CCL25和LTBP2在非小細胞肺癌患者血清中的表達及在疾病診斷中的應用價值

葉亞蘭 孟凡亮 仰杰

非小細胞肺癌(NSCLC)確診后5年生存率較低，轉移是NSCLC最常見的死亡風險，而腫瘤細胞的遷移和侵襲可以由趨化因子及其受體調節[1]。其中CCR9及其天然配體CCL25主要參與免疫穩態，CCR9-CCL25軸涉及結腸直腸癌、前列腺癌和乳腺癌，癌組織中較高的CCR25表達與疾病嚴重程度相關[2]。細胞外基質蛋白是腫瘤微環境的重要組成部分，潛在轉化生長因子β結合蛋白-2(LTBP2)是一種可溶于血的多結構域的細胞外基質蛋白。最近報道了多種腫瘤的發生發展與LTBP2表達相關[3]。研究顯示，CCR9/CCL25對NSCLC的預后評估有一定意義[4]。NSCLC患者血清LTBP2呈高表達，可能與非小細胞肺癌的發生發展存在相關性[5]。本研究擬探討CCL25聯合LTBP2在NSCLC患者血清中的表達及在疾病診斷中的應用價值。

資料與方法

一、臨床資料

回顧性分析2018年9月至2021年9月被我院收治的129例NSCLC患者作為觀察組，納入標準：①符合NSCLC診斷標準[6]；②年齡≥18歲；③首次發病、入組前未接受過化學藥物及放射治療。排除標準：①合并急性感染性疾病；②入組前已接受放化療等抗腫瘤治療、既往有腫瘤病史；③臨床資料缺失。其中男性90例，女性39例，年齡46～87歲，平均年齡(67.81±10.04)歲，病理類型：腺癌66例，鱗癌63例，TNM分期：Ⅰ期～Ⅱ期45例，Ⅲ期～Ⅳ期84例；另將同期129例健康體檢者納入對照組，納入標準：①無腫瘤病史；②無重要器官嚴重疾病史；③無其他慢性病史及吸煙酗酒史。其中男性88例，女性41例，年齡52～84歲，平均年齡(71.11±8.46)歲。2組在性別、年齡方面比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準(批號：2019ECPJ114)，所有患者在開始治療之前，均簽署了書面知情同意書。

二、主要試劑與儀器

人CCL25酶聯免疫吸附檢測試劑盒和人LTBP2酶聯免疫吸附檢測試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司，Biofuge Stratos高速冷凍離心機購自美國賽默飛公司，SpectraMax iD3多功能酶標儀購自美國Molecular Devices 公司。

三、檢測方法

分別采集2組晨起空腹外周靜脈血3～4 mL，室溫靜置30 min，離心后分離上層血清， -80℃保存待測。嚴格按照人CCL25和LTBP2酶聯免疫吸附檢測試劑盒說明書進行實驗操作，首先制備從0到20 ng/mL(0，0.312，0.625、1.25、2.5、5、10和20 ng/mL)濃度梯度的標準品，向每個孔中加入100 μL的標準品或待測樣品，37 ℃下孵育2 h，棄去液體后，每孔添加100 μL工作液A，并在37 ℃下再孵育2 h，再次棄去液體后，沖洗3次，然后每孔加入100 μL工作液B，37 ℃孵育30 min，再用350 μL緩沖液洗滌5次后，向每個孔中添加90 μL基質溶液，并在37℃下孵育15～25 min，避光，顯色，然后在405nm處檢測光密度值(OD)，通過標準曲線計算各樣本濃度，所有樣品均設置3個復孔。

四、統計學分析

結 果

一、兩組血清CCL25和LTBP2水平比較

觀察組患者血清CCL25和LTBP2水平均明顯高于對照組(P<0.05)(見表1)。

表1 兩組血清CCL25和LTBP2水平比較

二、血清CCL25和LTBP2水平與NSCLC患者病理特征的關系

不同年齡、性別、病理類型的NSCLC患者血清CCL25和LTBP2水平間無顯著性差異(P>0.05)，但不同TNM分期、分化程度及是否發生淋巴結轉移的NSCLC患者血清CCL25和LTBP2水平間存在顯著性差異(P<0.05)(見表2)。

