川貝母不同規格鱗莖的生理指標和生物堿含量比較分析

王 業 馮 雪 高 旦 謝慧敏 付紹兵 李西文

(1 中國中醫科學院中藥研究所，北京，100700； 2 京都念慈菴總廠有限公司，香港，999077)

貝母藥材是貝母屬植物的復合群，該屬多種植物的干燥鱗莖均具有一定的藥用價值[1]，用于止咳化痰平喘，對治療呼吸系統疾病療效顯著[2-3]。2020版《中華人民共和國藥典》共計收錄川貝母、浙貝母、伊貝母、湖北貝母、平貝母5種貝母類藥材，來源于11種貝母屬植物。目前，共計約1 529種中成藥含有貝母屬植物，占止咳類產品的19.28%[3]。龐大的市場需求刺激貝母藥材的生產，然而，貝母類藥材供應主要依賴野生資源，但不足市場需求的10%，亟待通過人工栽培途徑緩解緊張的供需矛盾。

藥材等級規格是傳統評價藥材質量的主要參考指標之一，不同等級規格藥材化學成分含量差異顯著，相同用量療效差異明顯[4-5]。如薤白傳統用藥以個大為佳[6]；肉蓯蓉以個長、中部直徑大、每千克根數少為一等貨[7]；丹參規格等級劃分以個長、質重作為劃分標準[8]；川芎藥材等級以個大、質重為選貨一等[9]。貝母屬植物鱗莖直徑一般會隨著生長年限的增加不斷增大[10]。傳統貝母藥材推薦使用小而白的鱗莖，清代劉云在《本草述》中記載：“川貝母小而尖白者良……”[11]；化學成分含量的比較表明貝母總生物堿含量隨著生長年限的增加逐年降低[12]。趙倩等[10]對不同規格平貝母(Fritillariaussuriensis)化學成分進行分析比較，發現最小粒徑(直徑6.5 mm左右)鱗莖總生物堿和單體生物堿含量均最高，質量最佳。

川貝母(F.cirrhosa)為貝母屬(Fritillaria)植物，主要分布在西藏、云南、四川、青海等地[3,13-14]。目前川貝母已基本實現區域化人工栽培，用以緩解生境狹窄導致的野生資源短缺和市場供需矛盾[15]。盡管野生采挖的川貝母鱗莖難以準確鑒定生長年限，一般開花的植株都至少達到4年生。新鮮鱗莖的直徑大小和外觀形狀存在差異，尤其是不同產地間因群落類型和土壤狀況差異會導致川貝母鱗莖規格多樣性。然而，從野生到引種過程中，由于缺乏穩定的品系或栽培品種，人工種植的川貝母表型多樣性更加突出。目前針對鱗莖表型多樣的研究，已有部分報道。在栽培過程中川貝母的鱗莖質量受多種因素的影響，如融雪時間、土壤含水量、氣溫等[16-17]；遮陰也會影響川貝母葉片光合特性，進一步影響鱗莖產量和品質[18-19]。傳統性狀評價發現川貝母的總生物堿含量和鱗莖高度及其直徑負相關，即總生物堿含量隨著鱗莖增大而降低[20]。向麗等[21]通過對川貝母地上性狀和地下鱗莖的相關性分析，發現2～3年生鱗莖的大小和株高呈極顯著相關性[21]。因此，鱗莖直徑和形狀的變化可能直接影響川貝母地上表型的變化，如果為開花期鱗莖，則進一步影響川貝母果實的形成和發育。但是，鮮有文獻系統開展川貝母人工栽培過程中不同規格種莖對其產量和藥材品質影響的研究，有必要從源頭對不同表型的川貝母鱗莖生長發育進一步研究，以期為新品種的選育和生產不同功效用途的藥材奠定基礎，突破川貝母藥材產業化中優良“種子”瓶頸。

本文通過大田栽培比對試驗，整合川貝母植株的農藝性狀、光合特征和總生物堿含量測定，綜合評價鱗莖篩選對川貝母田間栽培的重要意義，以期為貝母屬其他重要藥用資源的高產優產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 試驗材料選用生長年限相同的川貝母“燈籠花”時期鱗莖，按照直徑大小分為3個規格：大粒鱗莖(直徑=46.74～30.10 mm)、中粒鱗莖(直徑=30.10～21.71 mm)和小粒鱗莖(直徑=21.71～12.70 mm)。在大粒鱗莖的篩選基礎上，按照外觀形狀分為：尖形鱗莖(高/直徑>1)和扁形鱗莖(高/直徑<1)。

