茉莉酸甲酯對黃連生物堿含量積累的影響

劉 微 劉義飛 陳士林 劉 迪

(1 湖北中醫藥大學藥學院,武漢,430065； 2 中國中醫科學院中藥研究所,北京,100700)

藥用黃連為毛茛科毛茛屬植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連C.deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao或云連C.teetaWall.的干燥根莖，三者分別習稱“川連或味連”“云連”“雅連”[1]。黃連以根莖入藥，性寒，味極苦，可清熱燥濕，瀉火解毒，常用于治療泄瀉、痢疾、消渴、癰瘡腫毒等?！侗静菥V目》中記載“其根連珠而色黃，故名”[2]。目前從黃連中分離出來的成分已超過100種，可分為生物堿類與非生物堿類?，F代研究表明，黃連體內的主要活性物質為芐基異喹啉類生物堿[3]。2020年版《中華人民共和國藥典》規定黃連的指標性成分為黃連堿、小檗堿、表小檗堿、巴馬汀[1]。豐富的化學成分也賦予了黃連多種藥理作用?，F代藥理研究表明，黃連具有保護心腦血管、降糖、抗炎、抗腫瘤等顯著藥理作用，近年來，黃連在治療心腦血管系統、消化系統、內分泌系統、循環系統疾病的作用日益得到關注[3]。湖北恩施作為黃連的道地產區之一，所產黃連形如雞爪，根莖集聚成簇，黃肥堅實，品質極佳，素有“黃連之鄉”的美譽[4-5]。

黃連生長周期長，有效成分一般在4年及以上生長的植株中顯著積累[6]，產量低；同時遭受盲目開采，大部分野生黃連處于瀕危或漸危狀態；且黃連喜陰濕忌干燥，多生長在高海拔地區，適合種植黃連的地區比較少。顯著的臨床療效、嚴苛的生長環境以及當今社會對中成藥的開發，使對黃連的資源需求以及質量的要求越來越高，因此提高栽培黃連的質量對于解決黃連需求問題十分必要。

茉莉酸類植物激素屬于脂肪酸類化合物，主要包括茉莉酸(Jasmonic Acid，JA)及其衍生物茉莉酸甲酯。作為一種植物生長調節劑，茉莉酸類植物激素參與調控植物生長發育的各個過程，包括花粉發育、根生長、花青素積累、果實發育等[7]。茉莉酸類植物激素也是一種誘導子，可通過調節植物次生代謝產物生物合成過程的某些蛋白酶活性或者影響其轉錄水平從而引起植物次生代謝途徑或者代謝強度發生變化[8]，目前關于茉莉酸甲酯對植物次生代謝產物積累的影響以及對植物次生代謝產物生物合成過程的調控機制的報道有很多。

本研究利用茉莉酸甲酯能夠誘導植物體啟動內在防御機制的特性，對黃連幼苗噴施100 μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，刺激其體內生物堿的迅速積累，進而采用高效液相色譜技術對觀察組以及對照組樣品的黃連堿、鹽酸小檗堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、藥根堿含量進行測定與分析，旨在研究外源茉莉酸甲酯處理對黃連中生物堿積累的影響，并為進一步研究茉莉酸甲酯對黃連生物堿生物合成途徑的分子調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 本實驗所用黃連植株來源于湖北恩施利川箭竹溪黃連專業合作社的一年生的黃連C.chinensis幼苗，將黃連幼苗種植于植物培養室中，光照周期16 h/8 h(暗/光)，光照強度2 000 lx、溫度20 ℃、濕度60%～80%。甲醇(貨號：FT1.0101U.4000)、乙腈(貨號：FT1.01003.4000)為高效液相色譜級，購于湖北弗頓科學技術有限公司；茉莉酸甲酯溶液(上海源葉生物科技有限公司，貨號：S30685-5)；水為超純水；無水乙醇(批號：20220107)、鹽酸、碳酸氫銨(批號：20200716)、三乙胺(批號：20200920)、氨水(批號：20211115)為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；黃連標準品鹽酸小檗堿(貨號：B21449)、鹽酸藥根堿(貨號：B21451)、鹽酸巴馬汀(貨號：B21433)、表小檗堿(貨號：B20108)、鹽酸黃連堿(貨號：B21438)購于上海源葉生物科技有限公司，純度高達98%以上。

