腺花素對急性肺損傷模型小鼠的保護作用及其機制*

司徒杰，曾誠

(1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，廣州 510405；2.廣東藥科大學新藥研發中心，廣州 510006)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指機體遭受到非心源性內外致病因素，造成以急性呼吸困難和難治性低氧血癥為主要臨床表現的一類疾病[1]。既往研究認為，ALI發病機制的本質是中性粒細胞異常激活、炎癥因子釋放及炎癥信號通路的活化等一系列炎癥反應的失控，最終導致肺組織破壞[2]。目前臨床上主要以類固醇激素為主要藥物治療手段[3]。然而，類固醇激素藥物副作用大且影響患者預后生活質量。因此，亟需尋找不良反應小、效果良好新型藥物治療ALI。

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一種跨膜受體，在脂多糖誘導的炎癥反應中具有至關重要的作用[4]。脂多糖與TLR4結合后，通過髓樣分化因子(myeloid differentiation factor，MyD88)途徑可激活核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號，從而導致中性粒細胞浸潤和炎癥因子“爆發”等一系列炎癥反應[5]。多項研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活與ALI的發生發展密切相關[6]。

腺花素是從天然腺花香茶菜植物中提取的一種呋喃二萜類化合物[7]，可以抑制過氧化物還原酶Ⅰ/Ⅱ誘導急性早幼粒白血病細胞分化且殺死肝癌細胞[8]。研究報道，腺花素可通過抑制NF-κB信號通路預防及治療自身免疫性腦脊髓炎[9]，提示抑制NF-κB信號通路可能是腺花素治療疾病的潛在機制。但筆者目前未見腺花素對ALI治療作用的研究報道。

本研究擬使用氣管滴注脂多糖構建ALI作為動物模型和脂多糖誘導RAW264.7巨噬細胞損傷作為細胞模型，從體內外水平探究腺花素對ALI的作用，檢測其對NF-κB及其上游信號的影響以探究其作用機制，為治療ALI新藥研發提供新的科學依據。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑 細胞為小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7(中國科學院上海細胞庫)；C57BL/6雄性小鼠，無特定病原體(SPF)級，年齡6～8周，體質量22～25 g，廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2017-0125；脂多糖 (Escherichia coli 055：B5) 、噻唑藍(MTT)購于Sigma-Aldrich。TLR4、MyD88、p-NF-кB(Ser276)、NF-кB、Bcl-2、Bax及β-Tubulin購于Abclonal Technology；兔二抗IgG購于Cell Signaling Technology；Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI) 雙染凋亡試劑盒購于貝博生物公司；瑞氏-吉姆薩復合染色液購于雷根生物公司；PierceTMBCA Protein Assay Kit購于Thermo scientific；白細胞介素(IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α 酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購于聯科生物公司。

1.2實驗方法

1.2.1造模及分組 將30只小鼠采用隨機數字表法分為6組：正常對照組、模型對照組、地塞米松組及腺花素小、中、大劑量組(腺花素 5，10，20 mg·kg-1)[10]，每組5只。0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，正常對照組給予一定量的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)，其余組分別向氣管內滴注1 mg·mL-1脂多糖造模，造模劑量為10 mg·kg-1[11]，然后記錄體質量。造模6 h后，地塞米松組腹腔注射地塞米松5 mg·kg-1[12]，腺花素小、中、大組分別腹腔注射腺花素5，10和20 mg·kg-1[9]。18 h后用戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，記錄體質量，取肺泡灌洗液后處死小鼠取肺組織。

1.2.2支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)及肺組織樣本的收集 用4 ℃預冷的無菌PBS 0.8 mL進行支氣管肺泡灌洗，重復灌洗3次，BALF的回收率達75%為合格。BALF離心10 min(4 ℃，1000×g)。分別收集上清液和沉淀，上清液用二喹啉甲酸法進行總蛋白含量測定。沉淀部分用無菌PBS 100 μL重懸，并利用細胞計數板進行細胞總數計數。取細胞沉淀涂片進行瑞氏-吉姆薩染色，在低倍鏡下計數200個細胞，根據顏色和形態學特征計數中性粒細胞及巨噬細胞百分比。支氣管肺泡灌洗后分離肺組織，左肺用于蘇木精-伊紅(HE)染色，右肺-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.3小鼠肺組織濕/干質量之比 用濾紙將小鼠右肺中葉組織表面血液和水分吸干，稱質量，記錄為濕質量(wet mass，W)。然后將右肺組織置于70 ℃烘箱內，烘烤48 h，再次稱質量，記錄為干質量(dry mass，D)。計算肺組織濕/干質量之比(W/D)，判斷肺部水腫情況。

1.2.4ELISA法檢測肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6含量 選用聯科生物公司ELISA試劑盒，檢測TNF-α[13]、IL-6[14]。嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，根據吸光度值(A)分別計算含量。

1.2.5HE染色 對分離后的左肺組織利用10%中性緩沖甲醛液進行固定，然后對左肺組織進行脫水，透明，石蠟包埋后切片(厚5 μm)，進行HE染色，觀察肺組織病理學改變。評分標準如下：①肺間質水腫；②肺泡水腫；③炎癥細胞浸潤；④肺泡出血；⑤肺泡結構完整性破壞。根據每項標準按無、輕、中、重分別記為0，1，2，3分，計算平均分為肺組織的病理評分。