1.1.2 試驗試劑 西貝母堿(純度>98%，北京金克隆生物技術有限公司，貨號：BP6122)，三氯甲烷(天津市大茂化學試劑廠，批號：20210104)，甲醇(天津市大茂化學試劑廠，批號：20210104)，氫氧化鈉粉末(天津市富宇精細化工有限公司，批號：20210625)，溴甲酚綠(北京金克隆生物技術有限公司，貨號：CS6218)，磷酸二氫鉀(北京金克隆生物技術有限公司，貨號：CS7728)，濃氨試液(天津市大茂化學試劑廠，批號：20210601)。

1.1.3 儀器 烘箱(上海一恒科學儀器有限公司，型號：DHG-9070)，多功能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司，型號：BO-1000S1)，水浴鍋(北京華港通科技有限公司，型號：HH-8)，萬分之一電子天平(常州市幸運電子設備有限公司，型號：FA1004E)，便攜式光合儀(LI-COR公司，美國，型號：LI-6800)，紫外-可見光分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司，型號：752)，純水機(杭州億捷科技有限公司，型號：UPTC-10)。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗 試驗基地位于青海省海東市互助土族自治縣林川鄉保家莊川貝母規范化種植基地(青海綠康生物開發有限公司，東經36°59′，北緯101°59′)，海拔3 050 m，屬大陸寒溫帶氣候，土壤類型為高山草甸土。大粒(D)、中粒(Z)、小粒(X)、尖形(J)、扁形(B)鱗莖各200粒，每組設立3組重復，分別于2020年10月1日播種，株距10 cm，行距10 cm，不同觀察組空出30 cm保護行和作業道，底肥使用農家肥，上覆麥秸。

1.2.2 農藝性狀測量 川貝母5月初開始出苗，從2021年5月1日開始，每隔15 d統計D、Z、X、J、B 5個分區的出苗數；盛花期在每個分區隨機挑選20株健康植株，分別測量株高(cm)、基部對生葉高(cm)、直徑(mm)、葉片數(枚)、葉長(mm)、葉寬(mm)、兩片葉夾角(度數)、花數(朵)；倒苗期每個分區隨機采收20株健康植株的成熟果實，并測量和統計果長(mm)、直徑(mm)、飽滿數(粒)、不飽滿數(粒)、果實重(g)、果殼重(g)等，同時計算果實飽滿種子率。

1.2.3 光合光響應曲線測定 分別選取不同分區種植的川貝母長勢一致的健康植株，以頂端幼嫩的葉片作為測量對象。選用LI-6800便攜式光合儀輔助6800-01F熒光葉室進行光合光響應曲線的測定，測量過程使用CO2小鋼瓶控制葉室中葉片周圍相對穩定的CO2濃度。環境設置項下開啟流速，設置流速500 μmol/s；開啟水分，并將濕度設置為55%，開啟CO2，并設置CO2濃度為400 μmol/mol；開啟混合風扇，設置風扇轉速為10 000 r/min。匹配選項設置為Always match，夾上葉片，待環境設置參數穩定后，選擇Auto Programs標簽和Light Response，設置光強梯度(Qin Values)為2 400、2 100、1 800、1 500、1 200、1 000、800、600、500、400、300、200、150、120、90、60、40、20、0 μmol/(m2·s)，進行光合光響應曲線的測量。

1.2.4 生物堿含量測定

1.2.4.1 供試品溶液的制備 倒苗期分別取D、Z、X、J、B 5個分區的植株，去除地上部分，取地下鱗莖用自來水清洗干凈，趁鮮切片，于烘箱60 ℃烘干至恒重。干燥鱗莖用研缽研磨成粉末，過三號篩。精密稱定過篩之后的粉末約2 g于具塞錐形瓶中，加濃氨試液3 mL浸潤1 h，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液40 mL水浴加熱(80 ℃)回流2 h，冷卻至室溫后濾過，用適量三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液洗滌藥渣3次，合并濾液置50 mL容量瓶中，用三氯甲烷-甲醇(4∶1)的混合液定容至刻度，混勻。精密量取5 mL提取液于25 mL具塞試管中，水浴蒸干后加10 mL三氯甲烷溶解，精密加水5 mL，繼續加0.05%溴甲酚綠緩沖液2 mL，劇烈振搖1 min，分液漏斗靜置30 min，用干燥濾紙濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

