LncRNAMNX1-AS1 調節miR-744-5p/SH3BGRL3對喉癌細胞生長、遷移的影響

尹稱意，馬兵良，徐玨

喉癌主要以鱗狀細胞癌最常見，其發病率呈上升趨勢[1]。盡管現在醫療水平技術不斷提高，但是喉癌患者的預后情況尚無明顯改善，侵襲和轉移是造成喉癌高死亡率的重要原因[2]。因此，研究喉癌發生發展的作用機制有利于發現喉癌診治和判定預后的潛在標志物。長鏈非編碼RNA（lncRNAs）是由RNA 聚合酶II轉錄生成的長度超過200 nt的副產物，雖然不具有編碼蛋白質的能力，但其序列特征與信使RNA（mRNA）相似，參與細胞增殖、分化、代謝及個體發育等生物學功能[3-4]。既往研究顯示，喉癌患者血清、癌組織中LncRNA H19 表達均上調，LncRNA H19 可能作為評估患者預后的重要標志物[5]。長鏈非編碼RNA MNX1 反義RNA1（LncRNAMNX1-AS1）是新發現的一種分子[6]，有研究顯示，干擾LncRNA MNX1-AS1 誘導卵巢癌細胞的干樣特性降低，對細胞抑制作用明顯[7]。另有研究顯示，LncRNA MNX1-AS1 在膀胱癌中顯著上調且與不良預后相關[8]。但LncRNA MNX1-AS1 調節喉癌細胞生長、遷移的作用機制尚未見報道。因此，本研究分析干擾LncRNA MNX1-AS1 對喉癌細胞生長、遷移的影響，初步探討其影響喉癌發展的作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 實驗細胞：人喉癌Hep-2 細胞購自中科院上海細胞所。實驗主要試劑和儀器：所使用質粒以及抗體均購自上海吉瑪公司；Cell Counting Kit-8（CCK8）購自日本同仁Dojindo 公司；RPMI-1640 培養基、青鏈霉素購自武漢益普生物科技有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶購自北京澤平科技有限責任公司；Trizol、LipofectamineTM2000 購自北京索萊寶科技有限公司，TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit 及TaqMan?UniversalPCR MasterMix購自上海凱杰企業管理有限公司；cDNA反轉錄試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司；BCA 試劑盒購自上海羽哚生物科技有限公司；Transwell 小室購自Corning 公司（美國）；雙熒光素酶報告基因系統試劑盒購自成都安森盛源科技有限公司ELx808 酶標儀購自常熟市圣海電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將Hep-2 細胞置于含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養基培養。將細胞保持在37℃充滿5%CO2的培養箱中。

1.2.2 細胞轉染 取對數期生長的Hep-2 細胞，接種至不含血清的RPMI 1640 培養基的6 孔板中（1.0×105個/孔），培養24 h 后。構建穩定敲低細胞系：將細胞分成sh NC 組和sh MNX1-AS1 組，將lncRNA MNX1-AS1 shRNA 慢病毒轉染至sh MNX1-AS1 組細胞，將對照shRNA慢病毒插入pLVX-tdTomato-Puro載體轉染至sh NC 組。構建瞬時轉染細胞系：將細胞分成 NC mimics 組、miR-744-5p mimics 組、NC inhibitor 組、miR-744-5p inhibitor 組、sh SH3BGRL3組、miR-744-5p inhibitor+sh SH3BGRL3組。利用LiPofectamine TM 2000 脂質體轉染法，將miR-NC mimics 轉染至NC mimics組細胞，miR-744-5p mimics 轉染至miR-744-5p mimics 組，miR-NC inhibitor 轉染至NC inhibitor 組細胞，miR-744-5p inhibitor 轉染至miR-744-5p inhibitor 組細胞，sh SH3BGRL3 轉染至sh SH3BGRL3 組，miR-744-5p inhibitor和同時 sh SH3BGRL3 轉染至miR-744-5p inhibitor+sh SH3BGRL3 組細胞。轉染48 h 后收集細胞用于后續實驗。引物序列見表1。

