防己黃芪湯抗慢性心力衰竭的作用及靶標分析

曹玲華 肖光旭 賀 爽 朱 彥

(1 天津中醫藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津，301617； 2 天津國際生物醫藥聯合研究院中藥新藥研發中心，天津，300457)

慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure，CHF)是多種不同疾病包括冠心病和高血壓等導致的臨床綜合征。在臨床上主要癥狀表現為心輸出量減少、組織器官灌注不足和靜脈系統淤血。

目前CHF的西藥治療多以“金三角”藥物為主，包括β受體阻滯劑、血管緊張素轉化酶抑制劑類藥物和醛固酮受體拮抗劑三者合并用藥，同時也會輔以利尿藥和強心藥等，多采用聯合用藥。這些藥物主要以神經內分泌抑制劑為主，短期內可以同步達到有效擴張血管、降低心臟前后負荷、增加心肌收縮力的重要作用，改善CHF的絕大部分臨床癥狀。但是也伴隨著多種不良反應的發生，并且西藥的作用靶點比較單一[1-2]，神經內分泌系統的激活在心室重構甚至CHF的進展中發揮關鍵作用。心室重塑是CHF進展的重要階段，主要表現為心肌肥大和疾病相關基因的轉錄和表達增加。本研究選用神經內分泌刺激劑來誘導CHF，目前的防治目標主要是緩解心室重塑的發展，并且降低患者的病死率和再入院率[3]。

中藥復方在防治CHF過程中具有多靶點、多通路和安全性高等特點。CHF在中醫中屬于“心悸”“心痹”和“心水”等。在中華文明幾千年臨床實踐中，中醫古籍記載了許多安全有效的經典方劑。防己黃芪湯(FJHQD)就出自張仲景《金匱要略》，由防己、黃芪、白術和甘草4味中藥組成，具有益氣活血、健脾利水的功效。中藥中所含的活性化合物在基礎研究中表明具有抗炎，抗氧化應激，免疫調節，增強心肌收縮力，減輕缺血再灌注損等功能[4-6]。同時臨床研究表明，防己黃芪湯對高血壓、射血分數保留型心力衰竭、穩定型心絞痛等具有顯著療效，并且能夠改善CHF及其導致的水腫等癥狀[7-8]。

去氧腎上腺素(Phenylephrine，PE)是一種兒茶酚胺腎上腺素能受體激動劑，作為一種重要的神經體液激素，眾多研究表明其刺激心肌細胞會導致心肌肥大，最終造成CHF[9-13]。因此在本實驗中使用PE誘導H9c2心肌細胞CHF模型作為研究對象。國內和國際的CHF治療指南中心房利鈉肽(Atrial Natriuretic Peptide，ANP)和腦利鈉鈉肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)已成為重要的生物標志物，目前臨床上血漿ANP和BNP肽水平已廣泛用于CHF患者的診斷和預后評估[14]。這2個最重要的生物標志物分別主要由心房和心室產生和分泌[15]。PE過度激活心肌細胞上的G蛋白偶聯受體引起肥大效應，因此在本實驗中通過測量不同組別中的細胞面積和檢測胞內ANP和BNP的水平來評估藥物對PE誘導的CHF的藥效。

近年來網絡藥理學的應用在中藥研究中取得了顯著進展[16-18]，網絡藥理研究采用系統生物學的方法，與傳統中醫理論中的“整體觀”相輔相成，在中藥藥效的機制通路預測中發揮著重要作用。因此，本研究運用藥效實驗與網絡藥理體系構建分析相結合的方法進行研究。見圖1。

圖1 本研究的工作流程注

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 防己黃芪湯由本課題組按原方劑量制備；去氧腎上腺素(北京索萊寶，批號：MB1602)；一抗α-actinin(1∶400，Proteintech武漢三鷹，批號：11313-2-AP)；熒光二抗Alexa Fluor 555(1∶1 000，美國Abcam，批號：GR3241278-3)；DMEM(Gibco，美國，批號：12800-017)；胰蛋白酶-EDTA(0.25%，Gibco，美國，批號：5200-072)；雙抗(Gibco，美國，批號：1514022)；H9c2心肌細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會上海細胞庫)；胎牛血清(北京賽澳美，批號：SA211.02)；TRIzol? Reagent提取液(Ambion，美國，批號：15596018)；逆轉錄試劑盒(Roche，瑞士，批號：04897030001)；BestarTMqPCR MasterMix(Bestar，德國，型號：DBI-2043)；高內涵篩選系統(PerkinElmer，美國，型號：Operetta)；NanoDrop微量分光光度計(Invitrogen，美國，型號：NanoDrop One2000)；PCR儀(Roche，瑞士，型號：LightCycler? 480)。

