西瓜新炭疽病菌的鑒定、生物學(xué)特性及藥劑敏感性研究

靳俊媛，王友賢，劉 倩，孫 蕾，白慶榮，趙廷昌

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 長(zhǎng)春 130118； 2.吉林省蛟河市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì) 吉林蛟河 132500；3.黑水鎮(zhèn)綜合服務(wù)中心（農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站） 吉林洮南 137101； 4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 北京 100096）

西瓜（L.）是一年生蔓生草本植物，其果肉味甜，能降溫去暑；種子含油，可作消遣食品；果皮藥用，有清熱、利尿、降血壓之效，在我國(guó)各地均有栽培。吉林省中西部地區(qū)常年種植西瓜，種植面積約4002 hm，西瓜產(chǎn)業(yè)不僅是吉林省農(nóng)村脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)之一，也在2018 年被列為吉林省鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略規(guī)劃中的優(yōu)勢(shì)特色產(chǎn)業(yè)之一。在生長(zhǎng)過(guò)程中，西瓜會(huì)遭受到多種病原菌的危害。其中，炭疽病是西瓜生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一，且有逐年加重的趨勢(shì)，該病害會(huì)造成植株提早枯死，西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，使瓜農(nóng)蒙受嚴(yán)重的損失。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為西瓜炭疽病多由引起，2018 年黃蔚等從湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技園種植的感染炭疽病的西瓜病葉上分離出膠孢炭疽菌。2018—2021 年，筆者對(duì)吉林省西瓜主產(chǎn)區(qū)疑似感染西瓜炭疽病的病株進(jìn)行采集，在分離和鑒定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一些與菌落形態(tài)不同的分離物，且在采集的樣品中占有一定的比例。筆者進(jìn)一步對(duì)所獲得的分離物進(jìn)行了致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)特征觀察及系統(tǒng)發(fā)育分析，確認(rèn)該病原菌為菜豆炭疽菌，并對(duì)該病原菌的生物學(xué)特性及藥劑敏感性進(jìn)行了相關(guān)研究。該研究為防控引起的西瓜炭疽病提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害標(biāo)本的采集與癥狀觀察

2018 年7 月至2021 年9 月對(duì)吉林省及周邊西瓜主產(chǎn)區(qū)（乾安縣、長(zhǎng)嶺縣、雙遼市、內(nèi)蒙古科爾沁左翼中旗）西瓜炭疽病的病樣進(jìn)行采集，調(diào)查并拍照記錄病害的危害情況，部分樣品用于病原菌的分離，其余部分樣品制作臘葉標(biāo)本保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理教研室。

1.2 病原菌的分離與純化

用無(wú)菌剪刀剪取樣品病健交界處4 mm×4 mm組織塊若干，置于75%乙醇溶液中浸泡消毒1 min后，用無(wú)菌水浸泡30 s，3 次重復(fù)。風(fēng)干2.5 h 后，將組織塊放置于PDA 培養(yǎng)基上，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。用無(wú)菌接種鏟在菌落邊緣鏟起4 mm×4 mm 菌塊，繼續(xù)培養(yǎng)。純化后取菌絲塊置于預(yù)先做好的PDA 斜面培養(yǎng)基上，放置在4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌致病性測(cè)定

選擇純化后代表菌株Y 6-1，在PDA 上培養(yǎng)20 d 后，使用無(wú)菌水制作1×10個(gè)·mL的孢子懸浮液。在溫室內(nèi)采用常規(guī)噴霧法將孢子懸浮液接種到10 株健康的西瓜（蜜紅198，黑龍江全福種苗有限公司）幼苗上，對(duì)照植株噴無(wú)菌水。塑料袋保濕3 d，每天觀察記錄植株發(fā)病情況。采集發(fā)病部位進(jìn)行病原菌分離，若分離到與原始接種物相同的分離物，則證明分離物是致病病原菌。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 采用CTAB 法從新鮮菌絲中提取基因組總DNA。以提取出的總DNA 為模板，進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系（25.0 μL 體系）：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL；酶0.5 μL，DNA 模板1.0 μL，ddHO 17.0 μL。選擇引物ITS1/ITS4、ACT-512F/ACT-783R、CHS-354R/CHS-79F 和GDF1/GDR1 分別對(duì)核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、肌動(dòng)蛋白基因（，）、幾丁質(zhì)合成酶A 基因（，）和3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（，）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所有產(chǎn)物通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，隨后委托上海生工公司完成測(cè)序。

