跨膜蛋白16A 通過激活AKT1 信號通路對卵巢癌SKOV3 細胞增殖、侵襲影響

王 列， 申 健， 高 璐， 仲 莞， 李思思， 白 瑩，

張文竹北部戰區總醫院 婦產科，遼寧 沈陽 110000

卵巢癌是嚴重威脅女性健康的一種惡性腫瘤，病死率較高[1-2]。 傳統的卵巢癌治療手段包括手術、化療及中西藥干預。 近年來，靶向治療成為臨床研究熱點，尋找新的卵巢癌生物分子標記物及深入探討其病因和發病機制具有重要意義。 鈣激活氯通道跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)在多種腫瘤中高表達并參與腫瘤的發生發展，但有關TMEM16A 如何促進卵巢癌細胞增殖和侵襲的分子機制，目前尚不清楚[3]。 本研究對癌癥基因組圖譜(THE CANCER GENOME ATLAS，TCGA)數據庫中卵巢癌患者的臨床數據和基因表達譜進行統計分析，探討TMEM16A 高低表達對卵巢癌患者生存期的影響，以及TMEM16A 促進卵巢癌細胞增殖侵襲的作用通路，為卵巢癌靶向治療提供理論基礎和研究數據。 現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人卵巢癌SKOV3 細胞購于美國模式培養物集存庫。 TMEM16A 抗體(英國Abcam生物技術公司)；抗總AKT1 和磷酸化AKT1(p-AKT1，Ser473)抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔二抗(英國Abcam 生物技術公司)；L-15 培養基(美國Gbico公司)；胎牛血清(美國Gbico 公司)；胰酶(美國Hyclone 公司)；Perifosine(Akt1 抑制劑)購自上海MCE 公司；RIPA 緩沖液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(中國Beyotime Biotechnology 公司)；CCK-8 試劑盒(中國Biosharp 公司)；Lipofectamin 2000(美國Invitrogen 公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 TCGA 數據收集 從TCGA 網站(http:/ /cancergenome.nih.gov/)下載卵巢癌患者的臨床數據和轉錄組數據。 臨床數據包括患者信息、腫瘤大小和存活時間等。 轉錄組數據包括患者編號、基因名稱和表達數值。 本研究按照TMEM16A 和AKT1 基因表達的中位值將患者分為高表達組與低表達組，統計病灶>2 cm 的52 例卵巢癌患者的總生存曲線。

1.2.2 細胞培養 SKOV3 卵巢癌細胞解凍復蘇后接種于含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的L-15 培養液中，置入37℃、5% CO2的恒溫孵育箱中。 細胞傳代凍存采用胰酶消化并繼續培養備用。

1.2.3 轉染 TMEM16A 的過表達質粒購于上海吉凱基因公司。 采用Lipofectamin 2000 在SKOV3細胞中使用無血清的培養基瞬時轉染的TMEM16A的過表達質粒。 48 h 后用于后續實驗。

1.2.4 Western blot 將轉染后的卵巢癌SKOV3細胞置于冰上，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液進行勻漿。 將細胞裂解物以13 000 r/min 離心20 min，使用BCA 方法測定蛋白質濃度。 目標蛋白通過SDS-PAGE 分離，待蛋白轉印到PVDF 膜上后用5%的脫脂牛奶封閉2 h，經洗滌液清洗3 次，每次25 min 后，使用TMEM16A(1 ∶2 000)，AKT1(1∶2 000)和p-AKT1(1∶2 000)一抗孵育，4℃過夜。漂洗后將膜與辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫下孵育1 h。 使用伯樂化學發光檢測系統對條帶進行ECL 化學發光試劑檢測。

1.2.5 CCK-8 實驗 將轉染TMEM16A 的SKOV3細胞(5 ×103個/孔)種植到96 孔板，24 h 后換成無血清培養，應用10 μmol/L Perifosine(AKT1 抑制劑)刺激細胞24 h 后，每孔加入CCK-8 溶液37℃一同溫育2 h。 采用酶標儀在450 nm 波長下測量吸光度值(optical density，OD)。

