腺花素對急性肺損傷模型小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制*

司徒杰，曾誠

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510405；2.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣州 510006)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指機(jī)體遭受到非心源性內(nèi)外致病因素，造成以急性呼吸困難和難治性低氧血癥為主要臨床表現(xiàn)的一類疾病[1]。既往研究認(rèn)為，ALI發(fā)病機(jī)制的本質(zhì)是中性粒細(xì)胞異常激活、炎癥因子釋放及炎癥信號通路的活化等一系列炎癥反應(yīng)的失控，最終導(dǎo)致肺組織破壞[2]。目前臨床上主要以類固醇激素為主要藥物治療手段[3]。然而，類固醇激素藥物副作用大且影響患者預(yù)后生活質(zhì)量。因此，亟需尋找不良反應(yīng)小、效果良好新型藥物治療ALI。

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一種跨膜受體，在脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中具有至關(guān)重要的作用[4]。脂多糖與TLR4結(jié)合后，通過髓樣分化因子(myeloid differentiation factor，MyD88)途徑可激活核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號，從而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤和炎癥因子“爆發(fā)”等一系列炎癥反應(yīng)[5]。多項(xiàng)研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活與ALI的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。

腺花素是從天然腺花香茶菜植物中提取的一種呋喃二萜類化合物[7]，可以抑制過氧化物還原酶Ⅰ/Ⅱ誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞分化且殺死肝癌細(xì)胞[8]。研究報(bào)道，腺花素可通過抑制NF-κB信號通路預(yù)防及治療自身免疫性腦脊髓炎[9]，提示抑制NF-κB信號通路可能是腺花素治療疾病的潛在機(jī)制。但筆者目前未見腺花素對ALI治療作用的研究報(bào)道。

本研究擬使用氣管滴注脂多糖構(gòu)建ALI作為動(dòng)物模型和脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞損傷作為細(xì)胞模型，從體內(nèi)外水平探究腺花素對ALI的作用，檢測其對NF-κB及其上游信號的影響以探究其作用機(jī)制，為治療ALI新藥研發(fā)提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑 細(xì)胞為小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；C57BL/6雄性小鼠，無特定病原體(SPF)級，年齡6～8周，體質(zhì)量22～25 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(粵)2017-0125；脂多糖 (Escherichia coli 055：B5) 、噻唑藍(lán)(MTT)購于Sigma-Aldrich。TLR4、MyD88、p-NF-кB(Ser276)、NF-кB、Bcl-2、Bax及β-Tubulin購于Abclonal Technology；兔二抗IgG購于Cell Signaling Technology；Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI) 雙染凋亡試劑盒購于貝博生物公司；瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色液購于雷根生物公司；PierceTMBCA Protein Assay Kit購于Thermo scientific；白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購于聯(lián)科生物公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1造模及分組 將30只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：正常對照組、模型對照組、地塞米松組及腺花素小、中、大劑量組(腺花素 5，10，20 mg·kg-1)[10]，每組5只。0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，正常對照組給予一定量的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)，其余組分別向氣管內(nèi)滴注1 mg·mL-1脂多糖造模，造模劑量為10 mg·kg-1[11]，然后記錄體質(zhì)量。造模6 h后，地塞米松組腹腔注射地塞米松5 mg·kg-1[12]，腺花素小、中、大組分別腹腔注射腺花素5，10和20 mg·kg-1[9]。18 h后用戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，記錄體質(zhì)量，取肺泡灌洗液后處死小鼠取肺組織。

1.2.2支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)及肺組織樣本的收集 用4 ℃預(yù)冷的無菌PBS 0.8 mL進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，重復(fù)灌洗3次，BALF的回收率達(dá)75%為合格。BALF離心10 min(4 ℃，1000×g)。分別收集上清液和沉淀，上清液用二喹啉甲酸法進(jìn)行總蛋白含量測定。沉淀部分用無菌PBS 100 μL重懸，并利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)。取細(xì)胞沉淀涂片進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色，在低倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)顏色和形態(tài)學(xué)特征計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞百分比。支氣管肺泡灌洗后分離肺組織，左肺用于蘇木精-伊紅(HE)染色，右肺-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3小鼠肺組織濕/干質(zhì)量之比 用濾紙將小鼠右肺中葉組織表面血液和水分吸干，稱質(zhì)量，記錄為濕質(zhì)量(wet mass，W)。然后將右肺組織置于70 ℃烘箱內(nèi)，烘烤48 h，再次稱質(zhì)量，記錄為干質(zhì)量(dry mass，D)。計(jì)算肺組織濕/干質(zhì)量之比(W/D)，判斷肺部水腫情況。