1.2 儀器 高效液相色譜儀(日本島津制作所，日本，型號：LC-10ATVP)、色譜柱(月旭科技上海股份有限公司，型號：Ultimate? XB-C18)、電子天平(萬分之一，上海菁海儀器有限公司，型號：FA1004N)、分析天平(十萬分之一，賽多利斯公司，德國，型號：SECURA125-1CN)、超聲波清洗器(上海聲彥超聲波儀器有限公司，型號：SCQ-6201)、純水儀(四川優普超純科技有限公司，型號：UPH-20)、循環水式多用真空泵(上海力辰邦西儀器科技有限公司，型號：SHZ-D(III)ABS)、全自動樣品快速研磨儀(上海凈信實業發展有限公司，型號：JXFSTPRP-64)。

1.3 方法

1.3.1 茉莉酸甲酯處理 100 μmol/L茉莉酸甲酯的配置：用移液槍移取22.92 μL茉莉酸甲酯溶液和2.5 mL的無水乙醇溶液于容量瓶中，加純水定容到1 L。對照溶液即為0.25%的乙醇溶液。

觀察組與對照組處理：將生長健壯、長勢一致的黃連幼苗分成2組，一組為觀察組，噴施100 μmol/L茉莉酸甲酯，一組為對照組，噴施0.25%的乙醇溶液。處理實驗于上午8:30開始。將配置好的觀察組、對照組溶液裝在噴壺中，均勻噴施于黃連幼苗葉片上至掛滴，分別于噴施溶液后的0 h、24 h、48 h、72 h、96 h取樣，每個樣品取6株黃連幼苗混樣，每個樣品取3個生物學重復。

1.3.2 樣品制備 樣品處理：將黃連樣品用清水洗凈，裝于布紡袋中，置于硅膠中進行干燥處理。將硅膠干燥后的樣品用快速研磨儀研磨成粉末。供試品制備：稱取樣品粉末0.1 g，精密稱定，記錄各個稱量的重量。將稱量的樣品粉末置于帶有塞子的錐形瓶中，配置甲醇-鹽酸(100∶1)溶液，精密量取25 mL甲醇-鹽酸(100∶1)溶液于裝有樣品的錐形瓶中，稱重，記錄此時裝有樣品溶液的錐形瓶重量。使用功率為250 W，頻率為40 kHz的超聲波清洗器超聲處理30 min，超聲結束后將樣品溶液置于常溫下放冷，再次稱重，用甲醇補足超聲過程揮發的甲醇，混合均勻后進行過濾處理，取2 mL過濾液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得待測樣品溶液。對照品配置：精密稱取鹽酸小檗堿1.65 mg，表小檗堿1.66 mg，鹽酸黃連堿1.20 mg，鹽酸巴馬汀1.48 mg，鹽酸藥根堿1.36 mg，分別加1 mL甲醇溶液，0.45 μm的微孔濾膜過濾，制成5種對照品溶液。將上述對照品溶液稀釋10倍后，分別量取100 μL 5種對照品溶液于2 mL定量瓶中，再加500 μL甲醇溶液制成混合標準品。

1.3.3 色譜條件 固定相采用Ultimate? XB-C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，流動相參考張琳等[9]的色譜條件，A相為30 mmol/L的碳酸氫銨溶液(含有0.1%三乙胺與0.7%氨水)，B相為乙腈，樣品總出峰時間為65.00 min。洗脫條件為梯度洗脫，程序設置為：0～15 min，15%～20%B；15～30 min，20%B；30～50 min，20%～35%B；50～55 min，35%～15%B，55～65 min，15%B。流速為1.00 mL/min，檢測波長為270 nm，進樣量為20 μL，色譜柱溫度設置為30 ℃。

2 結果

2.1 精密度、線性范圍、穩定性、重復性、加樣回收結果

2.1.1 精密度考察 隨機取1份供試品溶液，編號為HL1，按照上述色譜條件連續進樣5次，記錄5次供試品溶液色譜圖中的鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的峰面積以及各自的保留時間，并計算平均峰面積以及平均保留時間的相對標準差(Relative Standard Deviation，RSD)值，鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均峰面積的RSD值分別為2.6%，2.1%，2.8%，2.2%，2.5%，平均保留時間的RSD值分別為0.51%，0.32%，0.31%，0.21%，0.22%。表明本實驗所用方法有較好的精密度。

2.1.2 線性范圍考察 分別量取上述實驗方法中制備的黃連混合標準品0.5 mL、0.25 mL、0.125 mL、62.5 μL于2 mL定量瓶中，用鹽酸-甲醇(1∶100)定容至1 mL，加上原樣品溶液，得到系列濃度樣品溶液。分別精密吸取上述系列濃度溶液20 μL，按1.3.3色譜條件進行含量測定，以各個生物堿的峰面積積分值(Y)與樣品濃度(X)建立線性回歸標準曲線，得到鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的線性回歸方程與線性范圍。見表1。