1.2.6 Transwell 細胞體外侵襲實驗 將轉染TMEM16A 的SKOV3 細胞150 μl(4 ×105個/ml)細胞懸液添加到已加入基質膠的Transwell 小室上室中，下室加入含有20% 胎牛血清的培養基，放入37℃、5% CO2的培養箱培養24 h。 24 h 后用4%多聚甲醛固定20 min，Giemsa 染液染色35 min，磷酸鹽緩(phosphate-buffered saline，PBS)清洗3 次，棄PBS 后于顯微鏡下隨機視野進行拍照。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計學軟件對數據進行處理。 計量資料用均數±標準差(±s)表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。 計數資料用例(百分率)表示，組間比較采用χ2檢驗。 采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，并采用Log-rank 檢驗進行分析。 以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TMEM16A、AKT1 基因高低表達的卵巢癌患者的生存期比較 統計TCGA 數據集中52 例卵巢癌患者的基因和臨床數據顯示，TMEM16A 基因高表達26 例，中位生存期(median survival，MS)為31.63 個月；TMEM16A 基因低表達26 例，MS 為54.00 個月；兩組比較，差異有統計學意義[風險比＝2.14(95%可信區間:1.09 ~4.36)，P <0.05]。AKT1 基因高表達26 例，MS 為40.43 個月；AKT1基因低表達26 例，MS 為73.93 個月；兩組比較，差異有統計學意義[風險比＝0.55(95%可信區間:0.25 ~1.19)，P<0.05]。 TMEM16A/AKT1 聯合高表達15 例，MS 為31.63 個月；TMEM16A/AKT1 聯合低表達15 例，MS 為58.20 個月；兩組比較，差異有統計學意義[風險比＝2.67(95% 可信區間:1.16 ~7.50)，P < 0.05]。 提示TMEM16A/AKT1高表達的卵巢癌患者預后差，生存期顯著下降。見圖1。

圖1 卵巢癌患者中TMEM16A 與AKT1 基因表達的生存曲線圖(a.TMEM16A 基因高低表達患者生存曲線；b.AKT1 基因高低表達患者生存曲線；c.TMEM16A/AKT1 聯合高低表達患者生存曲線)

2.2 TMEM16A 對卵巢癌SKOV3 細胞中AKT1 蛋白表達的影響 轉染空質粒與過表達TMEM16A 的卵巢癌SKOV3 細胞中TMEM16A 蛋白表達分別為(0.59 ±0.05)、(0.98 ±0.08)，p-AKT1 蛋白表達分別為(0.54 ±0.03)、(1.10 ±0.08)，AKT1 蛋白表達分別為(1.21 ±0.13)、(1.20 ±0.09)。 轉染空質粒與過表達TMEM16A 的卵巢癌SKOV3 細胞中TMEM16A 和p-AKT1 蛋白的表達情況比較，差異均有統計學意義(P <0.05)。 提示TMEM16A 高表達能夠激活卵巢癌細胞內AKT1 信號通路。 見圖2。

圖2 TMEM16A 對卵巢癌SKOV3 細胞中AKT1 蛋白表達的影響

2.3 TMEM16A 對SKOV3 卵巢癌細胞增殖的影響 CCK-8實驗結果顯示，TMEM16A 過表達能夠增強SKOV3 細胞的增殖能力，相對于轉染空質粒對照組的(100.00% ±0)，TMEM16A 過表達的增殖力為(139.20% ±7.36%)，TMEM16A 過表達＋Perifosine 的 增 殖 力 為(68.82% ± 7.80%)， 提 示TMEM16A 的促增殖作用可以被AKT1 抑制劑Perifosine 所逆轉，TMEM16A 通過AKT1 信號通路促進SKOV3 細胞增殖。 見圖3。

圖3 轉染TMEM16A 及應用AKT1 抑制劑后對SKOV3 卵巢癌細胞增殖的影響(與轉染空質粒對照組比較，①P<0.01；與轉染過表達TMEM16A 比較，②P <0.001)

