miR-146a-5p、miR-23a-3p 與阿爾茨海默病及認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性

馬玉柱，鄒文靜

阿爾茨海默病（AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)和退變性疾病，以認(rèn)知功能障礙為主要臨床特征，認(rèn)知功能的缺損往往會(huì)涉及記憶、學(xué)習(xí)、執(zhí)行等多個(gè)認(rèn)知域。微小核糖核酸（miRNA）在神經(jīng)細(xì)胞分化、凋亡、增殖等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮了廣泛而重要的作用。miRNAs 參與可塑性的調(diào)節(jié)，并與記憶和學(xué)習(xí)有關(guān)，作為AD認(rèn)知功能的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子具有巨大潛力[1]。研究推測(cè)海馬中特異性miRNA 表達(dá)可作為一種中介機(jī)制參與突觸功能的損害過(guò)程，使腦代謝和腦電生理活動(dòng)發(fā)生改變，引發(fā)認(rèn)知功能障礙[2]。miR-146a 是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，在固有免疫和神經(jīng)免疫中均發(fā)揮著重要作用，可參與AD 疾病的神經(jīng)炎癥過(guò)程[3]。有研究認(rèn)為miR-23a 表達(dá)與炎癥反應(yīng)的作用有密切聯(lián)系，但對(duì)于miR-23a 是否參與了AD 的炎癥機(jī)制尚無(wú)報(bào)告[4]。本研究分析miR-146a-5p、miR-23a-3p 與AD 認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性及對(duì)神經(jīng)炎癥的影響，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院2019 年1 月至2021年1 月收治的輕度認(rèn)知障礙（MCI）與AD患者各50 例，設(shè)為MCI組和AD組。MCI組男31 例，女19 例；年齡64～82歲，平均（73.3± 9.8）歲；文化水平：小學(xué)15 例，初高中及中專26 例，大專及本科9 例。AD 組男28 例，女22 例；年齡60～81 歲，平均（71.9±9.3）歲；文化水平：小學(xué)16 例，初高中及中專26 例，大專及本科8 例。另納入同期到本院體檢的健康老年人群50 例設(shè)為對(duì)照組，其中男29例，女21 例；年齡63～80 歲，平均（71.6±9.3）歲；文化水平：小學(xué)17 例，初高中及中專25 例，大專及本科8 例。3 組性別、年齡、文化水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞60歲；臨床資料完整，能夠配合完成各項(xiàng)檢查；未曾服用影響認(rèn)知功能或激素類藥物；無(wú)內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病史；家屬簽署研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在既往精神疾病史，如抑郁癥、精神分裂癥等；具有顱腦損傷史；合并高血壓、糖尿病等慢性全身疾病史。

1.3 miR-146a-5p、miR-23a-3p 檢測(cè)抽取受試者入院后靜脈血3～4 ml，于4 ℃下12 000 r/min 離心5 min，吸取上清液分裝至EP 管中，－80℃凍存。取出凍存樣本室溫下自然解凍，取200l血漿樣本至另一個(gè)新EP 管中，加入900l裂解液MZA震蕩混勻30 s，室溫下放置5 min。加入200l 氯仿震蕩15s，室溫下放置5 min。EP 管于4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液置于新EP 管中，加入2 倍乙醇混勻，棄上清，室溫下靜置2 min，12 000 r/min 離心30 s，加入500l乙醇的蛋白液MRD，室溫下靜置2 min，12 000 r/min 離心30 s，棄上清，在加入500l乙醇的漂洗液RW，室溫下靜置2min，12 000 r/min 離心30 s，棄上清。處理后室溫下12 000 r/min 離心2 min，棄上清，通風(fēng)揮發(fā)乙醇。用新的離心管滴入30l RNase-Free ddH2O，室溫靜置2 min，12 000 r/min 離心2 min，獲得洗脫緩沖液。獲取洗脫緩沖液后重復(fù)上一步驟獲取緩沖液RNA。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)NanoDrop 2000 測(cè)定RNA 純度。混勻后取適量管壁液體置于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）管中，加入反應(yīng)液（2×miRNA RT Reaction Buffer 10l、Total RNA 8l、miRNA RT Enzyme Mix 2l）混勻，1 500 r/min 離心。應(yīng)用ABI 的TaqMan Micro-RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。反應(yīng)維度及時(shí)間為42 ℃60 min，95 ℃3 min。在PCR 板置于冰上進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)液配制：2×miRcute Plus miRNA 10l、ddH2O 5.2l、50×ROX Reference Dye 2l、miRNA 第 一 鏈cDNA 2l、Reverse Primer（10mol/L）0.4l、Forward Primer 0.4l。應(yīng)用ABI公司的Step one plus PCR System 熒光定量?jī)x器進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃15 min 1 個(gè)循環(huán)；94 ℃20 s、64 ℃30 s、72 ℃34 s 5 個(gè)循環(huán)；94 ℃20 s、60 ℃34 s 45 個(gè)循環(huán)。完成后進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)采集。表達(dá)量計(jì)算：F=2－△△Ct。miR-146a-5p 引物 序 列 5’-TGCGCTGAGAACTGAATTCCAT-3’；miR-23a-3p 引物序列5’-CCTACATCGCACCGGAGTCTG-3’；以U6 為內(nèi)參，引物序列：5’-GGGCAGGAAGAGGGCCTAT-3’[5-6]。引物購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 觀察指標(biāo)（1）認(rèn)知功能：采用簡(jiǎn)易精神狀態(tài)評(píng)價(jià)量表（MMSE）[7]和改良版蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（MoCA）[8]評(píng)估受試者認(rèn)知功能。MMSE 量表包含5個(gè)部分，滿分30 分，≥25 分為認(rèn)知正常，21～24 分為輕度認(rèn)知障礙，18～20 分為中度認(rèn)知障礙，≤17 分為重度認(rèn)知障礙。MoCA 量表包含命名能力、注意力與計(jì)算力、語(yǔ)言功能、定向力、抽象思維能力、延遲回憶、空間功能與執(zhí)行能力。滿分30 分，受教育年限＜12 年另+1 分，＜26 分即定義為認(rèn)知功能損害，分?jǐn)?shù)越低，認(rèn)知功能損害越嚴(yán)重。（2）炎癥因子：抽取受試者入院后靜脈血3～4 ml，3 000 r/min 離心處理5 min，分離血清于試管中，－20℃凍存待檢。采用ELISA法檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-）水平。（3）miR-146a-5p、miR-23a-3p 表達(dá)。（4）分析MMSE、MoCA 評(píng)分與miR-146a-5p、miR-23a-3p 表達(dá)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，采用2檢驗(yàn)。相關(guān)性采用雙變量Pearson直線相關(guān)分析。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 認(rèn)知功能 3 組MMSE評(píng)分、MoCA評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中AD 組＜MCI 組＜對(duì)照組（均P ＜0.05），3 組miR-146a-5p 和miR-23a-3p表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05），miR-146a-5p 表達(dá)量：AD 組＜MCI 組＜對(duì)照組，miR-23a-3p 表達(dá)量：AD組＞MCI組＞對(duì)照組（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3 組認(rèn)知功能、miR-146a-5p、miR-23a-3p 比較