將所得的序列上傳至GenBank，并與Gen-Bank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較。通過(guò)PAUP*（Phlogenetic Analsis Using Parsimon）v. 4.0b10（Swofford 2003）軟件中的最大簡(jiǎn)約法（Maximum Parsimony，MP）構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)其分類地位進(jìn)行確認(rèn)。

1.5 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.5.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 10種培養(yǎng)基的制備方法如下：燕麥瓊脂培養(yǎng)基（Oatmeal Agar，OA）：燕麥片20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL；西瓜果皮煎汁瓊脂培養(yǎng)基（Watermelon peel Decoction Agar，WDA）：西瓜皮100 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL；水瓊脂培養(yǎng)基（Water Agar，WA）：瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL；番茄燕麥瓊脂培養(yǎng)基（Tomato Oat Agar，TOA）：番茄200 g，燕麥片30 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL；胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（Carrot Agar，CA）：胡蘿卜100 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL；西瓜果肉煎汁瓊脂培養(yǎng)基（Watermelon pulp Decoction Agar，WPA）：西瓜果肉200 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL；馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Sucrose Agar，PSA）：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL；玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（Cornmeal Agar，CMA）：玉米粉40 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL；馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（Potato Carrot Agar，PCA）馬鈴薯20 g，胡蘿卜20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL。

選用10 種不同的固體培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿中注入15 mL 培養(yǎng)基，將直徑為6 mm 的菌餅放置在培養(yǎng)基的中央，2 次重復(fù)，置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。7 d 后采用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑，20 d 后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定產(chǎn)孢量，使用Excel 2016 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，IBM SPSS Statistics 22 軟件進(jìn)行單因素方差分析比較差異顯著性。

1.5.2 不同pH 值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 以PDA 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用HCl（1 mol·L）和NaOH（1 mol·L）將PDA 的pH 值調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 和11.0。病 原 菌 培 養(yǎng) 方 法 同1.5.1。

1.5.3 不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等量的L-丙氨酸、L-賴氨酸、蛋白胨、甘氨酸、磷酸二氫銨、L-胱氨酸、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素替換硝酸鈉。后續(xù)試驗(yàn)操作同1.5.1。

對(duì)原始放電聲庫(kù)進(jìn)行預(yù)處理,使得數(shù)據(jù)庫(kù)由3種狀態(tài)(電暈狀態(tài)、擊穿狀態(tài)和正常狀態(tài))聲音組成,每組150個(gè)樣本,共450個(gè)樣本。所有樣本均進(jìn)行了標(biāo)注和裁剪,以適合算法使用。其中,每組抽出30個(gè)用于測(cè)試,余下120個(gè)用于訓(xùn)練。故訓(xùn)練樣本共360個(gè),測(cè)試樣本共90個(gè)。每個(gè)樣本長(zhǎng)度為3 s等長(zhǎng)。為充分利用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),這里采用K交叉驗(yàn)證方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證,K值取5,即數(shù)據(jù)庫(kù)被分成5份,每一份的數(shù)據(jù)容量為90個(gè)。

1.5.4 不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用等量的葡萄糖、可溶性淀粉、D-麥芽糖、D-果糖、木糖醇、木糖、山梨醇、D-甘露醇、乳糖代替蔗糖。后續(xù)試驗(yàn)操作同1.5.1。

1.5.5 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 將培養(yǎng)溫度設(shè)為4、10、15、20、25、30、35 ℃，后續(xù)試驗(yàn)操作同1.5.1。

1.5.6 不同光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 將光照條件設(shè)為全光照、12 h 光照/12 h 黑暗、全黑暗條件下培養(yǎng)，后續(xù)試驗(yàn)操作同1.5.1。