1.2.4.2 標準曲線的繪制 精密稱定西貝母堿適量，加三氯甲烷溶液溶解制成對照品儲備液。精密量取0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、1.0 mL對照品儲備液，分別置于25 mL具塞試管中，分別加三氯甲烷至10 mL，再分別精密加5 mL水和2 mL 0.05%溴甲酚綠緩沖液，劇烈振搖1 min，轉至分液漏斗靜置30 min，用干燥濾紙濾過，取續濾液。以相應的試劑為空白溶液，在415 nm波長處測定不同濃度對照品溶液的吸光度；以吸光度為縱坐標，對照品溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并計算線性回歸方程和相關系數。

1.2.4.3 西貝母堿含量測定 量取1 mL供試品溶液，按照1.2.4.2項下的方法，平行測定3次，取平均值。將測定的吸光度代入線性回歸方程，計算各樣品中總生物堿的含量。

1.2.4.4 方法學考察 精密度考察：精密量取西貝母堿對照品溶液，連續測定3次吸光度，計算相對標準差(Relative Standard Deviation，RSD)值，評價精密度。復性考察：取同一批樣品粉末6份，按照1.2.4.1的方法制備供試品溶液，按照1.2.4.2的方法制作的標準曲線，測定吸光度，計算RSD值，評價重復性。穩定性考察：隨機取供試品溶液1份，放置0、2、4、8、10、12 h，分別測定吸光度，計算RSD值，評價穩定性。

1.2.5 數據處理 使用Excel 2021進行數據記錄和整理；光合光反應曲線擬合使用Ye等[22]創建的在線軟件，使用直角雙曲線、非直角雙曲線和指數方程3種擬合方法，對Pn-光響應數據進行模擬；使用SPSS 21.0統計軟件進行單因素方差分析，Levene方差檢驗，方差齊性(P>0.05)使用Duncan法檢驗顯著性，否則用Dunnetts′s T3檢驗顯著性，顯著性水平為0.05；使用Origin 2021進行圖的繪制。

2 結果

2.1 不同規格鱗莖川貝母生理性狀比較 試驗篩選的大粒鱗莖平均直徑(35.26±3.28)mm，中粒鱗莖平均直徑(26.49±2.02)mm，小粒鱗莖平均直徑(19.85±2.81)mm；3種規格的鱗莖直徑差異有統計學意義(P<0.01)，中粒鱗莖和大粒鱗莖直徑分別是小粒鱗莖的1.5和2倍。尖鱗莖平均高/直徑比值大于1，扁鱗莖平均比值小于1。見圖1。

圖1 不同規格鱗莖川貝母比較

6月下旬川貝母進入盛花期，比較不同規格鱗莖地上性狀發現，3種規格鱗莖對應的性狀中，基部對生葉高和基部對生葉夾角比較差異無統計學意義；株高、莖基粗、葉片長度和開花數比較差異有統計學意義(P<0.05)，且這4個性狀均隨著鱗莖直徑的增大表現出顯著的數量優勢，其中鱗莖直徑越大，株高越高，莖基越粗，葉片越長，開花數越多；大粒鱗莖的葉片數顯著高于其他2種直徑的鱗莖(P<0.05)；小粒鱗莖的葉片寬度顯著低于其他2種直徑的鱗莖(P<0.05)。比較不同形狀鱗莖的地上性狀發現，扁鱗莖葉片數顯著多于尖鱗莖(P<0.05)；扁鱗莖地上葉片寬度極顯著大于尖鱗莖(P<0.01)，其他統計的地上性狀比較差異無統計學意義。見表1。

表1 不同規格鱗莖川貝母生理指標比較

由表1可知不同規格鱗莖開花數目差異有統計學意義，不同形狀鱗莖開花數比較差異無統計學意義，所以進一步對不同規格鱗莖單株開花數進行統計，發現大粒鱗莖單株開花2朵到5朵不等，開3朵花為優勢種群，占比47.37%；中粒鱗莖開花1～5朵不等，但中粒鱗莖中近20%開1朵花，開2朵花為優勢種群，占比50.60%；小粒鱗莖未見開4～5朵花的植株，單株開花數集中在1～3朵花，開1朵花的植株占比較高，達63.04%。見圖2。