2.4 TMEM16A 對SKOV3 卵巢癌細胞侵襲的影響 在卵巢癌SKOV3 細胞中，過表達TMEM16A 后侵襲能力增強，而在過表達TMEM16A 細胞中加入AKT1 抑制劑Perifosine 后其侵襲能力下降，提示TMEM16A 高表達促進SKOV3 細胞侵襲，AKT1 抑制劑可限制TMEM16A 高表達的侵襲能力。 見圖4。

3 討論

TMEM16A 又稱Anoctamin1，被證實為鈣激活氯通道，在包括頭頸癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌在內的多種腫瘤中高表達，參與調節細胞增生、遷移等生物學行為[4-7]。 目前，TMEM16A 對腫瘤細胞轉移的影響方面的相關研究報道較少。深入研究TMEM16A 在腫瘤中的功能及作用機制具有一定的科研意義。

圖4 轉染TMEM16A 及應用AKT1 抑制劑對SKOV3 卵巢癌細胞侵襲的影響(200 倍)

TMEM16A 高表達對不同腫瘤細胞增生、遷移、侵襲等生物學行為的作用不同。 大量研究報道，TMEM16A 高表達促進包括乳腺癌、胃癌、前列腺癌、頭頸癌、結直腸癌等多種腫瘤細胞增生以及在體腫瘤生長[8-13]。 然而，也有研究報道，TMEM16A高表達抑制腫瘤細胞及非腫瘤細胞(如肺內皮細胞)的增生[6]。 本研究結果發現，在TCGA 中，TMEM16A 高表達與低表達TMEM16A 的卵巢癌患者比較，高表達TMEM16A 患者的存活率顯著降低，提示TMEM16A 在卵巢癌的發生發展中發揮重要作用，可能成為卵巢癌治療的潛在靶向生物標記物。因此，進一步研究TMEM16A 鈣激活氯通道在卵巢癌轉移過程中的作用原因是深入了解其參與卵巢癌發生發展的前提。

腫瘤細胞的增殖和遷移與其胞內信號通路的活化密切相關，但TMEM16A 高表達的卵巢癌細胞開啟的信號通路種類目前尚不清楚。 2013 年，Britschgi 等[14]研究發現，敲除TMEM16A 可通過下調乳腺癌細胞中AKT 磷酸化蛋白的表達抑制增殖。AKT 是細胞內特異性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，AKT 的活化調控許多細胞的生理病理過程[15-17]。本研究進一步通過對TCGA 數據庫中卵巢癌患者信息分析發現，AKT1 基因高表達組總存活率低于低表達組，TMEM16A/AKT1 聯合高表達組的總存活率明顯低于TMEM16A/AKT1 聯合低表達組。AKT 信號通路在卵巢癌的發展進程中發揮重要的調控作用，例如腫瘤細胞的生長、侵襲、轉移、凋亡及自噬等生物學行為[18-19]。 因此，探討TMEM16A的表達是否影響AKT1 蛋白水平對于卵巢癌預防、診斷和預后判斷具有臨床意義。

AKT 基因的異常活化可使腫瘤細胞逃避凋亡，異常增殖分化，促進腫瘤血管生成和腫瘤的發生[20-21]。 本研究發現，在過表達TMEM16A 的SKOV3 卵 巢 癌 細 胞 中， p-AKT1 顯 著 增 加， 轉 染TMEM16A 的SKOV3 卵巢癌細胞增殖能力增強，而應用AKT1 抑制劑處理后能下調TMEM16A 高表達引起的增殖情況，說明TMEM16A 對卵巢癌細胞增殖能力的調控是通過對AKT1 基因的調節完成的。Transwell 實驗結果顯示，高表達TMEM16A 的卵巢癌細胞侵襲能力增強，加入AKT1 抑制劑后可影響TMEM16A 高表達的侵襲能力，提示靶向干預TMEM16A 表達可對卵巢癌的轉移具有一定的抑制作用。

綜上所述，過表達TMEM16A 可以激活卵巢癌SKOV3 細胞中AKT1 蛋白。 TMEM16A 可能通過激活AKT1 促進卵巢癌SKOV3 細胞增殖和侵襲。 本研究為TMEM16A 靶向性的標記、參與卵巢癌的治療及預后提供了新的理論依據。