表1 各對照品線性回歸方程

2.1.3 穩定性試驗 取上述試驗中選用的供試品溶液HL1，過0.45 μm有機濾膜，分別于0 h，6 h，12 h，18 h，24 h進行鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量測定，測得樣品中鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的平均含量分別為0.082%、0.053%、0.340%、0.148%、1.315%，RSD值分別為2.4%、2.1%、2.2%、2.5%、1.9%，表明樣品在24 h內較為穩定。

2.1.4 重復性試驗 取上述試驗中選用的供試品HL1粉末4份，每份0.1 g，對4份供試品溶液中的鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿進行含量測定，測定結果發現鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的RSD依次為2.4%、1.1%、1.3%、2.3%、2.2%，表明該方法重復性良好。

2.1.5 加樣回收試驗 取上述試驗中選用的供試品溶液HL1，加入一定量的混合標準品，按照相應的色譜條件測定樣品中鹽酸藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量，計算各個生物堿的加樣回收率，回收率分別為：103.92%、99.23%、100.01%、98.96%、100.21%。

2.2 黃連生物堿測定 按相應色譜條件對制備的混合標準品進行含量測定，得到色譜圖，其中A峰為鹽酸藥根堿、B峰為表小檗堿、C峰為黃連堿、D峰為鹽酸巴馬汀、E峰為鹽酸小檗堿。見圖1。

圖1 黃連混合標準品色譜圖

2.3 茉莉酸甲酯處理對黃連生物堿積累的影響 與對照組比較，24 h茉莉酸甲酯處理后的黃連幼苗中的多種生物堿成分，包括表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量顯著升高，48 h茉莉酸甲酯處理后的黃連幼苗中的藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿顯著性升高，72 h和96 h茉莉酸甲酯處理后黃連幼苗中的各個生物堿的含量并沒有顯著性差異。

茉莉酸甲酯處理組藥根堿的含量變化總體趨勢為：0～48 h茉莉酸甲酯處理后黃連中藥根堿含量逐漸升高，至48 h達到最大值，為對照組的1.713倍；72～96 h茉莉酸甲酯處理后黃連中藥根堿含量比對照組高，但與48 h茉莉酸甲酯處理的黃連比較，其增長率為下降趨勢。茉莉酸甲酯處理組表小檗堿的含量總體變化趨勢為：0～48 h茉莉酸甲酯處理后黃連中表小檗堿含量逐漸升高，至48 h達到最大值，為對照組的2.444倍；72 h處理后黃連中表小檗堿含量比對照組高，但與48 h茉莉酸甲酯處理的黃連比較，其增長率為下降趨勢；96 h處理后黃連中表小檗堿含量與對照組比較呈下降趨勢。茉莉酸甲酯處理組黃連堿的含量變化總體趨勢為：0～48 h茉莉酸甲酯處理后黃連中黃連堿含量逐漸升高，至48 h達到最大值，為對照組的3.15倍；24 h茉莉酸甲酯處理后黃連中黃連堿含量與對照組相比雖有顯著性差異，但其增長率沒有48 h茉莉酸甲酯處理黃連后黃連堿的增長率高；72 h處理后黃連中黃連堿含量比對照組高，但與48 h茉莉酸甲酯處理的黃連相比較，其增長率為下降趨勢；96 h茉莉酸甲酯處理的黃連中黃連堿含量與對照組幾乎一致；茉莉酸甲酯處理組鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量變化總體趨勢與藥根堿幾乎一致；48 h茉莉酸甲酯處理后黃連中鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量增長最高，分別為對照組的2.274、1.797倍。見圖2。

圖2 茉莉酸甲酯處理黃連后藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量變化

3 討論

黃連為我國傳統大宗藥材，藥用歷史悠久。根據中醫藥理論，黃連性寒，味極苦，可用于清熱瀉火、燥濕除熱。黃連的主要藥效成分小檗堿一直是臨床藥效研究的熱點對象[10]，現代臨床藥理研究表明小檗堿有顯著的抗微生物作用，主要表現在抗菌、抗病毒方面，對多種病原微生物都有抑制作用，除此之外，黃連小檗堿還具有顯著的抗炎、抗心律失常、抗高血壓、抗血脂及降血糖作用。作為流傳千年的傳統中藥，有關黃連的經典名方也有許多，如《傷寒論》中所記載的黃連阿膠湯，臨床研究表明其可治療心腎不交型失眠[11]；《傷寒論》所載“喘而汗出者，葛根黃芩黃連湯主之”，由此可見葛根黃芩黃連湯具有清熱止利的功效[12]；葛洪在《肘后備急方》記載的黃連解毒湯作為清熱劑，可瀉火解毒，治療三焦火毒證[13]。隨著中醫藥行業對黃連日益增長的需求，提高黃連有效成分含量，培育優質高含量黃連迫在眉睫。

