小于3%，說明樣品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.7 樣品測定及分析 取各批次防風藥材粉末，按“2.4.3”制備供試品溶液，按“2.4.1”下色譜條件方法記錄色譜圖，導入2004 A版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》軟件，S1-S15對應FF-1至FF-15，設置時間窗口為0.3 min，以中位數的方式生成對照指紋圖譜。生成圖譜見圖1。得到8個共有峰，指認出3個成分。共有峰及指認峰結果見表6。相似度結果見表7。結果顯示，15批防風藥材相似度均>0.9，表明藥材間相似度較高。

表6 15批防風藥材共有峰峰面積RSD

表7 15批防風藥材的相似度結果

2.5 指紋圖譜分析

2.5.1 聚類分析 以15批樣品8個共有峰面積為變量，運用SPSS 20.0統計軟件進行聚類分析，采用組間連接法，利用平方歐氏距離作為樣品的測度，對其進行系統聚類分析，得到聚類樹狀圖。見圖2。將樣品大致分為2類，Ⅰ類為河南產防風，俗稱水防風，Ⅱ類為河北、山西、內蒙古產防風，俗稱北防風類，聚類分析結果說明產地對防風藥材質量有一定的影響，聚類結果與“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”結果相似。

2.5.2 主成分分析 將15批防風藥材的8個共有峰面積導入SPSS 20.0統計軟件進行主成分分析。主成分分析數據見表8。提取特征值≥1的前3個成分，累計貢獻率達到84.911%，結果表明前3個成分基本能代表原始數據所反映的信息，得到的線性組合表達式為：Z1=-0.219 5×Q1+0.501 6×Q2+0.062 6×Q3+0.546 1×Q4+0.225 9×Q5-0.175 0×Q6+0.323 7×Q7+0.460 1×Q8，Z2=0.528 1×Q1-0.215 0×Q2+0.427 4×Q3+0.072 1×Q4+0.375 5×Q5+0.459 9×Q6+0.357 3×Q7+0.083 1×Q8，Z3=-0.079 9×Q1+0.194 1×Q2+0.513 7×Q3-0.093 0×Q4-0.545 5×Q5+0.338 4×Q6-0.319 6×Q7+0.411 8×Q8，F=0.364 84×Z1+0.296 30×Z2+0.187 97×Z3，將15批藥材樣品進行線性計算后，帶入綜合評價函數，計算綜合得分值，分值越高，說明樣品的綜合品質越高。FF-3批樣品的綜合得分最高，綜合質量最優(yōu)。15批防風藥材樣品的綜合得分情況見表9。根據因子負荷矩陣表，推測影響防風差異的并不是單一成分，而是多成分(群)協同作用的結果，峰2、峰4、峰7和峰8在主成分1上載荷絕對值最大；峰1、峰3、峰6、峰5和峰7在主成分2上的載荷絕對值最大；峰3、峰5和峰8在主成分3上的載荷量最大。見表10，圖3。

圖1 15批防風藥材相似度評價譜圖

圖2 15批防風藥材系統聚類

表8 15批防風藥材主成分分析結果(%)

3 討論

防風藥材中含有多類不同的化學成分，影響防風藥材質量的因素較多，僅根據單一化學指標進行定性定量分析評價藥材質量，易產生片面性。多指標綜合評價中評價指標權重分配不均又會導致評價對象優(yōu)劣順序的改變，因此權重的合理性、準確性直接影響評價結果的可靠性[15-17]。采用客觀賦權評價方法對防風的浸出物、升麻素苷含量、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量3種指標性成分設置權重系數，避免主觀因素造成的誤差，能更全面、客觀地評價防風藥材質量。由實驗結果可知，15批藥材間浸出物、含量測定、灰分等質量指標存在一些差異，RSD值均大于5%，說明不同產地及不同生長環(huán)境對防風藥材含量影響較大，結果顯示15批藥材中河南安陽產防風質量更優(yōu)。

表9 15批藥材防風藥材指紋圖譜綜合得分值

表10 因子負荷矩陣

圖3 載荷圖

在指紋圖譜分析方法建立過程中，為盡可能多地提取主要代表性成分，通過比較超聲與回流2種提取方式，并考察純水、甲醇和乙醇3種不同溶劑的提取效果，以及不同提取時間的提取效果，考察流動相、柱溫、流速等因素的影響，以色譜圖出峰個數、峰形、基線平穩(wěn)性等為指標進行綜合考察，結果顯示，前處理方式為甲醇超聲30 min時，可以盡可能多地提取主要成分，色譜條件選擇1.0 mL/min流速、40 ℃柱溫、254 nm以及甲醇-水的流動相時色譜圖效果最佳。通過大量預實驗來確保建立的指紋圖譜共有模式具有代表性，通過對指紋圖譜結果進行聚類及主成分研究分析[18-19]，可將15批藥材大致分為2類，Ⅰ類為河南產防風，俗稱水防風，Ⅱ類為河北、山西、內蒙古產防風，俗稱北防風類，聚類分析結果說明產地對防風藥材質量有一定的影響。通過對8個共有峰進行主成分分析，得到的3個主成分貢獻率達84.911%，可基本代表原始數據的整體信息，根據載荷圖發(fā)現8個共有峰對結果均有影響，說明影響防風質量的不是單一成分，而是多成分(群)協同作用的結果。

本研究將多指標綜合評價與指紋圖譜整體性評價2種評價方式相結合對不同產地的防風藥材進行質量評價，結果顯示2種評價方法得出的結論基本一致。2種評價方法相結合可以更加全面地評價藥材質量，對建立更加全面、科學、合理的中藥質量評價體系具有一定的參考意義。