黃芩MYB轉錄因子家族全基因組鑒定與分析

王曉童 向 麗 鄔 蘭 高冉冉

(1 中國中醫科學院中藥研究所/青蒿素中心，北京，100700； 2 東北林業大學生命科學學院，哈爾濱，150040)

黃芩(Scutellariae Radix)是我國傳統中藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，其基原植物為唇形科(Lamiaceae)植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)[1]。研究表明黃芩地上和地下部分積累不同的黃酮類活性成分，地上主要積累野黃芩苷、野黃芩素、芹菜素、木樨草素等，地下主要積累黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等4′-脫氧類黃酮[2]。黃芩及其黃酮類活性成分均具有良好的臨床藥用價值，在新型冠狀病毒肺炎的治療中，黃芩作為傳統中藥發揮重要作用，是《新型冠狀病毒診療方案》中“清肺排毒湯”“宣肺潤燥解毒方”的成分之一[3]。現代藥理研究表明，黃芩提取物可以體外抑制新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)中的蛋白酶3CLpro活性和SARS-CoV-2在Vero細胞中的復制[4]。此外，黃芩素及黃芩苷等成分被報道具有改善飲食引起的肥胖和肝脂肪變性、抗菌等活性。因此，揭示黃芩中調控黃酮類活性成分生物合成的轉錄因子及其調控機制，對于培育高黃酮含量的黃芩種質、黃芩相關藥物研發等具有重要價值。

MYB轉錄因子(v-Myb禽成髓細胞病病毒癌基因同源物)是植物界中數量最多的轉錄因子家族之一，其在N端含有一段能夠與DNA結合的高度保守的基序，該基序通常由1～4個不完整的重復片段組成，每個重復片段50～53個氨基酸，組成3個α-螺旋并形成螺旋-轉角-螺旋(Helix-turn-helix，HTH)結構，MYB轉錄因子通過HTH結構插入到靶DNA的大溝中進行結合，從而調控靶基因的表達。依據重復序列的數量和種類，MYB可分為4個亞族：1R-MYB、2R-MYB(R2R3-MYB)、3R-MYB和4R-MYB，R2R3-MYB是數量最多、功能也最為廣泛的亞族[5-7]。

MYB轉錄因子是目前研究較多的轉錄因子家族，廣泛參與調控植物的生長發育、抗逆脅迫、次級代謝產物的積累。已報道研究中，MYB參與調控植物黃酮類成分合成的報道居多，如蘋果(Malusdomestica)MdMYB9和MdMYB11都能與花青素合成酶(Anthocyanin Synthetase，ANS)、花青素還原酶(Anthocyanidin Reductase，ANR)和無色花青素還原酶(Leucoanthocyanidin Reductase，LAR)的啟動子結合，調控花青素和原花青素的積累[8]；蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中的MYB轉錄因子MtLAP1可以結合MtGSTF7啟動子區來激活其表達，從而調控蒺藜苜蓿中花青素的積累[9]；擬南芥(Arabidopsisthaliana)、龍膽(Gentianatriflora)中的MYB轉錄因子也可以調控黃酮類成分的積累[10-12]。

迄今為止，黃芩活性成分合成的調控機制鮮有報道。目前報道的黃芩中參與黃酮類化合物合成的SbMYB只有3個[13-14]。隨著生物技術的快速發展，黃芩的全基因組測序已經完成[15-16]，黃芩中黃酮類活性成分的生物合成途徑及關鍵酶已基本解析[17-19]，基于全基因組的SbMYB轉錄因子家族的系統分析和研究提上日程。本研究首次基于黃芩的全基因組對其中MYB轉錄因子進行系統鑒定和分析，預測可能參與黃酮類化合物生物合成相關的調控基因，為深入研究黃芩中黃酮類成分合成的調控機制提供支撐。

1 材料與方法

1.1 基因家族的鑒定 黃芩基因組在the Genome Warehouse(https://bigd.big.ac.cn/gwh)下載(登錄號：GWHAOTO00000000)。采用以下2種方法進行SbMYB轉錄因子家族成員的鑒定：1)從PFAM數據庫(http://pfam.xfam.org/)下載MYB轉錄因子特有的保守結構域模型(PF00249)，使用HMMER軟件在黃芩基因組數據庫中進行搜索，E-value設為e-5；2)從植物轉錄因子數據庫(http://planttfdb.gao-lab.org/index.php)下載168條擬南芥AtMYB蛋白序列，通過本地BLAST，與黃芩基因組數據庫進行同源比對。將二者的比對結果整合，使用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和PFAM蛋白數據庫進行保守結構域預測。通過PROSITE(http://www.expasy.org/prosite/)針對篩選出的SbMYB轉錄因子進行蛋白質理化性質預測。通過WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)對SbMYB進行亞細胞定位分析。