植物次生代謝產物及其生物合成過程容易受到如干旱、澇害、病蟲害、機械損傷以及各種外源性植物激素等外界環境因素的影響。茉莉酸甲酯作為植物體內一類信號物質，是一種非常有效的外源誘導子，可在植物面對環境刺激和產生次生代謝產物過程中發揮類似于激素的作用，因此茉莉酸甲酯可影響植物的生長發育過程[14]。對植物施加外源性茉莉酸甲酯后，茉莉酸甲酯將進入植物細胞內，在相關水解酶的催化作用下形成茉莉酸。茉莉酸作為植物細胞內信號轉導的中間物質，可通過與植物氨基酸結合的方式形成茉莉酸-氨基酸聚合物。這種聚合物具有誘導效果，可在植物受到外界環境刺激時將植物防御系統信號進行轉導與放大，最終參與到植物的生長發育、防御外界環境刺激過程中[15]。植物的開花結果過程中，在花粉粒授粉到柱頭前限制花粉萌發是被子植物能否成功受精的關鍵。Mei等[16]對MAP3Kε1和MAP3Kε2在擬南芥(Arabidopsisthaliana)花粉萌發過程中所起的調控作用進行研究，最終發現MAP3Kε1和MAP3Kε2雙突變會導致擬南芥中胼胝質異常積累，茉莉酸水平升高，花粉萌發早，導致結實率顯著降低。Li等[17]研究發現包括茉莉酸在內的多種激素參與了土壤中磷極度缺失時甘藍型油菜(Brassicanapus)根系的生長過程。

外源性茉莉酸甲酯也可直接參與植物細胞中的信號轉導過程，誘導植物次生代謝產物的合成與積累。有關茉莉酸甲酯提高農產品代謝產物的研究有很多。Nakajima等[18]研究發現密封條件下用茉莉酸甲酯蒸汽處理可以增加早期葡萄(Vitisvinifera)表皮花青素積累，使得葡萄表皮紫色加深。Ortega-Hernández等[19]對羽衣甘藍(KaleSprouts)施加不同濃度的硒、硫、茉莉酸甲酯，觀測其對羽衣甘藍中次生代謝物含量的影響，結果發現茉莉酸甲酯處理羽衣甘藍后，除山柰酚和槲皮素外，大部分酚類物質的含量降低，25 μmol/L茉莉酸甲酯處理后，山柰酚和槲皮素的含量都提高了70%以上。Tang等[20]用200 μmol/L茉莉酸甲酯浸漬桃子(Prunuspersica)7 d，結果發現茉莉酸甲酯處理后對桃子果實的紅色形成有積極作用，會導致桃果實花青素積累(增加至120%)，進一步研究發現茉莉酸甲酯處理可增加與花青素生物合成相關的酶或者基因的轉錄水平，從而促進花青素的積累。施江等[21]對施加外源性茉莉酸甲酯對茶葉(Camelliasinensis)中類胡蘿卜類成分的影響進行研究，結果發現茉莉酸甲酯可以誘導茶樹鮮葉中多種脂溶性物質的積累，這對農業生產過程中培育提高茶葉品質具有科學指導意義。有關茉莉酸甲酯對生物堿合成與積累的調控研究也有很多。