1.2 PE誘導的心肌肥大模型的建立 將生長狀態良好的H9c2心肌細胞放于溫度37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，細胞生長至一定的密度后，消化傳代并將心肌細胞進行計數后，按照1.5×105個/孔的密度將心肌細胞接種至6孔板或按5×103個/孔的密度將心肌細胞接種至96孔透明底黑板中，繼續放入培養箱中培養，6孔板中的細胞用于PCR實驗，96孔板中的細胞用于免疫熒光實驗。24 h后從培養箱中取出孔板，用不含血清的基礎培養基使細胞饑餓24 h，以達到同步化生長的狀態。24 h后給藥組提前1 h預給藥，加入0.05 mg/mL防己黃芪湯溶液，除正常對照組(CON)加入杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)外，其余各組均加入10 μmol/L的去氧腎上腺素，每組設置3個復孔，重新放回培養箱中培養24 h后，收集細胞。

1.3 實時熒光定量PCR檢測相關基因表達 細胞造模結束后，吸棄孔中培養基，向細胞中加入TRIzol(一種新型總RNA抽提試劑)等試劑提取心肌細胞總RNA，注意保證在冰袋上操作。然后使用反轉錄試劑盒將提取到的總RNA反轉錄成cDNA。最后在八連排中將cDNA與Master Mix和引物混合。隨后將其置于實時PCR系統中以檢測mRNA表達水平。本實驗所用的引物包括ANP和BNP均以GAPDH作為內參，將所得Ct值按照2-△△Ct的方法進行處理。引物序列由上海生工生物有限公司合成。本實驗所用具體序列信息見表1。

表1 引物序列

1.4 細胞免疫熒光法評價藥物對細胞面積的影響 心肌細胞造模結束后，吸棄孔中培養基，分別先后向孔內加入4%多聚甲醛固定細胞，0.2% TritonX-100打孔，并用5%血清封閉2 h后，加入α-輔肌動蛋白抗體過夜孵育，第2天用帶有熒光標記的二抗和Hoechst 33342的染料共同孵育一段時間后，上機用高內涵系統檢測每組的細胞平均面積(Cell Area)。本實驗共分為3組，包括對照組(CON)，模型組(PE)，防己黃芪湯給藥組(FJHQD)。實驗數據采用SPSS 22.0對數據進行統計學分析，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。用Graphpad Prism 7.0軟件對實驗數據作圖。

1.5 防己黃芪湯中活性成分及其作用靶點篩選 本研究使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，(http://tcmspw.com)對防己黃芪湯中所含防己、黃芪、白術、甘草4味中藥進行化學成分檢索以建立防己黃芪湯活性成分信息表[19]。每個成分的口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18時納入中藥活性成分[20]。并且以中藥名為關鍵詞在國家知識基礎設施數據庫(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)和Pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)數據庫篩選文獻報道的活性化合物加以補充。活性化合物的作用靶點篩選主要使用TCMSP并結合CNKI和Pubmed的文獻報道構建。并利用UniProt(https://www.uniprot.org)數據庫將靶點基因名稱校準并剔除沒有靶點的化合物[21]，從而得到防己黃芪湯的活性成分及其分別對應的靶點信息。

1.6 CHF相關靶點篩選 疾病相關靶點主要從PubMed數據庫、GeneCards(https://www.genecards.org/)和國際藥學文摘(International Pharmaceutical Abstracts，IPA)數據庫，以“慢性心力衰竭”為關鍵詞對靶點進行收集。在GeneCards數據庫中，Score值越高表明此靶點與此疾病相關性越高，因此本研究選擇Score值大于4倍Score值中位數的靶點作為CHF的潛在靶點，將所有數據庫中的靶點合并，去除重復值后整理出CHF的相關靶點。