表1 實驗所用引物序列

1.2.3 實時熒光定量（RT-PCR）檢測MNX1-AS1、miR-744-5-p 和SH3BGRL3表達水平 采用Trizol 法提取細胞的總RNA，采用紫外分光光度計法測定RNA的濃度。以RNA 為模板進行逆轉錄獲得cDNA 并置于4 ℃保存，進行熒光定量PCR 擴增，置于RT-PCR 儀中進行測定，設置反應條件：95 ℃，5 min 預變性；95 ℃變性10 s，60 ℃退火35 s，65 ℃延伸30 s，擴增35 個循環。以U6 和GAPDH 做為內參。采用2－CT法統計MNX1-AS1、miR-744-5-p 和SH3BGRL3 mRNA 相對表達量。

1.2.4 敲低MNX1-AS1 表達對喉癌細胞生長的影響 取對數期生長的sh NC組和sh MNX1-AS1 組Hep-2 細胞，細胞轉染見1.2.2 項，將細胞（5×103/孔）接種于96 孔板。采用LipofectamineTM2000進行轉染后將細胞置于CO2培養箱進行培養24 h，于0、24、48、72 h 對細胞吸光度（OD）進行檢測。每孔加入100l 體積的CCK-8 溶液于37 ℃環境中繼續孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm的吸光度。

1.2.5 過表達miR-744-5p 對喉癌細胞生長的影響 取對數期生長的NC mimics 組和miR-744-5p mimics 組Hep-2 細胞，細胞轉染見1.2.2 項，細胞生長具體操作過程同1.2.4 項。

1.2.6 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3軸對喉癌細胞生長的影響 取對數期生長的NC inhibitor 組、miR-744-5p inhibit or 組和miR-744-5pinhibitor+shSH3BGRL3組Hep-2 細胞，細胞轉染見1.2.2 項，細胞生長具體操作過程同1.2.4 項。

1.2.7 敲低MNX1-AS1 表達對喉癌細胞遷移能力的影響 取對數期生長的sh NC 組和sh MNX1-AS1 組Hep-2 細胞，細胞轉染見1.2.2 項。在24 孔板中，將細胞懸液（5×104/ml）接種于Transwell上室，下室加入500l 含10%血清的培養基，置于培養箱孵育。37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h，取出Transwell 小室，棉簽輕輕擦拭小室膜上表面，甲醛固定10 min，0.3%結晶紫溶液染色20 min，用PBS洗3 次，在倒置顯微鏡下觀察，觀察小室膜下表面細胞數量取其平均值，本實驗平行重復3 次。

1.2.8 過表達miR-744-5p對喉癌細胞遷移能力的影響 取對數期生長的NC mimics組和miR-744-5pmimics 組Hep-2 細胞，細胞轉染見1.2.2 項。遷移實驗操作步驟見1.2.7。

1.2.9 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3軸對喉癌細胞遷移能力的影響 取對數期生長的NC inhibitor 組、miR-744-5p inhibitor 組和miR-744-5p inhibitor+sh SH3BGRL3 組Hep-2 細胞，細胞轉染見1.2.2 項。遷移實驗操作步驟見1.2.7。

1.2.10 雙熒光酶素報告基因實驗LncRNAMNX1-AS1 與miR-744-5-p 結合位點通過生物信息學預測網站StarBase v3.0（http://starbase.sysu.edu.cn/）上進行鑒定。將含有 miR-744-5p 結合序列的LncRNA MNX1-AS1 插入pLVX-IRESPuro 載體獲得野生型質粒MNX1-AS1 WT。LncRNA MNX1-AS1 與miR-744-5p結合的序列被突變并插入pLVX-IRESPuro 載體獲得突變型質粒MNX1-AS1 Mut。取對數期生長的喉癌細胞Hep-2 接種于24 孔板中（2.5×105個/孔），培養24 h后，棄培養基。采用Lipofectamine TM 2000 轉染1 g 熒光素酶報告載體，將MNX1-AS1 WT 與miR-744-5p mimic或 NC mimic、MNX1-AS1 Mut 與miR-744-5p mimics 或 NC mimic+MNX1-AS1 Mut 分別共轉染喉癌細胞Hep-2 中。轉染12 h 后，更換新鮮的培養基。再培養24 h 后，裂解細胞，離心（3 500 r/min、5 min）后，取上清液檢測熒光素酶活性。

