尤瑞克林對急性腦梗死大鼠保護作用及機制研究

馬 寧， 楊永利， 張雙鶴， 丁 亮， 閆思蒙

1.北部戰區總醫院 干一科，遼寧 沈陽110016；2.沈陽醫學院，遼寧 沈陽110000

腦卒中是一種突然起病的腦血液循環障礙性疾病，病死率和致殘率極高。 其中，急性缺血性腦卒中較為常見，約占腦卒中總數的80%[1]，其發生與高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、吸煙、肥胖和血脂異常等有關[2-3]。 急性缺血性腦卒中的治療主要包括超急性期的恢復灌注治療、抗血小板和卒中單元治療，尚缺少其他有循證醫學證據支持的治療手段[4]。 急性缺血性腦卒中的神經保護治療一直是國際研究的熱點。 然而，動物研究中證實有效的神經保護藥物尚未成功轉化到臨床應用中。 尤瑞克林(Ureklin，HUK)是國家Ⅰ類新藥，廣泛應用于急性腦梗死的治療。 HUK 可以增加缺血后內源性組織激肽釋放酶表達，有效地促進局部血管再生，有助于急性腦梗死伴3 級高血壓或心房顫動的恢復[5]。 有研究表明，HUK 可以激活激肽釋放酶-激肽系統，誘導缺血腦組織釋放一氧化氮，松弛血管平滑肌，使缺血區血管擴張，改善半暗帶腦供血，恢復神經功能缺損[6]。 此外，HUK 還可以通過增加缺血半暗帶局部腦血流量，誘導梗死周圍的內源性神經干細胞增殖，促進血管和神經再生，開放側支循環，顯著減少大鼠腦缺血再灌注后24 h 腦梗死面積和神經缺損[7]。 本研究旨在探討HUK 對大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠的保護作用機制。 現報道如下。

1 材料方法

1.1 實驗動物與分組 30 只雄性健康SD 大鼠，6 周齡，體質量280 ~300 g，購自本溪長生生物科技有限公司。 將大鼠隨機分為假手術組(Sham 組)、MCAO 組和動脈泵入HUK 組(HUK 組)，每組各10 只。MCAO 組:建立永久性MCAO 大鼠模型。HUK 組:永久性MCAO 大鼠模型建立后30 min，經動 脈 泵 入 HUK ( 15.625 × 10-4PNAU/kg)。Sham 組:線栓淺插入，不堵塞大腦中動脈，其余手術步驟與MCAO 組相同。 每籠飼養5 只大鼠，在標準飼養條件下(室溫20℃±2℃，12 h 明暗周期)自由獲取食物和水。 本研究按醫院動物實驗委員會制定的倫理規定進行。

1.2 MCAO 模型建立 操作過程參考文獻[8]。將麻醉后的大鼠仰臥位固定，沿頸前正中線作長約2.5 cm 切口，鈍性剝離皮下組織，顯露胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌；沿胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的間隙向下剝離，顯露頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈；分離頸內動脈、頸總動脈，注意避免損傷迷走神經；分離頸外動脈及其分支枕動脈和甲狀腺上動脈，結扎分支動脈，并進一步向遠心端分離頸外動脈；動脈夾暫時夾閉頸總動脈和頸內動脈。 在頸外動脈遠端結扎并切斷頸外動脈，然后反折頸外動脈，使其殘端與頸內動脈成一直線，由頸外動脈殘端插入線栓/微管裝置(PE-0402 管)；頸外動脈殘端系6-0 脈血液流出，栓/微管裝置，然后松開夾閉頸內動脈和頸總動脈的動脈夾；沿頸內動脈推送絲線，小心避免線栓/微管裝置進入翼腭動脈；線栓插入距離頸總動脈分叉處約17 ~19 mm，遇到阻力時停止插入；經顱激光多普勒血流儀顯示血流值下降至基線值30%以下，MCAO 造模成功。 系緊環繞頸外的動脈絲線，縫合頸前皮膚，75%乙醇擦洗傷口。

1.3 神經功能缺損評分 建模后24 h，由兩名不知分組情況的研究人員觀察大鼠的癥狀。 采用改良的Longa 神經功能缺損評分標準對大鼠神經功能進行評分:0 分，無缺陷；1 分，對側前肢不能完全伸展；2 分，對側前肢不能伸出；3 分，輕微的向對側轉圈；4 分，嚴重的向對側轉圈；5 分，向對側傾倒。

1.4 梗死體積測定 建模24 h 后，經腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠。 將麻醉后的大鼠置于冰盤上，快速斷頭取腦，取出后立即放入冰箱中冷凍20 min。 然后切去嗅腦、額極、小腦和部分腦干。 用大鼠腦切片模具將剩余部分從前往后切成2 mm厚的腦片，共5 片。 將腦片移入裝有4% TTC染液的培養皿中，然后置于37℃恒溫箱避光染色20 min，每5 min 晃動、翻面一次，保證腦片著色均勻。 染色結束后，將腦片放入PBS 溶液中洗滌，然后轉移至4%多聚甲醛溶液中固定24 h；腦片固定完畢后取出，數碼相機照相，使用Image J 圖像分析軟件計算梗死區域(染色減弱的大腦中動脈供血區域)面積。

梗死體積＝(梗死對側體積－梗死側非梗死區體積)/梗死對側體積×100%

1.5 組織病理學觀察 取大腦后，將海馬區組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成3 ~5 μm 厚的切片。 脫蠟復水后，用蘇木精、伊紅染色。 顯微鏡(OLYMPUS，Japan)下觀察組織病理學變化。