1.7 網絡構建和分析 靶標網絡的構建遵循網絡藥理學評價指南的標準[22]，將防己、黃芪、白術和甘草4味中藥的靶點合并去除重復，得到防己黃芪湯的活性成分靶標集。并利用Cytoscape 3.7.2構建“中藥-活性成分-靶點”網絡。利用Venny將防己黃芪湯(FJHQD)的活性成分靶標集和CHF的靶點集取交集并繪制韋恩圖。將共有靶點導入STRING11.0數據庫(https://string-db.org)構建蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡，其中最小互相作用閾值設定為“Highest Confidence”(>0.95)，刪除沒有連接的靶點，其余均為默認設置，將結果導出并用Cytoscape對其網絡進行分析和可視化處理。將潛在作用靶點與所對應的化合物導入Cytoscape，繪制網絡圖，其中藍色菱形代表藥物活性成分，橙色橢圓形代表藥物作用的靶點。通過Cytoscape內置的Network Analyzer分析防己黃芪湯防治CHF各個活性成分和靶點的網絡拓撲學參數。

1.8 防己黃芪湯防治CHF的功能富集與作用通路的分析 為進一步闡明防己黃芪湯在防治CHF過程中所改善的生物功能以及所作用的信號通路，本研究分別采用DAVID數據庫(https://david-d.ncifcrf.gov/)進行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析，R語言的ClusterProfiler包進行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。利用DAVID 6.7平臺對防己黃芪湯防治CHF的潛在靶點進行GO分析，以P-value<0.05為標準篩選得到的GO分析結果。GO富集分析分為3類：生物過程(Biological Process，BP)、細胞組分(Cell Component，CC)和分子功能(Molecular Function，MF)。

在GO富集中將基因列表導入DAVID數據庫進行富集分析，篩選條件設定為P<0.05，并對得到的結果進行分析。將GO分析結果按P-value值進行排序，分別選取BP、CC和MF的前5繪制組合圖。使用R語言的ClusterProfiler包分析FJHQD防治CHF的作用通路并繪制氣泡圖。其中氣泡的大小與通路中受FJHQD調控的靶點數量成正比，顏色代表富集顯著性，即P值大小，顏色越紅表示在此通路富集越顯著。利用Bioconductor中的R包ClusterProfiler version 3.12.0，設置P<0.05進行KEGG富集分析[23]，并將富集排名前20的通路繪制氣泡圖。

1.9 防己黃芪湯防治CHF靶點-通路網絡圖的構建 將潛在作用靶點和篩選出的前10條作用通路導入Cytoscape構建潛在作用靶點-通路網絡。運用Cytoscape構建防己黃芪湯防治CHF靶點-通路網絡圖，并分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數，包括連接度(Degree)、介度中心性(Betweenness Centrality)、緊密度(Closeness Centrality)等，并根據網絡拓撲學參數預測發揮藥效的核心靶點及主要活性成分。其中紅色箭頭代表作用通路，橙色橢圓形代表潛在活性成分。形狀大小和透明度值與度值的大小成正比。

2 結果

2.1 防己黃芪湯對PE誘導的H9c2心肌細胞的保護作用藥效實驗 結果表明，與模型組(PE)比較FJHQD對心肌細胞在mRNA水平上ANP和BNP的表達有顯著降低作用。見圖2。同時結合免疫熒光(Immunofluorescence，IF)實驗，對心肌細胞α-輔肌動蛋白進行染色并計算細胞面積。見圖3。可以發現PE誘導后心肌細胞面積有顯著增大，并且FJHQD組細胞面積有明顯減小。見圖4。說明防己黃芪湯用于防治CHF在細胞水平上具有顯著藥效。

圖2 FJHQD對PE誘導心力衰竭模型標志物的影響

圖3 心肌細胞α-輔肌動蛋白染色(細胞免疫熒光法，×20)

圖4 FJHQD對PE誘導的心肌細胞面積的影響

2.2 成分靶標預測 通過整合防己黃芪湯所含活性化合物及靶點信息共得到111個活性成分和419個靶點，同法CHF共得到636個相關靶點。共得到FJHQD防治CHF166個。見圖5。潛在作用靶點共得到275個節點和1 639條邊。見圖6。Cytoscape網絡分析表明，槲皮素連接度(Degree)最高為138，介度中心性(Betweenness Centrality)為0.209 3，緊密度(Closeness Centrality)為0.466，預測槲皮素為防己黃芪湯調治CHF的主要成分；其次為芒柄花黃素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷。排名前10的活性化合物見表2。PTGS2在網絡中度值最大，預測PTGS2為最關鍵靶點。ESR1、AR、NOS2、CALM1、GSK3B、CDK2、ADRB2、ESR2、MAPK14、BCL2亦為相對重要的靶點。排名前20的核心靶蛋白見表3。

