超聲聯合微泡選擇性破壞小鼠腹主動脈不穩定斑塊內不成熟血管

郭勝存，張勝葉，戶富棟，陳 熙，陳 魁

(鄭州大學第一附屬醫院心血管內科，河南 鄭州 450052)

斑塊內新生的滋養血管通常為不成熟血管，其血管內皮不連續、基底膜不完整且缺乏周細胞，易發生滲漏[1-2]，故與斑塊不穩定性顯著相關，且可能成為治療穩定和逆轉易損斑塊的靶點；而易損斑塊中約80%微血管結構不成熟[1]。現有抑制血管新生藥物缺乏靶向性，且全身毒副作用嚴重[3-4]。超聲介導微泡破壞所致空化效應可對不成熟血管壁直接產生局部物理損傷效應，無全身毒副作用，而對正常組織內成熟血管無顯著影響[2,5]。本研究觀察超聲聯合微泡選擇性破壞小鼠腹主動脈不穩定斑塊內不成熟血管的可行性及其對斑塊不穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 于北京大學動物實驗中心購入30只8周齡雄性載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因敲除小鼠(ApoE-/-)，體質量18～20 g，以高脂飲食(0.15%膽固醇、21%脂肪)飼養至30周齡，建立動脈不穩定斑塊模型。將小鼠模型隨機分為實驗組(n=12)、未干預組(n=12)及對照組(n=6)。本研究經鄭州大學實驗動物福利倫理委員會審查并批準(批準號：2021-KY-0994-002)。

1.2 制備微泡及評價其特性 參考文獻[2,6]方法制備包裹全氟丙烷脂質微泡，置于4℃冰箱中保存備用。于制備后即刻及1周后以顯微鏡觀察微泡形態，并取20 μl微泡，以庫爾特粒子計數儀檢測其粒徑及濃度。

1.3 超聲造影 采用Siemens Sequoia 512超聲診斷儀，15L7探頭，頻率7 MHz。將探頭固定于腹主動脈長軸，采集常規超聲圖像。對實驗組及未干預組經鼠尾靜脈彈丸式注入0.1 ml微泡，以機械指數為0.18的造影對比脈沖序列模式行超聲造影，保存圖像至顯影圖像廓清，評估微泡在體內的顯影時間[7]；并于造影后處死未干預組小鼠。

1.4 超聲治療 以脈沖式超聲空化治療儀(DCT-700，深圳市威爾德醫療電子有限公司)對實驗組及對照組行超聲治療。實驗組于經尾靜脈彈丸式注入0.1 ml微泡 8～10 s后以超聲輻照腹主動脈斑塊對應體表區域[2]，能量3.0 MPa，探頭頻率1.0 MHz，超聲發射占空比0.19%，間歇輻照模式(探頭發射工作2 s后間歇8 s)，脈沖重復頻率10 Hz，治療時間1 min；治療后24 h隨機處死6只，余6只飼以高脂飲食至后8周處死。對照組小鼠及接受相同方式超聲治療及高脂飲食飼養，8周后被處死。

1.5 病理檢查 分離并取出腹主動脈組織，行HE、Masson染色，觀察脂質沉積和膠原纖維，以Image J軟件面積法分別測量其含量[7]；分別以CD68和α-SMA標記巨噬細胞和平滑肌細胞，以免疫組織化學法評價其在斑塊中的含量，以斑塊內見棕黃色或黃褐色區域為其表達陽性，并采用Image-Pro Plus軟件進行半定量分析，以測量目標的面積與斑塊總面積的比值代表其相對含量，并根據公式1、2計算斑塊易損指數及核/帽比值[7]：

(1)

(2)

以CD31標記內皮細胞，以免疫組織化學法檢測斑塊內微血管，斑塊內見棕黃色血管內皮細胞或細胞簇代表1條單獨的微血管；以CD31和α-SMA共同標記內皮細胞和周細胞，以熒光染料DAPI標記細胞核，采用免疫熒光染色法檢測斑塊內不成熟血管，將1個CD31陽性內皮細胞周圍缺乏α-SMA陽性周細胞定義為1條不成熟血管或新生血管。于100倍光鏡下觀察標本，選擇3個血管著色最豐富區域；轉換400倍光鏡觀察視野中的微血管數，取3個視野的平均值，評估斑塊微血管密度(micro-vessel density, MVD)[8]；以Image-Pro Plus軟件對所取視野免疫熒光圖片進行合并通道(Merge)，評價斑塊內不成熟血管MVD，并計算成熟血管的MVD。對心、肝、腎及肺組織行HE染色，評估微泡安全性。

1.6 統計學分析 采用SPSS 19.0統計分析軟件。對計量資料以Shapiro-Wilk檢驗行正態性檢驗，以±s表示符合正態分布者，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。以Pearson相關分析評估兩變量之間的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 微泡特性 新鮮制備微泡的濃度為8.62×108個/ml，粒徑0.88～3.44 μm，平均(2.16±1.28)μm；約99.1%的微泡直徑<7 μm(圖1A)，光學顯微鏡下微泡形態完整、規則、細密、分布較均勻(圖1B)。置于4℃冰箱貯存1周后，微泡濃度、粒徑及形態均無明顯改變(圖1C、1D)。