1.6 病原菌藥劑敏感性測(cè)定

供試菌株：西瓜炭疽病病原菌的代表菌株Y 6-1。供試藥劑：50%多菌靈可濕性粉劑（江蘇藍(lán)豐生物股份有限公司），25%嘧菌酯懸浮劑（山東青島海利爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司），22.5%啶氧菌酯懸浮劑（美國(guó)杜邦公司），75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑、35%氟菌·戊唑醇懸浮劑[拜耳作物科學(xué)（中國(guó)）有限公司]，250 g·L苯醚甲環(huán)唑乳油、560 g·L嘧菌·百菌清懸浮劑、350 g·L苯甲·嘧菌酯懸浮劑（瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司），75%百菌清可濕性粉劑（先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司），60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑（杭州宇龍化工有限公司），12%氟菌·氟環(huán)唑乳油、42.4%唑醚·氟酰胺懸浮劑[巴斯夫植物保護(hù)（江蘇）有限公司]，500 g·L異菌脲懸浮劑（蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司），500 g·L甲基硫菌靈懸浮劑、40%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽可濕性粉劑（江蘇龍燈化學(xué)有限公司），80%克菌丹水分散粒劑（安道麥馬克西姆有限公司），40%嘧菌·戊唑醇懸浮劑（江門植保有限公司），25%吡唑醚菌酯懸浮劑（石家莊市深泰化工有限公司）。

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定菌絲對(duì)不同藥劑的敏感性。將每個(gè)藥劑制成含藥1×10、1×10、1、1×10、1×10、1×10mg·L的PDA 平板，3 次重復(fù)，每次重復(fù)1 個(gè)平板，對(duì)照組用等量無(wú)菌水。取直徑6 mm 的菌餅，放置于含藥平板上，25 ℃黑暗培養(yǎng)。當(dāng)對(duì)照組菌落直徑長(zhǎng)至40～50 mm 時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并記錄。

菌絲生長(zhǎng)抑制率/%=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對(duì)照組菌落直徑-菌餅原始直徑）×100。

孢子萌發(fā)法測(cè)定孢子對(duì)不同藥劑的敏感性。含藥平板制作方法同上，但用OA 代替PDA，制作含1×10個(gè)·mL的孢子懸浮液，取100 μL 用涂布器均勻涂布在OA 平面上，平板于25 ℃黑暗培養(yǎng)，以對(duì)照組萌發(fā)90%左右作為標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)處理觀察300 個(gè)孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)抑制率（%）=（對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100。

利用VBA 程序建立藥劑濃度的對(duì)數(shù)值與菌絲生長(zhǎng)抑制率（孢子萌發(fā)抑制率）對(duì)應(yīng)的概率值之間的回歸方程ab，求算有效抑制中濃度（EC）值。比較病原菌對(duì)各種藥劑的敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

被侵染的西瓜葉片初期出現(xiàn)近圓形水漬狀凹陷的黃褐色病斑，中心為黑色，后期病斑擴(kuò)大變?yōu)楹稚梁谏?，中部有白色壞死區(qū)域，嚴(yán)重時(shí)病斑中間開(kāi)裂。瓜蔓初期發(fā)病癥狀與葉片上的發(fā)病癥狀一致，后期變成長(zhǎng)條形的深紫色或黑色的病斑（圖1）。

圖1 西瓜炭疽病自然發(fā)病癥狀

2.2 病原菌的分離與純化

從吉林省西瓜主產(chǎn)區(qū)采集的西瓜炭疽病病株上分離純化得到菌株52 株菌落形態(tài)基本一致的分離物，具體分離地點(diǎn)及數(shù)量見(jiàn)表1。

表1 病害樣品采集時(shí)間與地點(diǎn)