圖5 FJHQD和CHF作用靶標的韋恩圖

2.3 PPI網絡與核心靶點 PPI網絡中共有122個靶蛋白、417種PPI。節點大小與蛋白質節點的度值大小成正比，節點的顏色由藍色變橙色也代表此節點度值由小變大。邊的粗細與蛋白質-蛋白質間結合分數成正比，且邊的顏色由藍色變橙色也代表蛋白質之間相互作用的結合分數由小變大。對網絡進一步分析發現，度>均值(6.83)且緊密度(Closeness Centrality)>均值(0.383 053 275)的關鍵靶蛋白有39個，靶蛋白STAT3、JUN、TP53、AKT1、MAPK1、TNF、VEGFA的度和緊密度均較大，說明在整個互作網絡中作用較大，可視為防己黃芪湯防治CHF的核心靶點。見圖7。

圖6 化合物-疾病潛在作用靶點網絡

表2 排名前10的活性化合物

圖7 潛在作用靶標的PPI網絡

2.4 防己黃芪湯防治CHF的生物功能與通路分析 BP相關的條目最多有493條，主要涉及藥物反應、基因表達的正向調控、缺氧應答、凋亡過程的負調控、炎癥應答、細胞間信號轉導和血管新生等方面。CC相關的條目56條，主要涉及細胞間隙、細胞表面、細胞質膜和細胞核等方面。MF相關的條目98條，主要涉及蛋白結合、轉錄因子結合、細胞因子活性、腎上腺素結合和一氧化氮合酶活性等方面。分析結果揭示FJHQD防治CHF的主要作用通路為AGE-RAGE Signaling Pathway、HIF-1 Signaling Pathway和PI3K-AKT Signaling Pathway等相關通路。見8～9。

表3 排名前20的核心作用靶點

圖8 GO功能富集分析結果

圖9 KEGG估計分析氣泡圖

2.5 活性成分-靶點-作用通路網絡圖的構建 活性成分-靶點-作用通路網絡圖直觀地體現了防己黃芪湯多靶點、多通路防治CHF的作用機制，同時也符合中藥復方發揮療效的特點。見圖10。

圖10 靶點-前10個通路網絡

3 討論

CHF是目前最為常見的心血管疾病，中藥復方在防治CHF等慢性復雜性疾病方面具有一定優勢，在臨床上已有大量應用。越來越多的臨床研究表明，益氣活血利水方能明顯改善氣虛血瘀水飲證心力衰竭患者的臨床癥狀[24-26]，與西藥常規治療相比效果顯著。同時在《慢性心力衰竭中西醫結合診療專家共識》中針對CHF的脾虛水腫患者，已推薦使用防己黃芪湯加減方對癥治療[27]。

本研究首先通過藥效實驗研究的方法從細胞水平上闡明了防己黃芪湯在防治CHF中的顯著療效，為中醫藥經典名方的開發提供了堅實的藥效基礎。接下來基于公共數據庫，通過分別構建防己黃芪湯和CHF的靶點網絡，為今后進一步的機制研究提供理論依據。篩選出的潛在活性成分主要為槲皮素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷、山柰酚、粉防己堿、異甘草素、白術內酯Ⅰ、甘草素等，這些成分均為湯劑所含中藥研究較多且具有代表性的成分。針對各個單體查閱文獻發現，這些單體在基礎研究中防治心血管疾病方面均已有報道。粉防己堿是防己中具有重要代表性的生物堿類成分，屬于鈣離子拮抗劑，能夠顯著降低細胞內鈣離子含量，在保護心肌細胞，改善心室功能，降低血壓等方面具有良好的藥效[28-29]。黃芪甲苷屬于黃芪中具有代表性的皂苷類成分，在治療心血管疾病方面已有大量文獻報道，可促進脂肪酸氧化，改善線粒體功能，抑制心力衰竭的發展[30]。毛蕊異黃酮是黃芪中具有代表性的黃酮類成分，可以通過激活ERα/β并增強心肌細胞中的蛋白激酶B磷酸化而發揮抗凋亡作用，從而保護心肌細胞[31]。槲皮素在黃芪和甘草中均含有，在降血壓、降血脂和增加冠脈血流量等方面具有顯著藥效[32]。因此推測粉防己堿、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮等是防己黃芪湯發揮藥效的主要活性成分，并可通過發揮抗炎、降血壓、抗氧化應激和保護心血管的作用來防治CHF。

