嶺南草藥九節總黃酮提取和富集工藝研究

尹 麗 盧成淑 王華坤 李國利 許婷婷

(1 玉林師范學院，玉林，537000； 2 玉林師范學院地產藥用資源開發與生物工程技術中心，玉林，537000)

九節(PsychotriaasiaticaL.)為九節屬(PsychotriaL.)傳統藥用植物，又名大丹葉、山大顏、山大刀等，枝、根、葉藥用[1]。據《中國植物志》記載九節屬植物全球有1 500種左右，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區。我國九節屬植物有17種，其中4種具有藥用價值。九節具有清熱解毒、舒筋活絡、活血止痛、消腫拔毒、祛風除濕之效，臨床常用于治療感冒發熱、咽喉腫痛、白喉、痢疾、腸傷寒、瘡瘍腫毒、風濕痹痛、跌打損傷、毒蛇咬傷等癥[2-6]，是國家非物質文化遺產——廣東涼茶常用中藥之一，同時也是廣西臨床常用的中草藥，主產于廣西玉林市[7]，具有獨特的地域優勢和開發前景。現代研究表明，九節主要化學成分為黃酮類、環烯醚萜類和三萜類等，具有抗菌和抗病毒活性、抗腫瘤作用，中樞神經系統的致幻、鎮靜、鎮痛等，表現出誘人的藥用前景[8]。本課題組在前期預實驗中發現九節的黃酮提取組分對急性痛風性關節炎具有良好的療效，可有效改善SD大鼠的足趾腫脹度和血清尿酸水平。

在廣西，九節有著悠久的民間藥用基礎和廣闊的種植面積，而目前針對其化學物質基礎方面的研究較少，對九節的開發利用相對滯后，有關其提取富集工藝尚未見相關報道。本研究以嶺南特色藥材九節為研究對象，采用響應面法優化總黃酮提取工藝，并進一步通過大孔樹脂富集這一組分，為后續九節資源的合理利用和新產品的開發奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 數顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司，型號：HH-S4)；旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-52AA)；循環水式多用真空泵(上海豫康科教儀器設備有限公司，型號：SHB-Ⅲ)；蜀牛抽濾瓶[四川蜀玻(集團)有限責任公司，型號：GG-17]；紫外分光光度計[島津企業管理(中國)有限公司，型號：UV-2600]。

1.2 試藥 蘆丁標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201811)；8種大孔吸附樹脂(天津市光復精細化工研究所，型號：D101、AB8、DM301、DA201、H103、HPD100、HP20、H1020)；亞硝酸鈉(南京試劑公司，編號：C0131520223)；硝酸鋁(南京試劑公司，編號：C0150520223)；氫氧化鈉(南京試劑公司，編號：C0131510225)，水為去離子水。藥材于2019年7月采集于廣西玉林，經玉林師范學院盧海嘯教授鑒定為茜草科植物九節(PsychotriaasiaticaL.)地上部分。

2 實驗方法

2.1 總黃酮標準曲線 精密稱量蘆丁標準品2 mg，用70%乙醇溶液溶解定容至20 mL，得到質量濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液。分別精準吸取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL蘆丁標準溶液置于10 mL容量瓶中，在各瓶中分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，適度振蕩搖勻后放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，振蕩搖勻后放置6 min，最后加入1.0 mol/L的氫氧化鈉4.0 mL，用70%乙醇溶液定容至10 mL，振蕩搖勻，放置15 min，待顯色穩定后，以第1管(即蘆丁加入量為0的樣品)作為空白組，放于紫外可見分光光度儀中，設置波長為510 nm，測定吸光度。以蘆丁標準溶液濃度X(mg/mL)為橫坐標，吸光度Y為縱坐標，繪制得到標準曲線，擬合得到線性回歸方程[9]。線性回歸方程為Y=11.98X-0.001 2，R2=0.999 9，結果表明蘆丁標準品溶液在此范圍內線性關系良好。

2.2 提取工藝優化

2.2.1 浸膏得率及提取率測定 九節浸膏得率=M1/M2×100%；總黃酮得率=CV/1 000M2×100%；C為提取液中總黃酮濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；M1為浸膏質量，g；M2為九節樣品的質量，g。

