小鼠深靜脈血栓實驗模型的制備

張茜， 谷田， 劉哲宇， 李思， 鄭曉新

(1. 武漢大學人民醫院心血管內科，湖北 武漢 430060； 2. 心血管病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060； 3. 武漢大學心血管病研究所，湖北 武漢 430060)

深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)是多種因素引起的靜脈血栓性疾病，多發生在腿部，并伴有肺栓塞，統稱為靜脈血栓栓塞[1]。DVT成因復雜，主要有遺傳因素、創傷、血液黏度增大、長期固定、血管內皮功能異常等[2]。患病后易造成肢體殘疾，甚至危及生命，其治療主要包括抗凝[3]和介入治療[4]等。然而DVT病變過程復雜，病因尚未完全明確，研究DVT形成的信號傳導通路、標志性的早期預警因子、預防和治療的藥物研發都離不開動物模型。小鼠因具有價廉、操作方便、可重復性強、符合實驗動物的3R原則[5]等特點而成為DVT研究的首選動物。小鼠DVT模型制備的質量及成功率將直接影響實驗研究的進度和可信度，目前系統討論小鼠DVT模型制備方法的報道較少。本研究旨在構建一種操作性、可行性和實用性強的小鼠DVT模型，探討相關構建的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

C57BL/6J小鼠56只， 6～8周齡，雌雄不限，體重20～25 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗操作遵守武漢大學人民醫院動物倫理委員會規定。實驗小鼠隨機分為正常對照組(n=6)、假手術組(n=12)、手術1組(n=12)、手術2組(n=12)、內毒素+手術組(n=14)。正常對照組不做處理；手術1組行下腔靜脈90%結扎術；假手術組除不結扎外，其他操作同手術1組；手術2組在結扎術前2 h，腹腔注射0.1 mL的生理鹽水；內毒素+手術組在結扎術前2 h，腹腔注射溶于0.1 mL生理鹽水的0.1 mg/kg內毒素(脂多糖，美國Sigma公司)。

1.2 DVT模型制備

1.2.1 術前準備及超聲評估 實驗小鼠術前4 h禁水，12 h禁食，稱重，用2%異氟醚-氧(氧濃度100%)混合物麻醉小鼠，待小鼠安靜、呼吸平穩后仰臥固定于手術臺。使用Visual Sonics帶有40 MHz小鼠掃描頭的Vevo 2100 系統獲得下腔靜脈和周圍結構、血管以及血流的圖像。

1.2.2 分離下腔靜脈 腹部消毒，沿其腹白線切開，切口不要太長，下至凝固腺，上至露出肝臟一角即可。用濕棉簽小心撥出小腸等器官置于小鼠左側，用溫生理鹽水浸濕的紗布包裹，顯露下腔靜脈。在解剖顯微鏡下辨別下腔靜脈和腹主動脈以及旁邊的輸尿管和神經，用顯微器械小心地在腎動脈分叉水平以下節段，將下腔靜脈與主動脈分離，結扎所有下腔靜脈側支。

1.2.3 下腔靜脈結扎及術后即刻超聲評估 參考Ponomaryov等[6]方法，將1根30 G的針頭與下腔靜脈用7-0聚丙烯縫線一并綁繞，再移除針頭，該方法可使下腔靜脈面積縮小約90%，且不損傷血管內皮。腹腔中加入8 000 U青霉素預防傷口感染，用5-0縫合線逐層縫合腹腔。迅速在下腔靜脈所在區域覆蓋超聲凝膠，使用Vevo 2100超聲影像系統獲得下腔靜脈和周圍結構、血管以及血流的圖像。隨后紗布清潔和碘伏消毒。

1.2.4 術后護理 將小鼠置于25～28 ℃的環境中，直至復蘇。保持墊料清潔干燥，常規飼養及飲水，監測小鼠精神狀態、食欲、傷口恢復和體重情況。術后肌注青霉素8 000萬/d預防傷口感染。

