精子線粒體膜電位在宮腔內人工授精的綜合評估作用

戎春浩，周黎明，李燕

宮腔內人工授精（IUI）是通過體外優化處理精子并以非性交的方式注入女性宮腔，使精卵自然結合，從而達到受孕的目的，其與其他的輔助生殖技術（ART）相比，是一種成本更低且侵入性傷害更小的治療不孕不育的方法[1]。但IUI 的成功率卻不如其他ART 助孕方式高，總體成功率約15%[2-3]，其中男性精子質量問題是重要因素。精子的授精能力取決于精子的質量和內在功能，目前臨床上還是以傳統的精液參數作為ART治療前的男性精子質量評估指標，如射精量、精子濃度、精子總數、精子總活動率、精子前向運動率、精子不活動率、精子DNA 碎片指數及精子正常形態率等。有研究表明，精子質量與IUI成功率之間存在著相關性，較高的精子正常形態率及活動率是IUI 成功的關鍵因素[4]。但在ART 治療中，由于男性精子功能缺陷，有5%～10%的治療周期會發生授精失敗[5]。

有研究發現，精子線粒體能量的儲存與細胞膜上的質子濃度和電位差有關[6]，因此可以通過對精子線粒體膜電位（MMP）的分析，評估精子能量水平和受精能力。精子MMP 完整性不僅反映精子線粒體的能量狀態，還與精子活動能力密切相關，其是反應精子功能的一個重要指標，近幾年越來越受到關注。本研究以每一進入IUI周期的臨床妊娠率作為最終評估指標，探討MMP對IUI妊娠結局的預測價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020 年6 月至2021 年8 月在寧波市婦女兒童醫院生殖中心行IUI治療的不孕不育夫婦的臨床資料。納入標準：（1）女方年齡＜40歲；（2）男方年齡＜45 歲；（3）無卵巢功能減退；（4）女方基礎卵泡刺激素水平正常（＜11 IU/L）；（5）女方輸卵管通暢及無排卵障礙、子宮內膜異位癥；（6）女方排除盆腔炎癥和生殖內分泌異常等潛在的不孕因素；（7）夫妻雙方均無染色體異常、性病等。根據男方精子MMP 的檢測結果，將研究對象分為低MMP 組（≤52%）和高MMP 組（＞52%）。本研究所有對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 精液常規分析 男方禁欲2～7d后，通過手淫法采集精液樣本于無菌容器內，根據《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5 版[7]標準方法進行分析，測定一次射精量，用計算機輔助精子分析儀（北京穗加SSA-II）檢測精子精子濃度、總數、總活動率、前向運動率及不活動率等。

1.2.2 精子形態分析 采用改良巴氏染色法（華康公司，深圳）對樣本進行涂片、染色，按照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5 版形態學判讀標準計數。油鏡下至少計數200 條精子，讀取2 張玻片，正常形態率=（正常形態精子數/精子總數）×100%。

1.2.3 精子染色質結構分析試驗 應用精子核完整性染色試劑盒（星博公司，浙江），嚴格按產品說明書操作，對精子進行吖啶橙染色，其中天然雙鏈DNA呈綠色熒光，單鏈DNA 呈紅色熒光，熒光信號通過流式細胞儀（BD-Calibur）進行分析，計算得出精子DNA 碎片指數。

1.2.4 精子MMP 檢測 參照精子中段線粒體染色試劑盒說明書（星博公司，浙江），用PBS 調整精子濃度1×106/ml，采用熒光染料JC-1 進行染色，熒光信號通過流式細胞儀（BD-Calibur）進行檢測，計算得出精子MMP 值。

1.2.5 IUI 助孕方案及臨床妊娠率統計女方患者通過克羅米芬（CC）或促性腺激素（HMG）促排卵，B超、血尿LH峰值等方法綜合評估監測卵泡生長發育，在平均卵泡直徑＞16 mm時，肌注HCG 1 000 U，36 h 后行IUI。受精方法：女方截石位，清洗會陰、消毒，采用雙腔導管將上游精子懸液緩慢注入宮腔，授精量為0.5～2ml，術后保持仰臥位15～20min。術后14d測血清-hCG含量，若≥25IU/L，且4周后陰道超聲檢查觀察到宮內孕囊和胎心搏動，則確定為臨床妊娠。在臨床妊娠12 周內發生妊娠丟失則為早期流產。

1.3 統計方法 采用SPSS 23.0 統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，采用方差分析或t 檢驗；計數資料采用2檢驗；相關性分析采用Spearman分析。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基本資料比較 本研究共納入329 個IUI助孕周期，其中低MMP組共205 個周期，高MMP 組共124 個周期。兩組女方年齡、BMI 指數、AMH、男方年齡及禁欲天數差異均無統計學意義（均P ＞0.05）。見表1。