2.2.2 供試品溶液的配制 取干燥九節地上部分粉碎后精確稱取粗粉(過四號篩)10 g置于圓底燒瓶內，根據前期預實驗結果，在設定的條件下(乙醇濃度、提取溫度、料液比和提取時間)回流提取2次，過濾，合并2次濾液，濾液濃縮至浸膏狀。參考相關文獻[10]的實驗方法，精確稱取九節浸膏5 mg，用70%乙醇定容至10 mL，得到0.5 mg/mL的總黃酮待測液。取總黃酮待測液1 mL按照2.1中方法自“在瓶中加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL”開始操作，每個處理重復3次。

2.2.3 單因素實驗 以總黃酮得率為指標，對乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間4個因素進行考察，為后面響應面法優化工藝確定各參數范圍。根據前期預實驗結果，精密稱取粉碎后的藥渣10 g于100 mL圓底燒瓶中，在固定其余參數情況下，考察乙醇濃度：50%、60%、70%、80%、90%；提取溫度：50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃；料液比(質量比體積)：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；提取時間：40 min、60 min、80 min、100 min和120 min時九節中總黃酮得率(n=3)。考察不同乙醇濃度對九節總黃酮提取率的影響時，精密稱取粉碎后的藥渣10 g于100 mL圓底燒瓶中，固定加熱回流提取溫度為60 ℃，料液比為1∶10，提取時間為60 min[11]；考察不同提取溫度的影響時，精密稱取粉碎后的藥渣10 g于100 mL圓底燒瓶中，以80%乙醇為提取溶劑，固定料液比為1∶10，提取時間為60 min；考察不同料液比對的影響時，精密稱取粉碎后的藥渣10 g于100 mL圓底燒瓶中，以80%乙醇為提取溶劑，固定提取時間為60 min，提取溫度為60 ℃；考察不同提取時間的影響時，精密稱取粉碎后的藥渣10 g于100 mL圓底燒瓶中，以80%乙醇為提取溶劑，固定料液比為1∶10，提取溫度為60 ℃[12]。

2.2.4 響應面優化試驗 以單因素實驗設計得到的結果為中心點，運用Design Expert8.0.6軟件針對主要因素(乙醇濃度、提取溫度、液料比、提取時間)使用中值組合重新編碼，以總黃酮提取率為響應值，采用Box-Benhnken中心組合實驗設計原理，設計4因素3水平的響應面實驗。見表1。

表1 響應面因素與水平

2.3 大孔樹脂富集

2.3.1 樹脂篩選 精密稱取1.0 g粗提物總黃酮浸膏至燒杯中，加入少量體積分數為70%的乙醇溶液，充分攪拌溶解后定容至300 mL。加入等體積無水乙醇，渦旋混勻，10 000 r/min，離心半徑10 cm，離心30 min，取上清液旋至無醇味，加水溶解并通過0.45 μm濾膜過濾，即為上樣液。參照文獻[13]的實驗方法對大孔吸附樹脂進行預處理。分別稱取按說明書預處理后的8種大孔樹脂各3 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL上樣液，于恒溫搖床(25 ℃，180 r/min)振蕩吸附24 h，使其至吸附平衡，過濾后吸取一定體積的濾液，依法測定吸附后溶液九節總黃酮的含量。將上述吸附平衡后的8種大孔吸附樹脂用少量的純化水洗去表面的雜質與溶液，抽濾至干，分別置于250 mL的具塞錐形瓶中，各加入100 mL無水乙醇，于恒溫搖床(25 ℃，180 r/min)振蕩解析24 h，使其至解吸附平衡，過濾后吸取一定體積的濾液依法測定解吸附后溶液的九節總黃酮含量。最后按照下列公式計算：靜態飽和吸附量=(C0-C1)V1/M(mg/g)；吸附率=(C0-C1)/C0×100%；解吸率=(C2V2)/(C0V1-C1V1)×100%；回收率=C2V2/C0V1×100%。C0為吸附前樣品溶液中總黃酮的初始濃度，mg/mL；C1為吸附平衡后溶液中總黃酮濃度，mg/mL；C2為解吸平衡后解析液中總黃酮濃度，mg/mL；V1為吸附液體積，mL；V2為解析液體積，mL；M為樣品質量，g。