1.2 基因家族分類與系統發育樹 為研究黃芩MYB轉錄因子的系統進化關系并確定其亞族分類，以模式物種擬南芥為參考，利用最大似然法對168條AtMYB和146條SbMYB蛋白的全長序列構建系統發育樹。序列與MAFFT進行比對，比對結果使用IQ-TREE2.0.3構建最大似然法系統發育樹，MFP參數選擇最優模型，BOOTSTRAP設為1 000次。系統發育樹在ITOL在線網站(https://itol.embl.de/)進行編輯。根據黃芩與擬南芥MYB轉錄因子的系統發育關系，對黃芩SbMYB基因家族成員進行亞族分類。

1.3 基因結構與染色體分布分析 從黃芩基因組注釋文件中提取146個SbMYB基因的注釋信息，將其提交到GSDS2.0(http://gsds.gao-lab.org/index.php)網站進行基因結構分析，確定基因的內含子數量，并繪制內含子和外顯子模式圖。從SbMYB基因注釋文件中獲取基因位置信息，并進行統計整理，使用Tbtools進行可視化分析。

1.4 保守結構域與基序分析 采用基序誘導多個最大期望值(Multiple Expectation Maximization for Motif Elicitation，MEME)在線軟件(http://meme-suite.org/)對SbMYB的保守基序進行分析。參數設置為：同一基序在一條序列中出現的次數為“any”，基序長度范圍6～100個氨基酸殘基，基序最大發現數目15個，其他參數為默認值。將以上結果與PFAM數據庫獲得的保守結構域信息一同提交到ITOL網站進行可視化分析。

1.5 基因表達模式分析 根據黃芩SbMYB轉錄因子在根、莖、葉和花4個不同組織中編碼基因的表達量FPKM值，繪制SbMYB轉錄因子在不同組織部位的表達量熱圖。黃芩中黃酮合成途徑結構基因已經被注釋[17]，篩選15個已驗證有功能或表達量高的黃酮類化合物合成相關基因(SbPAL3、SbC4H1、SbCLL-1、SbCLL-5、Sb4CLL7-1、Sb4CLL8、Sb4CLL10、SbCHS1、SbCHI、SbFNSII1、SbFNSII2、SbF6H1、SbF8H、SbF6H2、SbUBGAT)，根據已有的轉錄組數據，提取這15個基因在根、莖、葉和花中的表達量，與SbMYB轉錄因子繪制表達量熱圖。所有熱圖均在在線網站(https://www.omicstudio.cn/tool)繪制，FPKM值進行“+1”預處理后，取log2值，并對基因進行聚類分析。

1.6 基因調控網絡構建 為了進一步研究SbMYB轉錄因子與黃酮類化合物合成相關結構基因間調控關系，本研究將所有SbMYB和高表達的黃酮類化合物合成相關的結構基因蛋白序列提交String(https://www.string-db.org/)進行蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)預測，預測結果使用Cytoscape 3.8.0構建PPI網絡圖。篩選FPKM值大于5的SbMYB轉錄因子，使用Omicstudio平臺的Cor工具計算SbMYB轉錄因子與黃酮類化合物合成相關結構基因間的相關性，構建無向量網絡圖。相關性系數絕對值大于0.8，皮爾遜相關系數(p-value)小于0.05。

2 結果

2.1 黃芩MYB轉錄因子家族的篩選與鑒定 本研究共鑒定得到146條SbMYB蛋白序列。蛋白質理化性質和亞細胞定位分析表明，各成員的氨基酸序列長度在87 aa(SbMYB106)～957 aa(SbMYB105)之間，平均分子質量在9 884.46(SbMYB109)～107 846.15(SbMYB105)之間。蛋白質等電點大于(堿性蛋白質)和小于(酸性蛋白質)7的成員數量分別為90和56個，說明大多數為堿性蛋白質。脂肪系數均小于100，親水系數均為負值，不穩定系數小于40的蛋白序列僅5個(SbMYB55、SbMYB81、SbMYB109、SbMYB117、SbMYB137)，表明SbMYB蛋白多為親水性不穩定蛋白。WoLF PSORT預測結果顯示，144個SbMYB定位在細胞核中，SbMYB143、SbMYB120分別定位在線粒體和葉綠體中。見表1。