1.2.4ELISA法檢測肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6含量 選用聯(lián)科生物公司ELISA試劑盒，檢測TNF-α[13]、IL-6[14]。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，根據(jù)吸光度值(A)分別計(jì)算含量。

1.2.5HE染色 對分離后的左肺組織利用10%中性緩沖甲醛液進(jìn)行固定，然后對左肺組織進(jìn)行脫水，透明，石蠟包埋后切片(厚5 μm)，進(jìn)行HE染色，觀察肺組織病理學(xué)改變。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：①肺間質(zhì)水腫；②肺泡水腫；③炎癥細(xì)胞浸潤；④肺泡出血；⑤肺泡結(jié)構(gòu)完整性破壞。根據(jù)每項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)按無、輕、中、重分別記為0，1，2，3分，計(jì)算平均分為肺組織的病理評分。

1.2.6細(xì)胞活力檢測 采用MTT法檢測腺花素對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響。以5×103個(gè)細(xì)胞每孔的密度接種到96孔板中，用不同濃度腺花素(0，2，4，8，12，16，20，24和28 μmol·L-1)處理24 h。藥物干預(yù)結(jié)束后，每孔中加入無血清培養(yǎng)基180 μL和 0.5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，并37 ℃下避光孵育4 h。最后，吸去96孔板中液體，每孔加入二甲亞砜150 μL，并用酶標(biāo)儀在570 nm下測量每孔A值。細(xì)胞活力=(A實(shí)驗(yàn)組-A正常對照組)/(A模型對照組-A正常對照組)。

1.2.7細(xì)胞凋亡 將巨噬細(xì)胞RAW 264.7接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，正常對照組、模型對照組[15]及腺花素小、中、大劑量組[9]分別給予藥物處理12 h。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.8免疫印跡法(Western blotting)檢測細(xì)胞和肺組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2及Bax含量 將巨噬細(xì)胞RAW 264.7接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，正常對照組、模型對照組及腺花素小、中、大劑量組分別給予藥物處理12 h進(jìn)行制樣。將各組小鼠麻醉處死后，取100 mg左肺部組織勻漿進(jìn)行制樣。所得細(xì)胞和小鼠肺組織樣品經(jīng)過電泳、電轉(zhuǎn)及封閉過程后，分別在4 ℃下孵育抗體(稀釋倍數(shù)1：1000)過夜，次日加入兔二抗(稀釋倍數(shù)1：10 000)孵育，最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，采用Image J 1.47v統(tǒng)計(jì)灰度值，計(jì)算TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2及Bax相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1小鼠基本狀態(tài) 與正常對照組比較，模型對照組活躍度降低，呼吸不順暢，體質(zhì)量明顯減輕，肺組織濕干比顯著增大，BALF中總蛋白濃度明顯升高(P<0.05)；與模型對照組比較，地塞米松組和腺花素小、中、大劑量組小鼠基本狀態(tài)改善，體質(zhì)量減輕較小，肺組織濕干比明顯減小，BALF中總蛋白濃度顯著降低(P<0.05)(表1、圖1)。HE染色結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型對照組肺組織損傷嚴(yán)重，肺泡間隔增寬，肺組織間質(zhì)及肺泡腔可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，地塞米松組及腺花素小、中、大劑量組肺組織損傷改善，肺泡間隔清晰，肺泡結(jié)構(gòu)完整度較高(圖2)。對HE切片進(jìn)行評分，與正常對照組比較，模型對照組得分較高(P<0.05)，肺組織損傷嚴(yán)重；與模型對照組比較，地塞米松組及腺花素小、中、大劑量均得分降低，肺組織損傷顯著改善(P<0.05)(表2)。

表1 6組小鼠治療前后體質(zhì)量的變化比較 Tab.1 Comparison of changes of mass among six groups of mice before and after treatments

A.正常對照組；B.模型對照組；C.地塞米松組；D.腺花素小劑量組；E.腺花素中劑量組；F.腺花素大劑量組。圖2 6組小鼠肺組織HE染色 A.normal control group；B.model control group；C.dexamethasone group；D.adenanthin low dose group；E.adenanthin middle dose group；F.adenanthin high dose group.