2.3.2 最佳提取工藝條件的驗證試驗 通過響應面優化實驗，回歸模型預測的定向生成總黃酮最高提取率條件：58.94 ℃的提取溫度，75%的乙醇濃度和10.42∶1的料液比，48.3 min/次，提取2次，在此條件下九節總黃酮的提取率為2.37%。考慮到實際操作的可行性，對參數進行修正：提取溫度59 ℃、乙醇濃度75%、料液比1∶10、提取時間48 min，在該參數下進行3組平行實驗驗證。

2.3.3 最佳洗脫劑體積分數摸索 取預處理好的大孔樹脂10 g，分別濕法裝柱(2 cm×30 cm)進行吸附，收集過柱液，吸附后蒸餾水洗至無色，再分別用不同體積分數的乙醇溶液洗脫(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%)，流速為3.0 mL/min，洗脫體積為6個柱床體積(BV)，收集洗脫液，測定其總黃酮含量，計算解吸率，篩選最佳洗脫劑體積分數。

2.3.4 總黃酮的富集 稱取預處理好的大孔樹脂10、20和50 g，濕法裝柱，上樣吸附至飽和，蒸餾水洗至無色，再按上述最佳洗脫條件進行洗脫，收集洗脫液測定總黃酮含量，并計算純度和回收率，驗證工藝效果和穩定性。純度=C2V2/M×100%；回收率=(C2V2-C1V1)/C1V1×100%。C1為富集前黃酮質量濃度，mg/mL；V1為富集前溶液體積，mL；C2為富集后總黃酮質量濃度，mg/mL；V2為富集后定容體積，mL；M為富集后樣品質量，g。富集工藝放大實驗選取HP-20大孔樹脂，濕法裝柱，蒸餾水洗至無色，再以60%乙醇溶液洗脫，流速3.0 mL/min，洗脫體積6 BV。

3 結果

3.1 四因素考察結果

3.1.1 不同乙醇濃度對九節總黃酮提取率的影響 當乙醇濃度為80%時，九節總黃酮的提取率達到最大。乙醇濃度從50%增加到70%時，總黃酮提取率的變化不大，當乙醇濃度從70%增大到80%的時候，九節總黃酮提取率迅速上升，之后增大乙醇濃度，總黃酮提取率逐漸減小。可以確定乙醇濃度為80%時提取率最高。本研究在響應曲面提取乙醇濃度的3個水平選擇70%、80%、90%。見圖1。

圖1 不同乙醇濃度對總黃酮提取率的影響(%)

3.1.2 不同提取溫度對九節總黃酮提取率的影響 隨著提取溫度的升高，九節總黃酮的提取率也逐漸上升，在提取溫度為60 ℃時，總黃酮提取率達到最高，之后再提高溫度，總黃酮提取率反而逐漸下降。提取溫度為60 ℃時提取率最高，本研究在響應曲面提取溫度的3個水平選擇50 ℃、60 ℃、70 ℃。見圖2。

圖2 不同提取溫度對總黃酮提取率的影響

3.1.3 不同料液比對九節總黃酮提取率的影響 當料液比從1∶5增加到1∶10時，料液比與總黃酮提取率正相關；當料液比到1∶10的時候，總黃酮提取率達最大值，之后提取率隨著料液比的增大而減小；當料液比增加至1∶15之后總黃酮提取率又有所上升，并在料液比為1∶20時達第2個頂點，隨后增大料液比，總黃酮提取率逐漸減小。料液比1∶10時提取率最高，本研究在響應曲面料液比的3個水平選擇1∶5、1∶10、1∶15。見圖3。

圖3 不同料液比對總黃酮提取率的影響

3.1.4 不同提取時間對九節總黃酮提取率的影響 隨著加熱回流提取的時間增加，九節中總黃酮的提取率逐漸上升，在60 min后，繼續回流提取，總黃酮提取率逐漸下降。在80 min后總黃酮提取率又有所上升，并在100 min時達到第2個頂點，之后繼續加熱回流提取，總黃酮提取率逐漸下降。提取時間為60 min時提取率最高，本研究在響應曲面提取時間的3個水平選擇40 min、60 min、80 min。見圖4。