1.2.11 蛋白免疫印跡實驗 取NCmimics 組和miR-744-5p 組細胞，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法蛋白濃度測定蛋白濃度。沸水浴中煮沸10min，電泳后轉膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1h。加入一抗SH3BGRL3（1∶5 000），4 ℃孵育過夜。次日PBS 洗滌3 次，然后加入相應二抗（1∶1000），室溫孵育1h，PBS洗滌3次，發光液進行顯色，選擇內參GAPDH。

1.3 統計方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t 檢驗；計數資料采用2檢驗。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA MNX1-AS1、miR-744-5p、SH3BGRL3在喉癌組織中表達水平及細胞轉染效率 與sh NC 組相比，MNX1-AS1組MNX1-AS1mRNA水平降低（P＜0.05）；與NC mimics 組相比，miR-744-5pmimics 組miR-744-5p mRNA 水平升高（P ＜0.05）；與NC inhibitor 組相比，miR-744-5p inhibitor 組miR-744-5p mRNA 水平降低（P ＜0.05）；與shNC組相比，shSH3BGRL3 組SH3BGRL3 mRNA 水平降低（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 LncRNA MNX1-AS1、miR-744-5p、SH3BGRL3 在喉癌細胞中表達水平

2.2 敲低MNX1-AS1 表達對喉癌細胞生長的影響 細胞培養至48 h 后，sh-NC 組細胞吸光值明顯高于sh MNX1-AS1 組（P ＜0.05）。見表2。

表2 敲低MNX1-AS1 表達對細胞生長的影響（=3）

表2 敲低MNX1-AS1 表達對細胞生長的影響（=3）

2.3 miR-744-5p 過表達對細胞生長的影響 細胞培養至48 h 后，NC mimics組細胞吸光值明顯高于 miR-744-5p mimics 組（P ＜0.05）。見表3。

表3 過表達miR-744-5p 對細胞生長的影響（=3）

表3 過表達miR-744-5p 對細胞生長的影響（=3）

2.4 敲低MNX1-AS1 表達對喉癌細胞遷移能力的影響 與sh NC 組相比，sh MNX1-AS1 組細胞遷移數量明顯減少（P ＜0.05）。見封二彩圖7。

2.5 miR-744-5p 過表達對喉癌細胞遷移能力影響 與NC mimics 組相比，miR-744-5p mimics 組細胞遷移數量明顯減少（P ＜0.05）。見封二彩圖8。

圖8 過表達miR-744-5p 對喉癌細胞遷移能力的影響

2.6 LncRNA MNX1-AS1與miR-744-5p靶向調節關系 生物信息學顯示miR-744-5p 具有LncRNA MNX1-AS1潛在結合序列。與NC mimic 和MNX1-AS1 WT 共轉染組相比，miR-744-5p mimic 和MNX1-AS1 WT 共轉染組細胞熒光素酶活性降低（P ＜0.05）。同時，MNX1-AS1Mut轉染細胞的熒光素酶活性無變化（P ＞0.05）。sh-MNX1-AS1 組細胞中miR-744-5p 的表達比sh-NC 細胞中表達增加（P ＜0.05）。與NCmimics 組相比，miR-744-5p mimics 組中SH3BGRL3 蛋白表達水平明顯降低（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 LncRNA MNX1-AS1 與miR-744-5p 靶向調節關系

2.7 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3軸對喉癌細胞生長的影響 細胞培養至72h后，與NCinhibitor組相比，miR-744-5p inhibitor 組細胞吸光度高于miR-744-5p inhibitor 組（P ＜0.05）；miR-744-5p inhibitor+sh SH3BGRL3 組吸光度低于miR-744-5p inhibitor 組，但高于NC inhibitor 組（P ＜0.05）。見表4。