2.3 分離物致病性測(cè)定

從圖2 可以看出，接種7 d 后，接種的西瓜葉的發(fā)病癥狀與田間一致，且對(duì)照植株不發(fā)病，因此可以確定該分離物具有致病性。

圖2 菌株Y 6-1 致病性測(cè)定

2.4 病原菌的鑒定

2.4.1 病原菌的形態(tài)特征 從圖3 可以看出，Y 6-1菌株生長(zhǎng)初期菌絲為白色或淺灰色，隨著菌絲增多，逐漸覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿，后期氣生菌絲變少，菌落整體轉(zhuǎn)變?yōu)楹诨疑饩壘z為白灰色，菌落表面及培養(yǎng)基內(nèi)部產(chǎn)生大量黑色顆粒，即分生孢子盤(pán)。Y 6-1 菌株在PDA 上分生孢子產(chǎn)生數(shù)量較少，分生孢子為單胞，無(wú)顏色，長(zhǎng)彎月形，孢子大小為（20.73～24.72）μm×（3.25～3.74）μm，（圖3-D、E）。分生孢子盤(pán)為灰黑色，球形（圖3-F），查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，該病原菌與炭疽菌的形態(tài)特征極為相似。

圖3 Y6-1 菌株的形態(tài)特征

2.4.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)菌株信息如表2所示，以Y 6-1 菌株基因組DNA 為模板，將以ITS1/ITS4、ACT-512F/ACT-783R、CHS-354R/CHS-79F、GDF1/GDR1 為引物擴(kuò)增的基因序列登錄號(hào)分別命名為MN880260、ON189039、ON189040和ON189041?；?、、與多基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明：致病菌Y6-1與歸于一個(gè)分支，且Bootstrap 支持率為100%（如圖4），進(jìn)一步確定致病菌為。

圖4 由Y 6-1 菌株ITS、ACT、CHS-1 和GAPDH 基因串聯(lián)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中使用的菌株信息

2.5 病原菌生物學(xué)特性

2.5.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響由圖5 可以看出，菌株Y 6-1 在10 種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)與產(chǎn)孢。菌絲在PDA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，但與其在PSA 上的生長(zhǎng)速度沒(méi)有顯著差異，在WA 上生長(zhǎng)最慢，顯著小于在其他培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度。病原菌在CMA 上產(chǎn)孢最多，與在PSA 和WPA 上的產(chǎn)孢量無(wú)顯著差異；在PCA 上產(chǎn)孢最少，與在PDA、WDA、WA、OA 和CA 上的產(chǎn)孢量無(wú)顯著差異。菌絲生長(zhǎng)最佳培養(yǎng)基為PDA，產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)基為CMA。

圖5 不同培養(yǎng)基對(duì)C.incanumY 6-1 菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.5.2 不同pH 值對(duì)病原菌生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 由圖6可以看出，菌株Y 6-1 在試驗(yàn)pH 值條件下均能生長(zhǎng)與產(chǎn)孢。菌絲在pH 值為5、8 和10 條件下生長(zhǎng)速度較快，但差異不顯著；菌絲在pH 值為6～10條件下生長(zhǎng)差異不顯著，pH 值為5 時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，pH 值為11 時(shí)菌絲生長(zhǎng)最慢。病原菌在pH 值為5 時(shí)產(chǎn)孢最多，與其他pH 培養(yǎng)基差異顯著，在pH 值為10 和11 時(shí)產(chǎn)孢量顯著降低，在pH 值為6～9 時(shí)產(chǎn)孢量顯著低于其他條件下的產(chǎn)孢量，在pH值為7 時(shí)產(chǎn)孢量最少，菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢最佳pH 值均為5。

圖6 不同pH 值對(duì)C.incanumY 6-1 菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.5.3 不同氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 由圖7 可以看出，Y 6-1 菌株在10 種不同氮源的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。在以甘氨酸、L-丙氨酸、L-胱氨酸為氮源的培養(yǎng)基上，Y 6-1 菌株菌絲生長(zhǎng)無(wú)顯著差異，在甘氨酸培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，在硫酸銨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，且與其他培養(yǎng)基差異顯著。病原菌在以甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多，顯著多于其他培養(yǎng)基，其次為以尿素為氮源的培養(yǎng)基；在磷酸二氫銨、硝酸銨和L-胱氨酸培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，其余培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量均較少，無(wú)顯著差異。因此，菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最佳氮源均為甘氨酸。