圖4 不同提取時間對總黃酮提取率的影響

3.2 九節總黃酮提取工藝優化

3.2.1 響應面實驗結果 共計29組實驗點，響應面試驗設計和結果見表2。

表2 總黃酮提取響應面實驗設計結果

對表2中數據進行回歸分析，擬合得到的二次多項回歸方程為：Y=2.30+0.034A-0.068B-0.024C-0.087D-0.018AB+0.032AC+0.18AD+7.500E-003BC+0.11BD-0.097CD-9.500E-003A2-0.33B2-0.11C2-0.19D2。

回歸模型的顯著水平為極其顯著(P<0.000 1)；失擬項P=0.260 1，差異無統計學意義(P>0.05)。乙醇濃度、提取溫度、液料比、提取時間對九節總黃酮提取率的影響顯著性由大到小為：提取時間(D)>提取溫度(B)>乙醇(濃度(A)>料液比(C)。見表3。

表3 響應面實驗結果方差分析

通過表3中的分析可以知道，乙醇濃度(A)和提取時間(D)交互作用對九節總黃酮提取率影響達到極顯著水平，提取溫度(B)和提取時間(D)交互作用對九節總黃酮提取率影響達非常顯著水平，料液比(C)和提取時間(D)交互作用對九節總黃酮提取率影響達到顯著水平，而AB、AC及BC交互作用對九節總黃酮提取率的影響差異無統計學意義(均P>0.05)。在本實驗中，CV值是3.64%，表明本回歸模型置信度較高，回歸模型的方程能很好地反映出真實實驗的值，可以用該回歸模型分析響應值的變化趨勢。本回歸模型的相關系數R2=0.942 8，校正決定系數RAdj2=0.885 6，兩系數比較相近，表明模型的真實值與預測值能很好地擬合；本回歸模型的擬合情況比較好，回歸方程有很好的代表性，能準確地預測真實的情況，表明運用響應面優化法得到的提取條件對九節總黃酮進行提取是可行的。

3.2.2 響應面直觀分析 隨著乙醇濃度、提取時間和料液比的增大或延長，九節總黃酮的提取量也隨之增大，但當乙醇濃度、提取時間和料液比增大或延長到一定程度后，黃酮提取量有下降的趨勢。乙醇濃度和提取時間的交互作用對模型影響顯著，提取溫度和提取時間的交互作用對模型影響顯著，從等高線圖中可見其橢圓程度和疏密程度，與模型回歸中的方差分析一致。見圖5。

圖5 兩因素交互影響總黃酮提取率的等高線

響應面的開口朝向下，隨著每個實驗因素的不斷增大，響應值也逐漸增大，當響應值達到最大值即該模型的穩定點后，隨著實驗因素的增大，響應值反而逐漸減小。響應曲面的坡度越陡峭，表示響應值對實驗因素的改變越敏感；反之，曲面越平緩，則表示響應值對實驗因素的改變越遲鈍。本實驗中兩實驗因素交互作用下，九節總黃酮提取率對其的敏感度為ad>bd>cd。見圖6I、6K、6L。對ab、ac和bc的交互作用反應較遲鈍。見圖6G、6H、6J。該結果與表3分析結果一致。

圖6 兩因素交互影響總黃酮提取率的響應面

3.3 最佳提取工藝條件的驗證試驗 得到總黃酮提取率的平均值2.36%，與理論值2.37%相差不大建立的模型預測性良好，優選的工藝穩定可行，具有一定的應用價值。見表4。

表4 驗證實驗結果

3.4 大孔吸附樹脂的篩選 對8種樹脂進行靜態吸附和解吸試驗。在吸附率上，HP-20、AB-8和D101排名前3，其中HP-20型樹脂的吸附率最高，對總黃酮表現很好的吸附效果；而在洗脫過程中，上述3種樹脂對總黃酮均表現出很好的解吸附效果。回收率方面，D101和HP-20型樹脂的回收率較高，分別為85.58%和85.16%，綜合考慮選用HP-20大孔樹脂富集純化九節中的總黃酮。見表5。