三、血清CCL25和LTBP2對NSCLC的診斷價值

ROC曲線結果顯示，CCL25和LTBP2聯合診斷NSCLC的曲線下面積為大于單一指標，檢測靈敏度高于單一指標(見表3，圖1)。

表3 CCL25和LTBP2對NSCLC的診斷價值

圖1 NSCLC患者血清CCL25和LTBP2水平的ROC曲線分析(a)CCL25；(b)LTBP2；(c)CCL25+LTBP2

討 論

NSCLC是肺癌中最常見的組織類型，國內外的發病率和死亡率均位居前列[7]。近年來，盡管肺癌的臨床診治方法得到了不斷提高與更新，也開始出現新的化療藥物及免疫治療藥物，但患者的整體預后仍不理想[8]。目前，有關NSCLC的早期診斷和治療仍是我國乃至世界范圍需要迫切解決的一個重要難題。

腫瘤標志物是一種化學類物質，對臨床疾病診斷和評估患者的預后有著重要意義，近年來其也獲得了越來越多的關注[9]。趨化因子是一個結構相關的小分子肝素結合蛋白家族，以往的研究已經證實，在趨化因子受體多種癌癥類型中，參與腫瘤細胞的凋亡、轉移信號機制[10]。研究顯示，CXCR4在NSCLC中高表達，降低CXCR4表達可以抑制腫瘤細胞向骨髓、淋巴結或胸膜腔的轉移[11]。這些發現提示了趨化因子/趨化因子受體信號轉導對NSCLC轉移的潛在影響。腫瘤細胞能夠利用趨化因子及其相應的受體進行生存和傳播，并將它們用作尋找繼發轉移部位的導航工具。在所有已知參與包括NSCLC在內的不同癌癥進展的趨化因子受體中，CXCR4在大多數癌癥中均為高表達，并且在原發性腫瘤的進展和轉移中起重要作用。最近的研究還發現CCR9-CCL25相互作用介導NSCLC細胞中PI3K/Akt通路的激活，導致抗凋亡蛋白的上調，以及以PI3K/Akt依賴的方式凋亡蛋白的下調[12]，此外，CCL25/CCR9信號軸能夠調節VEGF-C、VEGF-D、MMP-1和MMP-7的表達，并可能促進肺癌細胞的侵襲和遷移[13]。本研究中，與對照相比，CCL25在NSCLC患者的血清中高度表達。TNM分期較高，淋巴結轉移和低分化患者預后普遍較差，本研究中，上述患者的血清CCL25表達更高，表明CCR9-CCL25軸可能與NSCLC侵襲性有關，并有望被驗證為NSCLC的預后指標。

細胞外基質蛋白是近年來腫瘤學研究的一個熱點，而LTBP2是一種可溶于血的多結構域的細胞外基質蛋白[14]。LTBP2與其他LTBP不同，是唯一不與潛在TGF-β結合的成員。研究證明LTBP2對原纖維蛋白1表現出相當的結合親和力[15]。在頭頸部鱗狀細胞癌中，LTBP2表達上調并與淋巴結轉移和較差的總生存期相關[16]。敲除LTBP2可抑制甲狀腺癌細胞中的磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路減弱。LTBP2在結直腸癌肝轉移灶中普遍表達，并且在正常結腸組織和炎癥性肝病中不存在，這表明LTBP2在結直腸癌細胞轉移過程中發揮了關鍵作用[17]。在胰腺癌、宮頸癌和漿液性卵巢癌中，也觀察到LTBP2的高表達，并且與預后不良有關[18-19]。本研究結果顯示，觀察組患者血清LTBP2水平均明顯高于對照組，提示LTBP2可能在NSCLC中發揮促癌作用。進一步分析LTBP2水平與NSCLC患者病理特征的關系，結果顯示不同TNM分期、分化程度及是否發生淋巴結轉移的NSCLC患者血清LTBP2水平存在顯著性差異，表明LTBP2水平升高與NSCLC轉移和惡性程度有關。

由于CCL25和LTBP2水平升高可能與NSCLC轉移和惡性程度有關，因此我們分析了血清CCL25和LTBP2對NSCLC的診斷價值，結果顯示，CCL25、LTBP2、CCL25聯合LTBP2診斷NSCLC的曲線下面積分別為0.80、0.78、0.85，表明二者聯合檢測具有更高的診斷效能。綜上所述，非小細胞肺癌患者血清中CCL25和LTBP2水平明顯升高，二者可能是潛在的非小細胞肺癌診斷標志物。