圖7 不同氮源對(duì)C.incanum Y 6-1 菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.5.4 不同碳源對(duì)病原菌生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 由圖8 可以看出，在9 種不同碳源的培養(yǎng)基上，Y 6-1菌株均能生長(zhǎng)與產(chǎn)孢。在淀粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度顯著快于其他碳源培養(yǎng)基，其次為麥芽糖培養(yǎng)基，在木糖醇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，且顯著慢于其他培養(yǎng)基。病原菌在麥芽糖培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多，顯著優(yōu)于其他培養(yǎng)基，在甘露醇上產(chǎn)孢最少，與在乳糖、木糖醇和山梨醇培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量無(wú)顯著差異。因此，菌絲生長(zhǎng)最佳碳源為淀粉，產(chǎn)孢最佳碳源為麥芽糖。

圖8 不同碳源對(duì)C.incanum Y 6-1 菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.5.5 不同溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 由圖9 可以看出，不同試驗(yàn)溫度下Y 6-1 菌株均能生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)最佳溫度為30 ℃，與其他溫度下的生長(zhǎng)速度差異顯著，其次為25 ℃，在4 ℃中菌絲生長(zhǎng)最慢，顯著慢于其他培養(yǎng)溫度。Y 6-1 在10 ℃產(chǎn)孢量最佳，與4 ℃、15 ℃和30 ℃相比，無(wú)顯著差異；在25 ℃時(shí)產(chǎn)孢最少，除10 ℃外與其他溫度均無(wú)顯著差異。菌絲生長(zhǎng)最佳溫度為30 ℃，產(chǎn)孢最佳溫度為10 ℃。

圖9 不同溫度對(duì)C.incanum Y 6-1 菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.5.6 不同光照對(duì)病原菌生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 由圖10 可以看出，Y 6-1 菌絲在全光照和半光照條件下生長(zhǎng)最快，兩者相比無(wú)顯著差異，但均顯著快于全黑暗條件下的生長(zhǎng)速度。Y 6-1 的產(chǎn)孢量在不同光照條件下無(wú)顯著差異，在全黑暗條件下產(chǎn)孢量最多。因此，Y 6-1 的菌絲生長(zhǎng)最佳光照條件為全光照或半光照，產(chǎn)孢最佳光照條件為全黑暗。

圖10 不同光照對(duì)C.incanum Y 6-1 菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

2.6 室內(nèi)藥劑敏感性測(cè)定

由表3 數(shù)據(jù)可知：Y 6-1 菌株的菌絲生長(zhǎng)對(duì)50%多菌靈WP、42.4%唑醚·氟酰胺SC、75%肟菌·戊唑醇WG、25%吡唑醚菌酯SC、350 g·L苯甲·嘧菌酯SC、560 g·L嘧菌·百菌清SC 和40%嘧菌·戊唑醇SC 的敏感性較高，EC≤1 mg·L；對(duì)25%嘧菌酯SC、22.5%啶氧菌酯SC、35%氟菌·戊唑醇SC、12%氟菌·氟環(huán)唑EC 和80%克菌丹WG 的敏感性略低，1 mg·L＜EC＜10 mg·L；對(duì)500 g·L甲基硫菌靈SC、40%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽WP 和500 g·L異菌脲SC 的敏感性較差，EC≥10 mg·L。

表3 西瓜炭疽菌Y 6-1 菌絲對(duì)殺菌劑的敏感性

由表4 數(shù)據(jù)可知：Y 6-1 菌株的孢子萌發(fā)對(duì)25%吡唑醚菌酯SC、560 g·L嘧菌·百菌清SC、60%唑醚代森聯(lián)WG、40%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽WP、350 g·L苯甲·嘧菌酯SC、500 g·L甲基硫菌靈SC、500 g·L異菌脲SC、40%嘧菌·戊唑醇SC 和35%氟菌·戊唑醇SC 的敏感性較高，EC≤1 mg·L；對(duì)12%氟菌·氟環(huán)唑EC、250 g·L苯醚甲環(huán)唑EC、22.5%啶氧菌酯SC 和25%嘧菌酯SC 的敏感性略低，1 mg·L＜EC＜10 mg·L；對(duì)75%百菌清WP 和50%多菌靈WP 的敏感性較差，EC≥10 mg·L。