1.3 標本的獲取及測量

造模術后48 h，用90 mg/kg、5%戊巴比妥鈉腹腔注射小鼠，致過量麻醉后處死小鼠。沿腹白線開腹，移開小腸等器官，顯露下腔靜脈。在下腔靜脈的結扎處下方，取出結扎線遠心端長度為1.0 cm的下腔靜脈段血管，小心分離血栓，進行測量。根據文獻報道[7]，超聲測得的血栓面積和按比例確定的血栓重量顯示出很強的相關性(r2=0.96)。因此，本研究中使用的手動血栓大小評估方法可以被認為是有效的，與傳統的超聲測量面積的方法相比，更加簡單便捷。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 手術成功率及死亡率

實驗動物術后死亡視為手術失敗。正常對照組的6只小鼠全部存活至實驗終點；假手術組小鼠手術成功率為66.7%(8/12，不合格2只)，術后死亡率為16.7%(2/12，1只為麻醉意外，1只為出血)；手術1組小鼠手術成功率為66.7%(8/12)，術后死亡率為25.0%(3/12，1只為麻醉意外，1只為出血，1只為感染)；手術2組小鼠手術成功率為75.0%(9/12)，術后死亡率為25.0%(3/12，2只為出血，1只為感染)；內毒素+手術組手術成功率為50.0% (7/14，不合格1只)，術后死亡率為42.8%(6/14，2只為出血，4只為感染)。內毒素+手術組有4例動物在注射內毒素后死亡，不能排除由內毒素引起，故在計算下腔靜脈狹窄術手術總死亡率和成功率時，僅納入手術1組和手術2組數據。下腔靜脈狹窄手術的小鼠共24只，下腔靜脈狹窄術總死亡率為25.0%(6/24)，總成功率為70.8%(17/24)。死亡原因主要為麻醉意外、術中或術后出血、傷口感染。在觀察終點，各實驗組存活動物體重無明顯差異。

2.2 麻醉效果

用異氟醚在自制麻醉盒里誘導麻醉30～40 s，隨后以2%異氟醚-氧混合物持續麻醉小鼠，維持效果好，以動物安靜、捏腳趾反射消失和呼吸平穩為完全麻醉表現。本實驗麻醉意外死亡2只，均為瘦弱個體，推測可能也與異氟醚誘導麻醉時間過長有關(>50 s)。

2.3 手術成功評價

圖1顯示的是小鼠DVT模型構建過程，白光及血管超聲圖片。在小鼠的下腔靜脈未結扎前，超聲顯示血流清晰且通暢，下腔靜脈易于壓縮。在下腔靜脈結扎并拔掉30 G針頭后即刻，超聲可見結扎線遠端一束來自后側支的靜脈血流注入下腔靜脈的信號，說明仍有靜脈血流通過結扎點，表明血栓模型造模成功。

2.4術后動物基本情況和取材前大體觀

所有實驗組動物術后2～3 h逐漸開始活動，24 h后活動量明顯增大，內毒素+手術組小鼠活動稍差、精神欠佳、食欲減退。正常對照組和假手術組下腔靜脈管徑粗細均勻，管壁薄而柔軟，內膜面平整、光滑。手術1組、手術2組和內毒素+手術組小鼠術后48 h形成DVT的下腔靜脈血管段血管彈性下降，腹腔內均可見腸系膜靜脈血管明顯擴張，腸蠕動減弱，并可見輕-中度腸脹氣。

A：下腔靜脈結扎時，箭頭所示為30G針頭；B：下腔靜脈 90%結扎后即刻；C：結扎前下腔靜脈超聲圖，箭頭所示為下腔靜脈血流信號；D：下腔靜脈結扎后超聲圖，箭頭所示為后側支靜脈血流信號

2.5 血栓重量與長度

各組血栓形成情況如圖2所示。以同一批次小鼠形成血栓的重量和長度是否有統計學差異，來評估DVT模型的穩定性。手術1組與手術2組的下腔靜脈血栓重量和長度比較，差異均無統計學意義[重量：(5.58±3.98) mgvs.(5.80±4.33)mg，t=-0.105，P=0.918；長度：(3.30±1.92) mmvs.(3.51±2.45)mm,t=-0.196，P=0.847]。與手術2組相比，內毒素+手術組血栓長度增加，差異有統計學意義[(6.37±2.08)mmvs.(3.51±2.45)mm，t=2.469，P=0.027]，血栓重量也增加，但差異無統計學意義[(9.81±4.72)mgvs.(5.80±4.33)mg，t=1.771，P=0.098]。正常對照組、假手術組、手術1組、手術2組和內毒素+手術組形成血栓例數占比依次為0、0、87.5%、77.7%和100%。