表5 8種大孔吸附樹脂靜態吸附、解吸、回收率

3.5 大孔樹脂富集結果

3.5.1 洗脫劑濃度 隨著洗脫液濃度的逐漸上升，解吸率顯著提高，當乙醇體積分數達到60%時，解吸率達到最高，繼續增加乙醇體積分數，解吸率趨于平衡。由于九節總黃酮中的糖苷鍵類化合物和部分多酚類物質在溶液中極性較低，容易被乙醇洗脫出來，故洗脫液濃度過低致使洗脫不完全，而洗脫液濃度過高可能將一些雜質合并洗脫出來。實驗過程中選擇洗脫液的最佳體積分數為60%。見圖7。

圖7 洗脫劑濃度對解吸率的影響(%)

3.5.2 富集工藝放大驗證 結果表明，經過不同樹脂量的大孔樹脂柱富集后，總黃酮純度達到10.64%，相對于提取液(總黃酮純度1.87%)提高了約6倍，回收率達到了87.70%，HP-20富集結果穩定可行。見表6。

表6 富集工藝實驗結果

4 討論

目前少有文獻報道九節總黃酮的提取和富集工藝，李洪福等[14]以正交實驗法優化海南九節(P.haninanensis)中總黃酮提取率為0.65%，但僅考察了提取工藝，且正交實驗法未能從整個區域中計算出單因素和指標間確定的函數表達式，并探討單因素之間的交互作用。本實驗首次采用響應面法對九節的總黃酮提取工藝進行研究，在單因素實驗中最初隨著乙醇濃度增加，九節總黃酮提取率迅速上升，濃度繼續增大總黃酮提取率反而逐漸減小。其主要原因可能為隨著乙醇濃度和極性的改變，提取液中的一些如葉綠素等脂溶性的物質溶出，隨著乙醇濃度的增大而不斷增加，從而影響了總黃酮的溶出[15]。不同提取溫度對總黃酮提取率的影響與之類似，60 ℃時提取率達到最高，之后再提高溫度總黃酮提取率反而逐漸下降。出現該種情況的原因可能是開始時溫度升高，總黃酮溶出增加導致提取率上升，但上升到一定溫度之后，黃酮化合物的性質發生了改變，過高的溫度也可能使溶劑加速揮發，從而影響九節總黃酮的提取率。同理，增大料液比總黃酮提取率逐漸減小。呈現出這種趨勢的原因可能是在一定的料液比范圍內，九節中黃酮類物質的溶出隨著料液比的增大而增大，當料液比到達一定比例的時候，九節中黃酮類化合物已經基本完全溶出，故提取率有所下降，之后再提高料液比，不會促進黃酮類化合物的溶出，反而會增加雜質的溶出，從而使實驗結果受影響而呈現出該趨勢[16]。在提取時間對九節總黃酮提取率影響實驗中出現同樣的趨勢，持續加熱回流提取，總黃酮提取率逐漸下降。主要原因可能為隨著提取時間增加，九節總黃酮化合物溶出增加，提取率上升，到達一定時間后，黃酮化合物的溶出趨于穩定，之后繼續回流提取，其他溶于乙醇的雜質增加，對總黃酮提取率產生影響。在單因素試驗基礎上，對九節總黃酮提取工藝進行了優化，確定最佳提取工藝條件為：提取溫度59 ℃，乙醇濃度75%，料液比1∶10，提取時間48 min，提取2次，在此條件下總黃酮得率為2.36%，結果優于上述文獻。

由于大多數黃酮類的化合物分子極性不太大，根據“相似相吸引”原則，在非極性與弱極性樹脂上有較好的吸附效果。本實驗參照文獻[17-19]比較8種不同型號大孔樹脂對九節總黃酮的吸附量、靜態吸附、解析性能和回收率等指標，確定HP-20大孔樹脂作為富集樹脂，在洗脫劑為60%乙醇、洗脫流速為3 mL/min、洗脫劑用量6 BV的條件下，富集后總黃酮回收率達到87.70%，純度相比浸膏提升6倍。該工藝對九節中最具價值的黃酮類有效組分的提取富集，操作簡單且穩定性好，有助于保持九節黃酮類物質的生物活性，避免過高的經濟與環境成本，適用于產業化生產，對于九節這一地方特色藥材資源的資源利用提供了有效途徑。