圖2 不同直徑鱗莖川貝母單株開花數目比較

倒苗期采集不同植株干燥成熟果實，比較不同直徑及形狀鱗莖生長的果實質量。其中，不同直徑鱗莖比較的結果發現，果實長度和鱗莖直徑變化成正比，即果實長度隨鱗莖直徑膨脹變長。不同直徑鱗莖單顆果實飽滿種子的數目、單顆果實飽滿率及飽滿種子重量沒有顯著性差異。大粒鱗莖單顆果實重量、癟種子數目及果殼重均顯著高于其他2種直徑的鱗莖(P<0.05)。外觀性狀觀察也發現大粒鱗莖結出的果實果殼質地比較堅硬，其他直徑的鱗莖結果果殼則相對酥脆。不同形狀鱗莖的果實性狀參數之間比較差異無統計學意義。見表2。

表2 不同規格鱗莖川貝母果實性狀比較

從5月初開始統計D、Z、X、J、B不同分組不同時間的出苗數。比較不同直徑川貝母的出苗數，發現大粒鱗莖出苗相對較早，統計開始近20%已經出苗，其他鱗莖出苗相對較少，且大粒鱗莖齊苗速率相對較快。見圖3A。小粒鱗莖在出苗后期有部分植株由于疾病原因開始死亡。比較不同形狀鱗莖相同時間段出苗情況發現，與扁鱗莖比較，統計前期尖鱗莖的出苗速度相對較快，后期出苗速率則變緩。見圖3B。

圖3 不同直徑(A)和形狀(B)川貝母鱗莖出苗時間比較

由于莖腐病和根腐病等原因，后期2種形狀的鱗莖出苗數均存在一定程度的減少。田間觀察發現，扁鱗莖在齊苗期仍有部分植株出苗，但是出苗植株比較弱小，沒有開花趨勢。

2.2 不同規格鱗莖川貝母葉片光合光響應曲線比較 通過對不同規格鱗莖的川貝母葉片光合光響應數據進行模型擬合，發現不同類型的鱗莖地上部分擬合模型差異較大。比較不同直徑鱗莖擬合模型，根據擬合殘差(殘差越小，模型精確度越高)和決定系數大小(決定系數越大，模型擬合越貼近實際值)，大粒、中粒和小粒鱗莖最適擬合模型分別為非直角雙曲線、直角雙曲線和指數方程。不同形狀鱗莖最適擬合模型均為非直角雙曲線?；谧钸m擬合模型比較不同直徑鱗莖的相關參數，結果顯示，中粒鱗莖葉片的最大凈光合速率最高，大粒鱗莖葉片的暗呼吸速率最高，小粒鱗莖葉片的光補償點最高；不同形狀鱗莖的比較發現，扁鱗莖的凈光合速率、暗呼吸速率和光補償點均高于尖鱗莖相關參數。見表3。

2.3 不同規格鱗莖川貝母總生物堿含量比較 相同的西貝母堿對照品溶液，連續測定5次吸光度，RSD為2.66%，表明儀器精密度良好。連續測定5次供試品溶液的吸光度，RSD值為2.66%，表明試驗重復性良好。隨機取供試品溶液1份，放置0、2、4、8、10、12 h，分別測定吸光度，計算RSD值為2.73%，表明供試液在12 h內穩定性良好。由前述方法計算所得標準曲線方程為：Y=25.374X-0.005 9(R2=0.994 5)，線性范圍為0.000 6～0.011 1 mg/mL。

隨著鱗莖直徑的增大，總生物堿含量呈降低趨勢。其中，大粒鱗莖和小粒鱗莖的總生物堿含量差異有統計學意義(P<0.05)，小粒鱗莖含量顯著高于大粒鱗莖。2種不同形狀的鱗莖總生物堿含量差異不明顯。見圖4。

表3 不同規格鱗莖川貝母光合光響應曲線參數比較

圖4 不同規格鱗莖川貝母總生物堿含量比較

3 討論

貝母屬為多年生草本植物，鱗莖既是貝母屬植物的營養器官又是繁殖器官，既可以作為種源又可以加工成商品藥材，其直徑及形狀決定了植株的生長發育和商品規格。川貝母種植過程中，生產者經常會將4年生的鱗莖采挖，進行小密度種植，以利于結實[23]，獲得數量多、健康飽滿的貝母種子。本文通過比較不同直徑鱗莖地上性狀發現，大粒鱗莖對應的地上生物量特征表現出優勢，從生理學角度分析，這可能與其淀粉和多糖等營養物質含量較高有關[10]。大粒鱗莖平均單株的花和果實數量較多，適于作為種莖繁殖獲得種子投入生產。另外，種子圃在同樣株行距下，獲得等量的種子大粒鱗莖占用土地少，可節省土地流轉面積，減少生產成本。田間調查發現，大粒鱗莖果殼比較堅硬，在秋季成熟期果實開裂的比例較小，可減少因果殼裂口導致的種子損失。大粒鱗莖單粒種子較大，種子萌發過程中可供胚萌發的營養物質較多，更有利于實生苗成長。同等生長年限的小粒鱗莖植株瘦弱，開花較少和結實率較低，因生殖發育消耗營養多，產出種子少，但總生物堿含量較高，建議作為商品進行加工。