表2 3 組炎癥因子水平比較

2.3 MMSE、MoCA 評(píng)分與miR-146a-5p、miR-23a-3p 相關(guān)性 MMSE、MoCA評(píng)分與miR-146a-5p表達(dá)量呈正相關(guān)（r=6.258、6.640，均P＜0.05），與miR-23a-3p表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r=－6.027、－5.874，均P ＜0.05）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞活化與神經(jīng)炎性反應(yīng)在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[9]。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)處于靜息狀態(tài)，在受到刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，可產(chǎn)生IL-1、IL-6、TNF-等一系列的炎癥因子，引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。郭敏等[10]研究指出腦內(nèi)促炎因子增多時(shí)，可通過(guò)激活不同細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)、干擾突觸可塑性等機(jī)制參與認(rèn)知功能損害。亢濤[11]研究指出AD 患者體內(nèi)存在大量的炎癥因子表達(dá)。本研究顯示，AD組CRP、IL-1、IL-6、TNF-水平高于MCI 組和對(duì)照組，這說(shuō)明炎癥反應(yīng)參與了AD 的發(fā)生發(fā)展。

miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)，具有特異性、區(qū)域性、時(shí)效性等特點(diǎn)，對(duì)神經(jīng)元分化、腦組織的發(fā)育及高級(jí)神經(jīng)功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[12]。本研究顯示，AD 組miR-146a-5p 表達(dá)量低于MCI 組和對(duì)照組，miR-23a-3p 表達(dá)量高于MCI組和對(duì)照組，這說(shuō)明 miR-146a-5p、miR-23a-3p 可能參與了AD患者的認(rèn)知損害機(jī)制。經(jīng)相關(guān)性分析顯示，MMSE、MoCA 評(píng)分與miR-146a-5p 表達(dá)量呈正相關(guān)，與miR-23a-3p 表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步明確以上兩種基因參與認(rèn)知功能損害的可能。

在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，miR-146a 被認(rèn)為是重要的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)因子，炎癥因子作為免疫細(xì)胞之間的化學(xué)信使，能夠通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌激素代謝和修飾神經(jīng)遞質(zhì)，從而影響神經(jīng)發(fā)育和行為變化。陳芳榮等[13]研究指出，miR-146a-5p可通過(guò)對(duì)TRAF6 基因表達(dá)的抑制作用抑制炎癥反應(yīng)。研究認(rèn)為miR-146a-5p 作為一種調(diào)節(jié)細(xì)胞因子受體信號(hào)通路和Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)級(jí)聯(lián)信號(hào)的放大作用抑制炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)免疫及抑制炎癥反應(yīng)。此外，在炎癥反應(yīng)中，miR-23a的表達(dá)下調(diào)，可通過(guò)上調(diào)其靶基因從而抑制NF-xB 的過(guò)度活化，防止IL-1、IL-6、TNF-等促炎因子的過(guò)度表達(dá)進(jìn)一步對(duì)神經(jīng)造成損害。趙永杰[14]研究指出，miR-23a可能通過(guò)靶向NF-kB信號(hào)通路抑制基因發(fā)揮作用。這也是從miRNA的角度更明確地解釋了機(jī)體在免疫應(yīng)答中存在一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制[15]。由此可知，膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)密切關(guān)聯(lián)，因此研究分析miR-23a-3p 與NFkB 信號(hào)通路發(fā)揮炎癥反應(yīng)可影響中樞神經(jīng)中膠質(zhì)細(xì)胞的增生及突觸重建，從而損害AD 患者的認(rèn)知功能。