表1 黃芩MYB轉錄因子家族信息

續表1 黃芩MYB轉錄因子家族信息

續表1 黃芩MYB轉錄因子家族信息

續表1 黃芩MYB轉錄因子家族信息

2.2 黃芩MYB轉錄因子家族的系統進化分析 最大似然法構建擬南芥和黃芩MYB蛋白全長序列系統發育樹，自動選擇最佳模型為VT+R6，進化樹分枝上的圓圈代表支持率(%)，圓圈越大，相應的支持率也增大。結果顯示，根據與擬南芥的系統發育關系，黃芩146個SbMYB轉錄因子可以劃分為4個亞族(1R-MYB，R2R3-MYB，3R-MYB，4R-MYB)和一個未分族成員(SbMYB117)。其中，R2R3-MYB亞族成員數量最多，有116個，占總SbMYB轉錄因子的79.45%；1R-MYB有26個，占總SbMYB的17.81%，是黃芩SbMYB家族中的第二大亞族；3R-MYB、4R-MYB亞族成員數量較少，分別有2個和1個。見圖1。

圖1 黃芩和擬南芥MYB轉錄因子家族系統進化樹

2.3 黃芩MYB轉錄因子結構分析及其染色體定位 根據基因組注釋信息，繪制了SbMYB轉錄因子的外顯子和內含子模式圖。SbMYB外顯子數目2～19個，表明不同的SbMYB成員在基因結構上存在多樣性和顯著差異。同一SbMYB亞族內的外顯子數量較為保守，R2R3-MYB亞族成員大都含有2～3個外顯子，外顯子長度和位置也較為相近；1R-MYB、3R-MYB、4R-MYB亞族成員的外顯子數目明顯多于R2R3-MYB，大部分含有4～6個外顯子。不同亞族之間外顯子的位置和長度存在差異。見圖2A。

圖2 SbMYB的基因結構(A)與染色體分布(B)

依據從黃芩基因組注釋文件中獲取的SbMYB位置信息，繪制SbMYB染色體定位圖。145個SbMYB轉錄因子隨機不均勻分布在9條染色體上(chr1～chr9)，其中大多數SbMYB定位在chr1和chr2上(36個和27個)，chr6(8個)、chr7(7個)和chr9(7個)上分布較少，SbMYB106未定位到染色體上，而定位在未掛載到染色體的contig上，這與基因組的染色體組裝有關。見圖2B。

2.4 黃芩MYB轉錄因子保守結構域與基序分析 本研究對SbMYB進行保守結構域分析，共預測到4個MYB轉錄因子保守結構域，命名為MYB Domian1-4。所有的SbMYB至少含有1個MYB保守結構域。1R-MYB大都僅含1個MYB Domian1，部分成員還含有MYB Domian3，且MYB Domian3僅在1R-MYB中存在。R2R3-MYB中，最保守的結構域組成含有2個MYB Domian1，很少部分成員僅含有1個MYB Domian2。3R-MYB均含有3個MYB Domian，但組成不同，SbMYB2含有1個MYB Domian2。見圖3A。

同一基因家族的成員，其基序組成通常較為保守，且進化關系較近的成員間具有相似的基序組成。我們在SbMYB轉錄因子中共預測到15個保守基序(Motif)，命名為Motif1-15。不同亞族之間SbMYB基序組成存在差異，同一亞族SbMYB成員具有相似數目和類型的基序組成。1R-MYB亞族的保守基序為Motif7，它可能與Motif5或Motif13共同組成MYB Domian3；R2R3-MYB亞族中，Motif1、Motif2、Motif3和Motif4是其最保守的基序，依照其在基因位置上與MYB結構域的對應關系，Motif1-4可能是MYB Domian1的代表基序；3R-MYB亞族的保守基序為Motif1、Motif2、Motif3和Motif11；4R-MYB亞族僅預測到Motif3。見圖3B。

圖3 黃芩MYB基因保守結構域(A)與基序(B)分析

2.5 黃芩MYB轉錄因子的基因表達模式分析 基于黃芩根、莖、葉、花的轉錄組數據，進一步分析SbMYB在不同器官中的表達模式，結果表明，SbMYB在不同器官中具有不同的表達模式。根、莖、葉中表達模式相似，與花中的表達模式差異較大。見圖4A。對SbMYB與黃酮類化合物合成結構基因之間的表達模式分析顯示，黃酮類化合物合成相關基因大都與R2R3-MYB聚類在同一枝，表明R2R3-MYB亞族更可能參與黃酮類化合物的調控。此外Sb4CLL10、Sb4CLL7-1、SbFNSII1分別與SbMYB120、SbMYB127、SbMYB126聚在同一枝，說明黃酮類化合物合成相關基因可能也受到1R-MYB的調控。見圖4B。