表4 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3 軸在喉癌細胞中的作用（=3）

表4 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3 軸在喉癌細胞中的作用（=3）

2.8 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3軸對喉癌細胞遷移的影響 與NC inhibitor組相比，miR-744-5p inhibitor組遷移細胞數量增加（P ＜0.05）；miR-744-5p inhibitor+shSH3BGRL3組遷移細胞數量少于miR-744-5pinhibitor 組，多于NC inhibi tor 組（P ＜0.05）。見封三彩圖1。

圖1 MNX1-AS1/miR-744-5p/SH3BGRL3 軸對喉癌細胞遷移的影響（＊＜0.05，＃＜0.05）

3 討論

喉癌是臨床常見的頭頸部腫瘤，臨床主張采用手術和保守治療方案治療喉癌患者[9]。在過去的幾十年里，隨著環境污染的加重、人口老齡化的趨勢，喉癌的發病及死亡狀況不容樂觀[10]。因此，尋找特異、有效的喉癌腫瘤標志物已成為喉癌研究的熱點之一。近年來，越來越多的研究表明，lncRNA異常表達在腫瘤的研究中取得了較大進展，其具有成為診斷和治療腫瘤的標志物的潛質[11-12]。

本研究結果表明細胞轉染成功且穩定。MNX1-AS1 是運動神經元和胰腺同源框蛋白1 及基因的反義RNA，已被多項研究證明是多種人類惡性腫瘤的致癌基因[13]。例如過表達MNX1-AS1 促進體外肝內膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲[14]。有研究表明，MNX1-AS1 在宮頸癌和肺癌組織以及細胞系中均明顯表達上調[15-16]，這與本研究結果基本一致。此外，本研究通過一系列體外細胞功能試驗結果發現，敲低MNX1-AS1 表達抑制喉癌細胞生長和遷移能力。LncRNA 可以通過表觀遺傳水平、轉錄及轉錄后水平調控基因表達，是近年來研究非編碼RNA 的熱點，特定lncRNA 表達的改變與喉癌的發生發展密切相關[17-18]。既往研究顯示，敲低MNX1-AS1 表達抑制卵巢癌細胞增殖和遷移[19]，與本研究結果相似，說明MNX1-AS1 在喉癌中發揮致癌作用。

此外，lncRNA在位于細胞質中時通常作為與miRNA結合的ceRNA而發揮作用，調節多個靶基因的表達[20]。本研究發現過表達miR-744-5p 可以抑制喉癌細胞增殖和遷移能力。越來越多的研究表明，miRNA在喉癌中表達上調或下調，發揮促癌或者抗癌作用。既往研究顯示，過表達miR-744-5p 可以抑制膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲，而抑制miR-744-5p 則起相反的作用[21]。結合本研究結果表明，miR-744-5p 在喉癌細胞中低表達，并且發揮癌基因作用，過表達miR-744-5p可以阻止喉癌Hep-2 細胞生長和遷移的能力。同時，本研究探索了靶向MNX1-AS1 的miRNA發現miR-744-5p 是具有潛在結合序列的預測miRNA。隨后，本研究通過熒光素酶報告基因測定證實了miR-744-5p 靶標與MNX1-AS1 結合。另外，研究發現敲低MNX1-AS1 表達可以上調miR-744-5p 在Hep-2 細胞中的表達，而過表達miR-744-5p 可以下調SH3BGRL3蛋白在Hep-2 細胞中表達。SH3BGRL3是硫氧還蛋白超基因家族的成員，被稱為腫瘤壞死因子抑制蛋白[22]。本研究結果顯示，與NC inhibitor 組相比，miR-744-5p inhibitor 組細胞吸光度值、遷移細胞數量高于miR-744-5pinhibitor 組；miR-744-5pinhibitor+shSH3BGRL3 組吸光度值、遷移細胞數量低于miR-744-5pinhibitor組，但高于NCinhibitor組。這些研究結果證明MNX1-AS1 敲低的作用可以通過miR-744-5p 的下調來逆轉，而SH3BGRL3的敲低則消除了這種可逆作用。MNX1-AS1 可能通過miR-744-5p/SH3BGRL3 軸促進喉癌的發展過程，MNX1-AS1 可能成為治療喉癌的潛在靶點。