目前許多國內外學者已在通過施加外源性茉莉酸甲酯等激素改善中藥有效成分含量，提高中藥品質方面有深入研究。如Li等[22]研究發現向甘西鼠尾草(SalviaprzewalskiiMaxim)毛狀根中施加茉莉酸甲酯與水楊酸后，與對照組比較，茉莉酸甲酯處理后的丹參毛狀根中丹酚酸、丹參酮Ⅱa等含量顯著升高，并通過實驗發現觀察組丹參毛狀根中與次生代謝產物生物合成過程相關的基因和酶都顯著上調；Zhang等[23]采用間歇浸沒式生物反應器體外培養金釵石斛幼苗，研究不同濃度茉莉酸甲酯以及不同處理時間對金釵石斛(DendrobiumnobileLindl)生物堿積累的影響，結果發現10 μmol/L茉莉酸甲酯處理20 d和30 d的金釵石斛幼苗的生物堿的含量和產量最高。有關茉莉酸類植物激素對生物堿積累的影響及其對生物堿生物合成途徑的調控研究也有很多。Pu等[24]采用多組學方法分析茉莉酸甲酯等多種誘導子對喜樹(Camptothecaacuminata)中喜樹堿生物合成的調控作用，研究結果表明與對照組比較，茉莉酸甲酯處理組喜樹堿的含量提高了78.6%，并從茉莉酸甲酯處理過的喜樹幼苗中分離鑒定了15種新的生物堿成分；罌粟科植物罌粟的主要次生代謝產物為芐基異喹啉生物堿，與黃連主要成分相似，研究發現對人紅罌粟(PapaverbracteatumLindl.)施加100 μmol/L和500 μmol/L茉莉酸甲酯可以顯著提高罌粟植株中芐基異喹啉生物堿的含量[25]。Kato等[26]通過瞬時RNAi篩選技術，首次在日本黃連(Coptisjaponica)中發現了一個Ⅱc類群的WRKY轉錄因子，并命名為CjWRKY1，作為黃連小檗堿生物合成過程的轉錄激活因子，進一步研究發現CjWRKY1可通過在花菱草中的異源表達，調控花菱草芐基異喹啉生物堿的生物合成過程[27]，且CjWRKY1基因表現出顯著的茉莉酸甲酯響應性，可通過施加茉莉酸甲酯誘導CjWRKY1的表達，從而提高與CjWRKY1相互作用的合成途徑關鍵基因和酶的轉錄水平，進而增加芐基異喹啉生物堿的積累。Yamada等[28-29]通過瞬時RNAi篩選技術進一步從日本黃連中篩選出了一個調控黃連生物堿生物合成的堿性螺旋-環-螺旋(Basic Helix-loop-helix，bHLH)轉錄因子CjbHLH，隨后發現花菱草中CjbHLH同源蛋白EcbHLH1-1/1-2同樣參與其體內生物堿的生物合成過程，而CjbHLH和EcbHLH1-1/1-2的表達皆由茉莉酸甲酯誘導。

本研究使用茉莉酸甲酯處理黃連幼苗，研究茉莉酸甲酯對黃連多種生物堿積累的影響。結果表明，100 μmol/L的茉莉酸甲酯處理黃連幼苗，48 h后黃連幼苗中的藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿積累量與增長率最高，與對照組相比增長倍數分別可以為1.713倍、2.444倍、3.15倍、2.274、1.797倍。茉莉酸甲酯處理后黃連幼苗中黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的積累趨勢相似，都是24 h處理積累量增加，48 h后增長率最高，72 h、96 h處理后黃連幼苗中的黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿也是增加的，但其增長率卻呈下降趨勢，甚至于與對照組比較，96 h茉莉酸甲酯處理后黃連堿的含量沒有增長，推測提高處理時間，黃連堿的積累將會出現下降趨勢；茉莉酸甲酯處理后黃連幼苗中藥根堿于上述3種生物堿的積累趨勢相似，都是在48 h茉莉酸甲酯處理后增長率最高，72 h、96 h處理后含量雖然是增加的，但其增長率卻呈下降趨勢，不同點在于72 h、96 h茉莉酸甲酯處理后藥根堿的增長率高于24 h的增長率；莉酸甲酯處理后表小檗堿的積累模式與藥根堿一致，但在96 h處理后呈現出明顯的茉莉酸甲酯抑制作用?？偨Y實驗結果可以發現，長時間對黃連幼苗施加茉莉酸甲酯將會抑制黃連生物堿的積累，同樣的結果在其他植物的研究中也有發現，如胡正平等[30]用不同濃度的茉莉酸甲酯處理川續斷后，發現與對照組比較，100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L茉莉酸甲酯處理1～3 d能顯著提高川續斷中的主要成分川續斷皂苷Ⅵ的含量，而在處理的第5天，川續斷皂苷Ⅵ的含量低于對照組；金琳等[31]用不同濃度茉莉酸甲酯處理開花期的滇龍膽10 d后，發現與對照組比較，茉莉酸甲酯可顯著降低苦龍膽酯苷的含量；路星星等[32]用不同濃度茉莉酸甲酯處理鉤藤后，發現100 μmol/L茉莉酸甲酯處理3 d可顯著提高鉤藤中葉綠素含量，但在處理6～9 d后則表現出明顯的抑制作用。

綜上所述，通過短時間外源施加茉莉酸甲酯可以顯著促進黃連幼苗體內藥根堿、表小檗堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的積累，提高黃連中生物堿的含量，為深入研究黃連生物堿生物合成的分子調控機制提供基礎，也對黃連栽培種植和資源品質利用實踐具有指導意義。