A.正常對照組；B.模型對照組；C.地塞米松組；D.腺花素小劑量組；E.腺花素中劑量組；F.腺花素大劑量組。①與正常對照組比較，t=16.81，18.09，P<0.05；②與模型對照組比較，t=6.56～12.70，P<0.05。圖1 6組小鼠肺組織濕干比及BALF中總蛋白A.normal control group；B.model control group；C.dexamethasone group；D.adenanthin low dose group；E.adenanthin middle dose group；F.adenanthin high dose group. ①Compared with normal control group，t=16.81，18.09，P<0.05；②Compared with model control group，t=6.56—12.70，P<0.05.Fig.1 Wet-dry ratio of lung tissue and total protein in BALF in six groups of

表2 6組小鼠肺組織病理損傷評分比較

2.2腺花素對ALI小鼠炎癥反應(yīng)的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量均顯著上升(P<0.05)(圖3)，巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞比例顯著增大(表3)；與模型對照組比較，地塞米松和腺花素中、大劑量組TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量均顯著降低(圖3)、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞比例(表3)明顯減小(P<0.05)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.地塞米松組；D.腺花素小劑量組；E.腺花素中劑量組；F.腺花素大劑量組。 ①與正常對照組比較，t=20.22，33.15，28.23，P<0.05；②與模型對照組比較，t=5.24～27.94，P<0.05。圖3 6組小鼠肺組織IL-1β、IL-6及TNF-α含量A.normal control group；B.model control group；C.dexamethasone group；D.adenanthin low dose group；E.adenanthin middle dose group；F.adenanthin high dose group. ①Compared with normal control group，t=20.22，33.15，28.23，P<0.05；②Compared with model control group，t=5.24—27.94，P<0.05.Fig.3 Contents of IL-1β，IL-6 and TNF-α in lung tissues of six groups of

表3 6組小鼠BALF中總細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量比較 Tab.3 Comparison of number of total cells，macrophages and neutrophils in BALF among six groups of mice

2.3腺花素對巨噬細(xì)胞RAW264.7生長的影響 MTT結(jié)果顯示，0～12 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)腺花素對巨噬細(xì)胞RAW264.7生長無明顯抑制作用(圖4)。

①與0 μmol·L-1比較，t=4.42～14.14，P<0.05。圖4 腺花素對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響 ①Compared with 0 μmol·L-1，t=4.42—14.14，P<0.05.Fig.4 Effect of adenanthin on RAW264.7 cell viability

2.4腺花素對脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW 264.7凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型對照組凋亡率顯著上升；與模型對照組比較，地塞米松組和腺花素小、中、大劑量組凋亡率顯著下降，表明腺花素可抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡(P<0.05)(圖5)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.腺花素小劑量組；D.腺花素中劑量組；E.腺花素大劑量組。①與正常對照組比較，t=22.77，P<0.05；②與模型對照組比較，t=8.20，13.49，19.21，P<0.05。圖5 5組RAW 264.7細(xì)胞凋亡率A.normal control group；B.model control group；C.adenanthin low dose group；D.adenanthin middle dose group；E.adenanthin high dose group.①Compared with normal control group，t=22.77，P<0.05；②Compared with model control group，t=8.20，13.49，19.21，P<0.05.Fig.5 Apoptosis rate of RAW 264.7 cells in five

2.5腺花素對脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路及凋亡相關(guān)蛋白的影響 Western blotting結(jié)果顯示，腺花素能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞NF-κB的磷酸化以及TLR4和MyD88蛋白的表達(dá)，并伴隨促凋亡蛋白Bax顯著減少和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著增多(P<0.05)(圖6和表4)。上述實(shí)驗(yàn)證明，腺花素可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路并降低脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡率。

表4 5組RAW 264.7細(xì)胞TLR4、 MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2 和Bax蛋白相對表達(dá)量比較 Tab.4 Comparison of relative expression of TLR4，MyD88，p-NF-κB，NF-κB，Bcl-2 and Bax in RAW 264.7 cells among five groups

A.正常對照組；B.模型對照組；C.腺花素小劑量組；D.腺花素中劑量組；E.腺花素大劑量組。圖6 5組RAW 264.7細(xì)胞TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2 和Bax蛋白的表達(dá)(n=3) A.normal control group；B.model control group；C.adenanthin low dose group；D.adenanthin middle dose group；E.adenanthin high dose group.Fig.6 Expression of TLR4， MyD88，p-NF-κB，NF-κB，Bcl-2 and Bax in five groups of RAW 264.7 cells(n=3)