不同光合響應模型是擬合光合響應曲線的重要工具，用于估測最大凈光合速率、暗呼吸速率、光補償點等關鍵參數，可進一步評價種質、逆境脅迫、施肥、生長環境等因素對植物光合生理的影響[24-33]。對不同直徑大小鱗莖的比較發現，大、中粒鱗莖最大凈光合速率較小粒鱗莖高，表明這2種鱗莖的地上部分可能更適應較高的光強[25]；田間觀察發現，全光條件下大粒鱗莖地上部分葉片顏色較深，即使高溫條件葉片仍可以保持正常生長狀態，可考慮減少遮陰或不遮陰，大大降低生產成本；小粒鱗莖地上葉片顏色淺綠，葉片瘦弱，強光下抗逆性較低。暗呼吸速率隨著鱗莖規格的增大而降低，說明暗環境條件下鱗莖越大光合產物消耗越少[25]。說明使用大粒鱗莖作為種源不僅抗性更高，對于下一年鱗莖的增產也有較大的潛力。

鱗莖規格受多種因素影響。其大小一般隨著生長年限的升高而增大，過度采挖也會導致野生貝母鱗莖變小和土藏深度增加[34]。田間觀察發現，“燈籠花”時期貝母鱗莖會在一定程度返回到“樹兒子”或“一匹葉”的生長狀態，退化的鱗莖會隨之變小。已有文獻多為針對貝母干燥鱗莖大小和質量關系的評價，普遍認為個頭較小的松貝中總生物堿含量較高，質量最佳[10,12,20]。本研究也發現小粒鱗莖總生物堿含量顯著高于大粒鱗莖，該結論和前人研究基本一致。因此，人為控制貝母生長環境，避免鱗莖太過膨大，培育小規格的鱗莖可能是生產高品質栽培品的有效方法之一。

本文通過整合川貝母農藝性狀、光合特征、藥材品質3方面因素，比較尖形和扁形鱗莖生物特性。發現與扁鱗莖相比，尖鱗莖統計前期的出苗速率更快，這可能是由于尖鱗莖在倒苗期到第二年鱗莖萌發階段，打破休眠時間更早，具體原因有待進一步研究。田間觀察也發現，早春階段采挖2種不同形狀的鱗莖，尖鱗莖已經可見頂芽冒出，扁鱗莖則少見新生的頂芽。扁鱗莖在齊苗期萌發的植株矮小且不開花，推測可能是植株本身營養物質積累不夠，導致出苗時間較晚，加之當地在貝母生長后期溫度下降，不適宜植株開花結果。對不同形狀鱗莖的光合特征比較發現：扁鱗莖比尖鱗莖的最大凈光合速率高，可能更適應強光環境；尖鱗莖暗反應速率低于扁鱗莖，暗環境條件下光合產物消耗較少。

此外，在生物堿測定過程中，不同規格鱗莖種有膠質和粉質2種類型的斷面，前者斷面呈現橘黃色，質地堅硬，粉性差，研磨困難，過三號篩之后粉末為淺灰色；后者斷面呈現淀粉樣白色，質地酥脆，粉性強，容易研磨，過三號篩之后粉末為純白色。總生物堿含量測定結果發現膠質樣品生物堿含量相對較高。同科植物重樓(Parispolyphylla)根莖也存在膠質和粉質2種類型，未見該現象的詳細報道。

目前，種子繁殖仍然是貝母屬藥用植物擴繁的主要方式，種莖篩選對種子生產至關重要。本研究發現大粒鱗莖可作為川貝母種子生產的優良種源，小粒鱗莖可作為高品質藥材的重要來源。該結論是通過對青海川貝母種植基地的材料進行試驗發現的，這些植株在川貝母道地產區是否具有相同的生長及品質特性，還有待進一步研究。