表1 兩組基本資料比較

2.2 兩組精液參數及臨床妊娠結局比較 高MMP 組的精子濃度、精子總數、精子總活動率、精子前向運動率及正常精子形態率均高于低MMP組（均P＜0.05）。低MMP 組的精子不活動率和精子DNA碎片指數均高于高MMP組（均P＜0.01）。兩組射精量差異無統計學意義（P ＞0.05）。高MMP 組的IUI 臨床妊娠率高于低MMP 組（P ＜0.01）。見表2。

表2 兩組精液參數及臨床妊娠結局比較

2.3 MMP與傳統精液參數的相關性分析 MMP 與精子濃度、精子總數、精子總活動率、精子前向運動率及正常精子形態率均呈正相關（均P＜0.01）；MMP與精子不活動率及精子DNA 碎片率呈負相關（均P＜0.01）；MMP與一次射精量無關（P ＞0.05）。見表3。

表3 MMP 與傳統精液參數的相關性分析

3 討論

本研究結果顯示高MMP 組IUI 臨床妊娠率高于低MMP 組。高MMP 組和低MMP 組的精子濃度、精子總數、精子總活動率、精子前向運動率、精子不活動率、正常精子形態率和精子DNA碎片指數差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。精子MMP 與精子濃度、精子總數、精子總活動率、精子前向運動率、正常精子形態率呈正相關，與精子不活動率、精子DNA 碎片指數呈負相關。這表明精子MMP 水平與精子數量減少、精子運動能力下降、精子畸形率增加、DNA 碎片指數上升及IUI 臨床妊娠率降低有關，其是重要的精子功能評估指標。精子MMP 水平檢測聯合傳統精液參數有助于綜合評估男性不育。

IUI 助孕方式一直是治療男性因素引起不孕的主要方法之一，相比體外受精（IVF）和卵胞漿內單精子注射技術（ICSI），其操作簡單、費用少及侵襲性更弱，但是妊娠成功率只有15%～20%[8]。實驗室精液常規參數分析一直是評估男性生育力的常規檢查，也是作為男性不育患者是否適合做IUI 的判斷依據。但是近幾年來，越來越多的學者提出僅僅通過傳統精液基本參數來評估男方的生育力水平是不夠的，David 等[9]研究發現僅僅通過傳統的精液參數對宮腔內人工授精結局的預測無法達到預期效果，精子內在的功能缺陷也會對生育力產生影響。

精子從睪丸生成到附睪里成熟需要經過一系列動態變化，發育過程中其他細胞器和細胞質會逐漸消失。線粒體從最初的大約103 個線粒體減少到80 個[10]。當精卵結合發生時，精子線粒體會通過自噬途徑被完全降解清除[11]。精子線粒體參與氧化磷酸化并合成ATP，為精子運動提供主要的能量來源；維持鈣離子穩態；參與類固醇激素的生物合成；發生氧化應激反應，產生ROS；通過“固有”凋亡途徑調控精子凋亡，維持男性生育力；維持精子頂體酶活性、頂體反應和染色質完整性，直接影響精子的受精能力[12]。

MMP是指在精子能量代謝過程中，電子經呼吸鏈傳遞產生ATP，同時復合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ將質子從線粒體內膜基質側泵至內膜外所形成的跨膜電位差。在正常的精子線粒體中，跨膜電位差反映了電子傳輸和氧化磷酸化的過程，該過程驅動線粒體ATP 的產生。因此，MMP是反映精子線粒體功能的完整性。而線粒體最顯著的功能就是以ATP 形式產生化學能，精子利用這些能量從而維持活動能力，這是男性生育能力的主要決定因素之一。Gallon 等[13]發現MMP 低的精子，精卵結合發生頂體反應的能力較差，使精子不易通過卵丘透明帶，繼而發生受精障礙。MMP 反映了精子線粒體的功能完整性和能量狀態，如果MMP降低就會直接影響精子的質量和功能，從而導致男性不育的發生[14]。而另一項研究表明，精子線粒體膜電位的改變，可以預測精子的授精能力，精子線粒體膜電位越高，精子的授精能力越強[15]。本研究數據也證實了這一點，精子MMP越高精子活動能力越強。Marchetti 等[16]以傳統實驗室精液參數精子活動率和精子MMP 水平為依據，對91 例ART 助孕周期的分析以及受精成功組和失敗組的比較，發現精子MMP檢測更優于傳統精子活動力檢測對受精結局的預測。也有學者提出精子MMP和精子DNA碎片指數聯合預測女性配偶自然受孕的能力優于精液傳統參數[17]，是臨床評估特發性男性不育的重要指標[18]。所以，對于行IUI助孕方式的男性不育患者來說，精子MMP檢查是十分有意義的，可以提前評估出低授精能力的精液樣本，做到IUI風險預估，必要時可以改變ART助孕方式來確保良好的結局。