2.6腺花素對脂多糖所致ALI小鼠肺組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響 Western blotting結(jié)果顯示，腺花素可抑制NF-κB的磷酸化以及TLR4和MyD88蛋白的表達(dá)，并伴隨促凋亡蛋白Bax顯著減少和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著增多(P<0.05)(表5和圖7)。上述實(shí)驗(yàn)證明，腺花素抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路并改善ALI。

表5 5組小鼠肺組織中TLR4、 MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2 和Bax蛋白相對表達(dá)量比較 Tab.5 Comparison of relative expression of TLR4， MyD88，p-NF-κB，NF-κB，Bcl-2 and Bax in lung tissues among five groups of mice

3 討論

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，治療ALI的新方法不斷涌現(xiàn)，但ALI的病死率30%～50%，依然很高[16]。ALI患者接受類固醇藥物治療后，藥物引起的全身不良反應(yīng)嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[17]。因此亟需研發(fā)治療效果好、不良反應(yīng)小和價(jià)格適宜的有效藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，與脂多糖誘導(dǎo)的ALI小鼠模型對照組比較，腺花素組小鼠的基本狀態(tài)得到改善，肺組織的濕干比及BALF中總蛋白濃度明顯降低。HE染色結(jié)果顯示，腺花素各組ALI小鼠的肺組織病理損傷均改善，肺泡間隔清晰，肺泡結(jié)構(gòu)完整度較高。腺花素大劑量組的治療效果與地塞米松組接近。上述結(jié)果表明，腺花素能有效改善ALI。

ALI具有炎癥細(xì)胞浸潤及炎癥因子爆發(fā)等特點(diǎn)，導(dǎo)致彌散性功能受損、肺泡順應(yīng)性下降等臨床表現(xiàn)[18]。研究報(bào)道，腺花素可通過抑制炎癥細(xì)胞的浸潤及降低TNF-α和IL-6等炎癥因子分泌，從而預(yù)防和治療自身免疫性腦脊髓炎[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腺花素能顯著減少小鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-1β以及IL-6的分泌及中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量。在脂多糖誘導(dǎo)的ALI體外實(shí)驗(yàn)中，在0～12 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)腺花素對巨噬細(xì)胞RAW264.7生長無明顯抑制作用，且能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的凋亡，表明小劑量腺花素對細(xì)胞無毒性作用且能有效抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺部組織炎癥反應(yīng)及炎癥細(xì)胞的凋亡。

研究表明，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化后可進(jìn)入細(xì)胞核與B細(xì)胞免疫球蛋白κ鏈啟動(dòng)子結(jié)合，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[19]。作為NF-κB的上游蛋白，TLR4也有助于先天免疫反應(yīng)中炎癥遞質(zhì)的釋放[20]，并且可通過激活下游MyD88和NF-κB信號通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[21]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證腺花素是否通過NF-κB信號通路改善脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷，本實(shí)驗(yàn)分別開展了相應(yīng)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。Western blotting結(jié)果顯示，腺花素抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NF-κB的磷酸化及其NF-κB信號通路上游TLR4和MyD88蛋白的表達(dá)，并伴隨促凋亡蛋白Bax表達(dá)的顯著減少和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著增多。進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，NF-κB信號通路及凋亡相關(guān)蛋白的改變與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，YIN等[9]也報(bào)道腺花素可以通過抑制NF-κB信號通路預(yù)防及治療自身免疫性腦脊髓炎。因此，TLR4/MyD88/NF-κB信號級聯(lián)可能是腺花素治療ALI的重要炎癥信號通路。既往研究顯示，腺花素能靶向抑制硫氧還原蛋白-硫氧還原蛋白還原酶系統(tǒng)[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TLR4/MyD88/NF-κB可能是腺花素另一個(gè)重要的靶向信號。然而，腺花素抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.腺花素小劑量組；D.腺花素中劑量組；E.腺花素大劑量組。圖7 5組小鼠肺組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2 和Bax蛋白的表達(dá)(n=5) A.normal control group；B.model control group；C.adenanthin low dose group；D.adenanthin middle dose group；E.adenanthin high dose group.Fig.7 Expression of TLR4，MyD88，p-NF-κB，NF-κB，Bcl-2，and Bax in lung tissues among five groups of mice(n=5)