1.6 Western blot 使用BCA 蛋白分析試劑盒(Thermo Fisher Science，USA)測定蛋白質濃度，上清液在蛋白SDS-PAGE 負載緩沖液中煮沸。 等量的蛋白質樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離。 然后，將蛋白轉移至PVDF 膜(Abcam，UK)上，含有10%脫脂奶粉的封閉液(Solarbio，China)封閉膜1.0 h，用Tris 緩沖鹽水加吐溫-20(Tween-20，T1082)清洗3 次后，添加相應的一抗(S-100β、NSE、SREBP2、ADMA、DDAH1)，4℃下孵育過夜。 TBST 清洗膜3 次，與HRP 連接的二抗在室溫下孵育1.5 h，樣品用TBST 洗滌3 次后，增強化學發光法檢測，Image J 軟件對靶蛋白進行定量分析。

1.7 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計學軟件對數據進行處理。 計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。 以P <0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 MCAO 組大鼠神經功能缺損評分明顯高于Sham 組與HUK 組，差異有統計學意義(P<0.05)。 見圖1。

2.2 各組大鼠大腦梗死體積比較 與Sham 組比較，MCAO 組大鼠大腦可見多處梗死灶(呈白色)，未梗死部分呈紅色，而HUK 組大鼠梗死部分較MCAO 組明顯減少(圖2)。 體積測量發現，MCAO 組大鼠梗死體積為(40.25% ±2.14%)，高于HUK 組的(28.35% ±2.86%)，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 各組大鼠神經功能缺損評分比較

圖2 TTC 染色結果

2.3 各組大鼠大腦組織病理學改變結果 MCAO 組大鼠海馬神經元表現為嚴重的損傷，核變形、細胞腫脹、排列分散，并有典型的細胞凋亡改變。 HUK組神經元損傷明顯逆轉，表現為海馬神經元完整緊密排列，核仁清晰，染色均勻，細胞質透明。 見圖3。

2.4 各組大鼠神經損傷標志物水平比較 MCAO 組大鼠大腦組織神經損傷標志物S-100β 和NSE 蛋白表達高于Sham 組與HUK 組，差異有統計學意義(P<0.05)。 見圖4。

圖3 HE 染色結果(a.Sham 組；b.MCAO 組；c.HUK 組；HE×200)

圖4 各組大鼠神經損傷標志物水平比較

2.5 HUK對MCAO大鼠SREBP2/ DDAH1/ ADMA信號通路影響 MCAO 組大鼠大腦組織ADMA 蛋白表達高于HUK 組與Sham 組，SREBP2、DDAH1蛋白表達低于HUK 組與Sham 組，差異有統計學意義(P<0.05)。 見圖5。

圖5 SREBP2、DDAH1、ADMA 蛋白檢測結果

3 討論

HUK 廣泛應用于急性腦梗死的治療，其主要成分是從人體新鮮尿液中提取的238 個氨基酸的糖蛋白，可將激肽原轉化為激肽，有選擇地擴張大腦小動脈，發揮血管擴張劑的作用，同時可以促進新血管的生成[9]。 然而，HUK 對急性腦梗死的保護作用機制尚不清楚。

ADMA 是內源性一氧化氮合酶的抑制劑，可以減少一氧化氮的生成，導致血管內皮損傷[10]。 內源性一氧化氮可以介導炎癥細胞凋亡，調節炎癥反應方向，還可以舒張血管及支氣管平滑肌，改善通氣血流比例[11]。 ADMA 在多種組織和疾病中發揮重要作用，可導致內皮功能紊亂，與高血壓、糖尿病、心力衰竭和肺動脈高壓的發生密切相關[12-13]。本研究發現，MCAO 組大鼠神經功能缺損評分增加，大腦梗死體積增加，大腦組織ADMA 表達顯著增加，而HUK 明顯降低了ADMA 表達，提示ADMA可能在腦梗死過程中發揮重要作用。

本研究中，MCAO 組大鼠DDAH1 蛋白表達降低，而HUK 可以明顯增加MCAO 大鼠DDAH1 蛋白表達。 DDAH1 是ADMA 的主要水解酶，可以將ADMA 分解為瓜氨酸和二甲胺經腎排出[15]。DDAH1 與動脈粥樣硬化、高血壓、慢性心功能不全、高脂血癥、糖尿病及周圍動脈閉塞性疾病有關[16-17]。 DDAH1 還可以通過激活Ras/PI3K/Akt通路，提高體內一氧化氮水平[18]。 SREBP2 是內質網駐留的轉錄因子，通過細胞內膽固醇的減少和內質網鈣離子的丟失被激活，然后誘導觸發核轉位和膽固醇調節基因[19]。 有研究發現，辛伐他汀可以促進SREBP2 蛋白表達，從而促進DDAH1 轉錄，降低 ADMA 表 達[20]。 這 提 示， HUK 可 能 通 過SREBP2/DDAH1/ADMA 信號通路發揮對大鼠急性腦梗死的功能保護作用。

綜上所述，HUK 可明顯改善MCAO 大鼠神經功能缺損評分，減輕大腦梗死體積，緩解神經元損傷，降低S-100β 和NSE 蛋白表達，對急性腦梗死發揮保護作用，這種保護作用可能通過調節SREBP2/DDAH1/ADMA 信號通路實現。