圖4 不同組織中的基因表達分析

2.6 黃芩MYB轉錄因子與黃酮類化合物合成相關結構基因調控網絡 通過在轉錄組水平上對SbMYB與15個黃酮類化合物合成相關結構基因間的相關性進行分析，構建共表達網絡，結果表明，15個黃酮類化合物合成相關基因均與43個SbMYB存在強相關性(|r|>0.8)，說明它們之間可能存在調控關系。大多數SbMYB(38個)具有正調控作用，少部分SbMYB(9個)具有負調控作用。根據節點大小可以看出，SbCHI可能受SbMYB強調控作用，且大多為正調控。見圖5A。PPI網絡分析結果表明，有8個黃酮類化合物合成相關基因與SbMYB可能存在相互作用關系；部分SbMYB之間也有潛在的互作關系(如：SbMYB100和SbMYB117)，說明SbMYB之間可能形成蛋白復合體共同調節下游基因的表達。見圖5B。

3 討論

藥用植物活性成分是發揮其藥效的重要基礎，主要來源于萜類、黃酮類、生物堿類等次生代謝產物的生物合成。由于植物次生代謝產物含量少、復雜多樣、分離困難等因素限制了藥用植物的發展和應用。研究表明，轉錄因子是植物代謝合成過程中的重要調控元件[20]，通過與序列特異性DNA結合和PPI調節特定基因表達，可以作為基因表達的激活劑或抑制劑，參與次生代謝物的合成和積累，獲取高價值次生代謝產物[21-22]。

圖5 SbMYB轉錄因子與黃酮類化合物合成相關基因間的調控網絡

隨著黃芩基因組的公布，黃芩的WRKY轉錄因子家族已被系統鑒定與分析[23]。MYB是植物中家族最龐大的轉錄因子家族之一，以R2R3-MYB亞族數量最多，R2R3-MYB也是報道具有最多生物學功能的亞族[24]。本研究基于黃芩的基因組數據，注釋出146個MYB轉錄因子，其中R2R3-MYB亞族有116個，1R-MYB、3R-MYB、4R-MYB亞族成員分別有26個、2個和1個，這與擬南芥、水稻、葡萄等物種中各亞族MYB的數量分布情況相似[5-6,25]；保守結構域和基序分析表明，不同亞族間具有不同的結構域和基序組成，這可能與MYB轉錄因子功能和調控作用方式有關。如：R2R3-MYB和3R-MYB通過R2、R3 MYB結構域特異結合DNA序列，而1R-MYB一般僅含1個MYB保守結構域，可能以不同的方式結合到DNA序列上，如與端粒結合，在維持染色體穩定性中具有重要作用[26-27]。

已有較多研究表明，MYB轉錄因子參與調控植物黃酮類次生代謝產物合成，PpMYB10.1是紅皮桃(Prunus persica)花青素積累的主要調節因子，并激活PpUFGT轉錄[28]；擬南芥AtMYB12和葡萄(Vitis vinifera)VvMYBF1被鑒定為黃酮醇特異性激活劑，AtMYB12轉化至轉基因番茄(Solanum lycopersicum)中可以產生大量的黃酮醇[29-31]。黃芩中黃酮類成分的轉錄調控研究仍比較薄弱，Yuan等[13-14]研究人員前期從黃芩cDNA中篩選出19個SbMYB，并通過轉基因煙草實驗證明了SbMYB2、SbMYB7和SbMYB8可影響轉基因煙草中黃酮類化合物相關基因(NtPAL1、NtPAL2、NtC4H和NtUFGT)的轉錄水平從而影響黃酮類化合物的積累。目前黃芩中黃芩素、野黃芩素、漢黃芩素及其糖苷類黃酮成分的生物合成途徑及關鍵酶已經解析，本研究通過Cor函數計算SbMYB與黃酮類化合物生物合成結構基因間的相關性，并預測它們之間潛在的PPI關系，構建了基因調控網絡，從而預測到SbMYB轉錄因子與黃酮類化合物合成通路上結構基因間潛在的調控關系。可能參與黃酮類化合物生物合成的43個SbMYB轉錄因子中，38個SbMYB可能參與正調控，9個SbMYB可能參與負調控。

通過調節轉錄因子對代謝途徑上關鍵酶活性的調控作用，從整體角度調控代謝途徑以獲得高產量目標產物具有重要的科學價值。然而轉錄因子如何調控植物次級代謝產物的合成與積累是一個復雜的研究體系，如蘋果(Malusdomestica)中MdMYB308L可以與MdbHLH33相互作用，增強其與MdCBF2和MdDFR啟動子結合，正向調控蘋果花青素的積累，蘋果的泛素連接酶(MdMIEL1)還可以與MdMYB308L互作，促進MdMYB308L降解從而負調控花青素積累[32]，因此，揭示其復雜調控網絡與調控模式是未來的一項重要任務。本研究為黃芩中參與黃酮類成分生物合成調控的MYB轉錄因子篩選提供重要參考，在后續研究中，要結合先進的分子生物學技術，強化對重要SbMYB轉錄因子的機制解析。