表4 西瓜炭疽菌菌株Y 6-1 孢子萌發(fā)對(duì)殺菌劑的敏感性

綜合Y 6-1 菌株菌絲和孢子萌發(fā)對(duì)藥劑的敏感性測(cè)定結(jié)果可知，在菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)方面，其對(duì)25%吡唑醚菌酯SC、350 g·L苯甲·嘧菌酯SC、40%嘧菌·戊唑醇SC 和560 g·L嘧菌·百菌清SC 的敏感性較高，EC≤1 mg·L；對(duì)12%氟菌·氟環(huán)唑EC、22.5%啶氧菌酯SC、25%嘧菌酯SC 的敏感性略低，1 mg·L＜EC＜10 mg·L；在孢子萌發(fā)上，Y 6-1對(duì)40%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽WP、500 g·L甲基硫菌靈SC 和500 g·L異菌脲SC 的敏感性較高，EC≤1 mg·L，但在菌絲生長(zhǎng)方面對(duì)上述藥劑敏感性較低，EC≥10 mg·L；病原菌菌絲生長(zhǎng) 對(duì) 50% 多 菌 靈WP 敏 感 性 最 高，EC為0.006 5 mg·L，但其孢子萌發(fā)對(duì)多菌靈不敏感，EC為2 540.205 0 mg·L。

3 討 論

Yang 等于2014 年在美國(guó)大豆葉柄和莖稈上發(fā)現(xiàn)并命名，并將其歸為白蠟樹(shù)炭疽菌復(fù)合種（species complex），在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上顯示其與同屬、和的關(guān)系更近。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)菌株Y 6-1 的孢子、菌落和分生孢子盤(pán)等形態(tài)特征與相似，基因序列與在同一分支，與和親緣關(guān)系較近，是首次從西瓜上分離得到。因此，西瓜為的新寄主。本研究在2018 年7 月至2021 年9 月分離得到52 株，占分離的西瓜炭疽菌菌株總數(shù)的10.86%（52/479），說(shuō)明目前未形成優(yōu)勢(shì)種群。但在4 個(gè)縣都有分布，應(yīng)引起重視。本研究Y 6-1 的生物學(xué)特性與徐杉2017年在內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市的紫花苜蓿莖稈上分離得到的的生物學(xué)特性基本相同。

在藥劑敏感性測(cè)定中，筆者發(fā)現(xiàn)50%多菌靈WP 對(duì)Y 6-1 菌絲生長(zhǎng)抑制效果最佳（EC為0.006 5 mg·L），但對(duì)孢子萌發(fā)活性抑制最低（EC為2 540.205 0 mg·L），可以用于病害發(fā)生后的治療；40%雙胍三辛烷基苯磺酸鹽WP、500 g·L甲基硫菌靈SC 和500 g·L異菌脲SC 對(duì)孢子萌發(fā)的效果較好（EC＜1.0 mg·L），但對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制效果較差（EC＞10.0 mg·L），建議這類藥劑在病害發(fā)生之前使用，用于病害的預(yù)防。本研究所得數(shù)據(jù)均為室內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定，藥劑在田間的防治效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

筆者對(duì)分離到的西瓜炭疽病新致病菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征的研究，確定該致病菌為，進(jìn)一步明確了Y 6-1 的生物學(xué)特性：菌絲生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基為PDA，最適pH值為5，最適氮源為甘氨酸，最適碳源為淀粉，最適溫度為30℃，全光照最適菌絲生長(zhǎng)；產(chǎn)孢最適培養(yǎng)基為CMA，最適pH 值為5，最適氮源為甘氨酸，最適碳源為麥芽糖，最適溫度為10 ℃，全黑暗條件下最適產(chǎn)孢。

藥劑敏感性測(cè)定結(jié)果表明：病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)對(duì)25%吡唑醚菌酯SC、350 g·L苯甲·嘧菌酯SC、560 g·L嘧菌·百菌清SC、40%嘧菌·戊唑醇SC 的敏感性均較高；對(duì)25%嘧菌酯SC、22.5%啶氧菌酯SC 和12%氟菌·氟環(huán)唑EC 的敏感性略低。上述藥劑均可作為該病害防治的藥劑，建議多種藥劑輪換使用，以延緩抗藥性的產(chǎn)生。