圖2 各實驗組血栓形成情況

3 討論

DVT是血液在深靜脈內不正常凝結引起的靜脈回流障礙性疾病。深入研究其致病機理，對改善患者癥狀、降低并發癥發生率及死亡率有重要意義。而建立穩定可靠且符合臨床DVT特點的動物模型是這一問題的研究基礎。

既往研究嘗試多種不同的動物制備模型[8]。楊軍等[9]認為，在血栓機化的早期階段，不同動物個體間存在著相似的規律。目前小鼠應用最為廣泛，其優勢表現在[10]：① 標準“實驗動物”可受到全面控制，保證實驗結果的可靠性；② 技術操作的可行性高；③成本低，易于取得。

眾多危險因素均是通過Virchow提出的血栓形成3大要素，即血管壁損傷、血流緩慢、血液高凝狀態而促進靜脈血栓的形成[11]。目前常采用的方法有[12]：① 下腔靜脈狹窄法，通過外力加壓下腔靜脈導致穩定的層狀血栓形成。該法保證近心端通暢，更符合人體血栓形成特點，形成血栓時間較長，量少且數值相差不大。適合血栓溶解和再通的實驗研究。② 下腔靜脈結扎法，通過手術閉塞下腔靜脈，從而損傷血管，暴露血管內皮下膠原纖維，并造成局部低氧環境和炎癥反應，最終激活凝血系統[13]。該法不能保障血栓的近心端通暢，不適合藥物研究。③ 電解損傷法，即將直流電通過導線誘導血管內自由基形成，從而使內皮細胞活化，誘發形成血栓。該模型可用于血栓治療藥物研發，但手術時間長，并可使靜脈壁完整性破壞。本研究使用了上述第一種方法，即下腔靜脈狹窄法。在該模型中，下腔靜脈管腔體積減小了約 90%。血栓形成由內皮細胞活化啟動，形成于血流速度降低的狹窄點遠心端。在組織學上觀察到該模型中形成的血栓也與人類靜脈血栓相似[14]。因此基于該模型所獲得實驗數據具有一定的參考價值。

本實驗總結提高成功率降低死亡率的要點如下，① 動物質量、飼養環境及術前護理：實驗動物適應性飼養1周。術前12 h禁食、4 h禁水，避免過多消化道內容物影響手術過程，降低術后發生腸梗阻等并發癥的風險。② 麻醉效果：本實驗麻醉意外死亡2只，推測可能與自身體弱及異氟醚誘導麻醉時間過長有關。小鼠體型小，應注意避免麻醉藥物過量。③ 預防出血和組織損傷：切口應下至凝固腺，上至露出肝臟一角即可，盡量避免長切口以減少創傷。下腔靜脈比較脆弱易破裂，加上個別動物存在異常解剖結構，故分離時采用顯微手術器械小心鈍性分離，動作輕柔避免損傷神經纖維和輸尿管。④ 預防感染：器械嚴格滅菌處理，術中遵守無菌操作，青霉素預防感染。⑤ 預防腹腔粘連：術后腹腔中注入1.0 mL生理鹽水。

本研究中，手術1組和手術2組DVT重量和長度均無統計學差異，表明本實驗DVT模型是穩定的。為進一步驗證模型實用性，設置了內毒素+手術組，低劑量內毒素可誘導DVT加重，血栓長度有統計學差異，血栓重量無統計學差異，但仍大于手術2組。可能由于內毒素刺激機體合成與過量釋放細胞間黏附分子1，最終使出血-凝血機制失衡，從而促進血栓形成。既往研究曾探討過內毒素注射后循環炎性標志物變化情況以及血栓病理形態學，但該部分不是本研究重點內容，故未進行重復[15]。

綜上所述，本研究通過方法學改進，建立一種較理想的DVT小鼠模型。與其他動物或不同模型相比，手術1組和手術2組建立的動物模型具備諸多優勢，其更符合人體DVT的病理生理演變，操作可重復性強，方法簡便并且價格低廉。