二維超聲見小鼠腹主動脈內膜不同程度局限性增厚(圖2A)，CDFI示局部血流豐富(圖2B)，即斑塊形成；超聲造影見斑塊局部增強(圖2C)。注入微泡后約9 s，未干預組腹主動脈顯影達峰(圖3A)，峰值減半時間為5.78～10.63 min，中位峰值減半時間為8.08 min(圖3B)，廓清時間為15.34～20.49 min，中位廓清時間為17.92 min(圖3C)。

2.2 斑塊MVD與斑塊易損性 CD31染色顯示未干預組腹主動脈斑塊內含豐富微血管(圖4A、4B)；HE和Masson染色顯示斑塊內存在大量脂質沉積(圖4C)和少量膠原纖維(圖4D)；CD68和α-SMA染色顯示斑塊內表達大量巨噬細胞(圖4E)和少量平滑肌細胞(圖4F)。腹主動脈斑塊MVD為43～144條/視野，平均(88.25±30.5)條/視野，易損指數為0.75～2.97、平均1.83±0.76，核/帽比值為0.714～2.468、平均1.60±0.58；MVD與易損指數及核/帽比值均呈正相關(r=0.728、0.739，P均<0.05)，見圖5。

2.3 斑塊內不成熟血管MVD與斑塊易損性 未干預組腹主動脈斑塊CD31和α-SMA雙標記免疫熒光染色(圖6)顯示，斑塊內不成熟血管的平均MVD為(78.25±15.84)條/視野，成熟血管平均MVD為(15.67±4.56)條/視野。未干預組腹主動脈斑塊內不成熟血管MVD與斑塊易損指數及核/帽比值均呈正相關(r=0.732、0.680，P均<0.05)，而其內成熟血管MVD與斑塊易損指數及核/帽比值無明顯相關(P均>0.05)，見圖7。

2.4 超聲聯合微泡選擇性破壞斑塊內不成熟微血管 實驗組超聲聯合微泡治療后24 h，斑塊內不成熟血管MVD相比未干預組減少(P<0.05)，2組間成熟血管MVD差異無統計學意義(P>0.05)，見圖8；治療后8周，與對照組相比，實驗組斑塊內平滑肌細胞含量顯著增加，巨噬細胞含量和MVD均減少(t=-9.82、5.78、9.12，P均<0.05)，斑塊易損指數及核/帽比值降低(t=11.81、6.33，P均<0.05)。見圖9、10。

各組小鼠心、肝、腎及肺組織均未見出血、梗死及炎癥浸潤等異常表現。

3 討論

本研究制備的脂質微泡性狀穩定，用于小鼠實驗的微泡均為新鮮制備；庫爾特粒徑分布圖結果顯示微泡平均粒徑約2.16 μm，約99%的微泡直徑<7 μm，其中可能含有部分納米級微泡，經靜脈注射進入體內后可順利通過肺部毛細血管網而進入全身循環系統，并通過易損斑塊的新生滋養血管進入動脈斑塊內；實驗過程中無小鼠死亡，且其心、肝、腎、肺組織內未見出血、梗死及炎癥浸潤等表現，與既往報道[2]相符，提示所用微泡制備方法安全、可行。

超聲介導微泡破壞可引起空化效應，超聲聲壓是決定慣性空化的重要參數之一[2]。微泡介導的超聲空化強度與血管損傷呈正相關[9]。超聲聯合微泡治療后，不成熟血管的密度隨超聲波增加而逐漸減少，超聲能量增大至3.0 MPa時，新生血管大部分被破壞，而對于正常組織無顯著影響[2,5,10]。本研究以超聲能量3.0 MPa的超聲聯合微泡進行治療，治療后24 h，相比與未干預組，實驗組腹主動脈斑塊不成熟血管MVD減少，而正常成熟血管MVD無明顯差異。分析原因，主要在于大部分斑塊中的MVD為未成熟血管，其結構異常，內皮間隙增大，基底膜存在缺陷，周細胞覆蓋率低[1,11-12]，使其對超聲聯合微泡的空化效應高度敏感，而成熟血管則相對不敏感[13]。

本研究結果顯示，超聲聯合微泡治療后8周，相比對照組，實驗組腹主動脈斑塊巨噬細胞含量減少、平滑肌細胞含量升高、易損指數和核/帽比值降低，提示超聲聯合微泡可選擇性有效破壞斑塊內不成熟血管、提高斑塊穩定性。單次超聲聯合微泡治療后，殘留的斑塊內新生血管仍可導致紅細胞外滲，可能是導致斑塊不穩定的因素之一[11,14]。超聲聯合微泡多次治療破壞動脈斑塊血管生成效果尚待進一步觀察。

本研究的局限性：①動物實驗研究，且樣本量小；②所用微泡為非靶向微泡，以靶向新生血管的微泡可能更易實現精準治療，有待后續觀察。

綜上，超聲聯合微泡可選擇性破壞小鼠腹主動不穩定斑塊內不成熟血管，改善斑塊不穩定性。