此外從化合物-疾病靶點通路可以發現，防己黃芪湯防治CHF的靶點主要集中在前列腺素內過氧化物合酶2(Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2，PTGS2)、一氧化氮合酶2(Nitric Oxide Synthase 2，NOS2)、鈣調素1(Calmodulin 1，CALM1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma，PPARG)、雄激素受體(Androgen Receptor，AR)、糖原合酶激酶3β(Glycogen Synthase Kinase 3 Beta，GSK3B)、腎上腺素受體Beta 2(Adrenoceptor Beta 2，ADRB2)，其中PTGS2屬于前列腺素合成中的關鍵酶，在抗炎和抑制細胞凋亡方面有顯著作用，從而進一步保護心肌細胞。AR和ADRB2均屬于GPCR，下游與CALM1相關聯，直接參與心肌收縮和血壓相關的調節。CALM1通過和鈣結合介導下游對大量酶、離子通道、水通道蛋白的調節，在心血管疾病治療方面發揮重要作用[33]。

由PPI網絡可以發現信號轉導及轉錄激活因子3在網絡中處于核心位置，可以與較多的蛋白質發生相互作用。信號轉導及轉錄激活因子3在心血管疾病方面已有很多研究，眾多研究表明其對線粒體具有直接保護作用，可以參與體內的自噬和炎癥反應，并且信號轉導及轉錄激活因子3在小鼠心臟中的表達與心肌肥大相關，今后也可以作為研究重點關注的指標[34]。KEGG通路富集分析結果表明，防己黃芪湯防治CHF的靶點的主要作用通路為AGE-RAGE信號通路、缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase-protein Kinase B Pathway，PI3K/AKT)信號通路、和炎性腸病。糖化應激主要通過糖化終產物(Advanced Glycation End Products,AGEs)與晚期糖基化終末產物受體(Receptor for Advanced Glycation End Products,RAGE)的結合作用激發炎癥反應和氧化應激，在心臟成纖維細胞中會發生成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，進而導致心肌纖維化或細胞外基質沉積等，在CHF的發生發展進程中起著關鍵作用[35]。HIF-1屬于缺氧誘導因子，在缺血缺氧心肌中抑制脂肪酸的分解代謝，可以調節葡萄糖代謝、細胞增殖和血管形成的蛋白質表達并且還可以靶向線粒體抵抗氧化應激[36-37]。此外，缺乏HIF-1會導致血管生成障礙和心肌纖維化，從而導致CHF[38]。PI3K屬于胞內的磷脂酰肌醇激酶，AKT位于PI3K的下游，AKT磷酸化后通過影響下游效應因子的活化狀態調控細胞凋亡，從而改善心臟收縮舒張等功能[39-41]。因此，推測防己黃芪湯可能通過調節體內細胞凋亡、炎癥和脂肪酸代謝等相關通路來改善心室重塑，增強心肌收縮力，調節心肌氧化代謝從而達到防治CHF的效果。

本研究不同于以往的網絡藥理研究思路[42]，而是在藥效實驗結果的基礎上再進行靶標網絡的構建，以期預測通路機制更具有說服力。靶標網絡圖利用大數據形象直觀地展示了防己黃芪湯通過多成分多靶點多通路發揮抗CHF的潛力，與西藥單一成分發揮療效相比具有不可替代的優勢。一方面藥效實驗與網絡預測相結合相輔相成，有理有據。另一方面為防己黃芪湯開發用于CHF的治療提供了科學依據，也為發掘傳統經方提供了新的方向。但美中不足的是，網絡藥理學是基于現有研究結果的大數據分析，具有以下局限性。一是在機制通路研究的創新性上具有局限性，基于現有研究結果很難發現新的作用靶標通路；二是中藥復方活性成分可能并不僅僅是單味中藥所含各個化合物的簡單組合，在煎煮前后或者入血前后均會發生變化。但是靶標網絡的構建在研究初期可以為我們的研究提供更多思路，從整體觀的角度看待中藥復方。后續我們也將在此基礎上從動物水平，并結合組學和分子生物學等技術，進一步明確防己黃芪湯在防治CHF方面的靶點和通路。