1.2.6細胞活力檢測 采用MTT法檢測腺花素對RAW264.7細胞增殖的影響。以5×103個細胞每孔的密度接種到96孔板中，用不同濃度腺花素(0，2，4，8，12，16，20，24和28 μmol·L-1)處理24 h。藥物干預結束后，每孔中加入無血清培養基180 μL和 0.5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，并37 ℃下避光孵育4 h。最后，吸去96孔板中液體，每孔加入二甲亞砜150 μL，并用酶標儀在570 nm下測量每孔A值。細胞活力=(A實驗組-A正常對照組)/(A模型對照組-A正常對照組)。

1.2.7細胞凋亡 將巨噬細胞RAW 264.7接種于6孔板中，待細胞貼壁后，正常對照組、模型對照組[15]及腺花素小、中、大劑量組[9]分別給予藥物處理12 h。嚴格按照試劑盒說明書操作，用流式細胞儀檢測。

1.2.8免疫印跡法(Western blotting)檢測細胞和肺組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2及Bax含量 將巨噬細胞RAW 264.7接種于6孔板中，待細胞貼壁后，正常對照組、模型對照組及腺花素小、中、大劑量組分別給予藥物處理12 h進行制樣。將各組小鼠麻醉處死后，取100 mg左肺部組織勻漿進行制樣。所得細胞和小鼠肺組織樣品經過電泳、電轉及封閉過程后，分別在4 ℃下孵育抗體(稀釋倍數1：1000)過夜，次日加入兔二抗(稀釋倍數1：10 000)孵育，最后加入發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照，采用Image J 1.47v統計灰度值，計算TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2及Bax相對表達量。

2 結果

2.1小鼠基本狀態 與正常對照組比較，模型對照組活躍度降低，呼吸不順暢，體質量明顯減輕，肺組織濕干比顯著增大，BALF中總蛋白濃度明顯升高(P<0.05)；與模型對照組比較，地塞米松組和腺花素小、中、大劑量組小鼠基本狀態改善，體質量減輕較小，肺組織濕干比明顯減小，BALF中總蛋白濃度顯著降低(P<0.05)(表1、圖1)。HE染色結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組肺組織損傷嚴重，肺泡間隔增寬，肺組織間質及肺泡腔可見大量炎癥細胞浸潤，地塞米松組及腺花素小、中、大劑量組肺組織損傷改善，肺泡間隔清晰，肺泡結構完整度較高(圖2)。對HE切片進行評分，與正常對照組比較，模型對照組得分較高(P<0.05)，肺組織損傷嚴重；與模型對照組比較，地塞米松組及腺花素小、中、大劑量均得分降低，肺組織損傷顯著改善(P<0.05)(表2)。

表1 6組小鼠治療前后體質量的變化比較 Tab.1 Comparison of changes of mass among six groups of mice before and after treatments

A.正常對照組；B.模型對照組；C.地塞米松組；D.腺花素小劑量組；E.腺花素中劑量組；F.腺花素大劑量組。圖2 6組小鼠肺組織HE染色 A.normal control group；B.model control group；C.dexamethasone group；D.adenanthin low dose group；E.adenanthin middle dose group；F.adenanthin high dose group.

A.正常對照組；B.模型對照組；C.地塞米松組；D.腺花素小劑量組；E.腺花素中劑量組；F.腺花素大劑量組。①與正常對照組比較，t=16.81，18.09，P<0.05；②與模型對照組比較，t=6.56～12.70，P<0.05。圖1 6組小鼠肺組織濕干比及BALF中總蛋白A.normal control group；B.model control group；C.dexamethasone group；D.adenanthin low dose group；E.adenanthin middle dose group；F.adenanthin high dose group. ①Compared with normal control group，t=16.81，18.09，P<0.05；②Compared with model control group，t=6.56—12.70，P<0.05.Fig.1 Wet-dry ratio of lung tissue and total protein in BALF in six groups of

表2 6組小鼠肺組織病理損傷評分比較

2.2腺花素對ALI小鼠炎癥反應的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量均顯著上升(P<0.05)(圖3)，巨噬細胞及中性粒細胞比例顯著增大(表3)；與模型對照組比較，地塞米松和腺花素中、大劑量組TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量均顯著降低(圖3)、中性粒細胞及巨噬細胞比例(表3)明顯減小(P<0.05)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.地塞米松組；D.腺花素小劑量組；E.腺花素中劑量組；F.腺花素大劑量組。 ①與正常對照組比較，t=20.22，33.15，28.23，P<0.05；②與模型對照組比較，t=5.24～27.94，P<0.05。圖3 6組小鼠肺組織IL-1β、IL-6及TNF-α含量A.normal control group；B.model control group；C.dexamethasone group；D.adenanthin low dose group；E.adenanthin middle dose group；F.adenanthin high dose group. ①Compared with normal control group，t=20.22，33.15，28.23，P<0.05；②Compared with model control group，t=5.24—27.94，P<0.05.Fig.3 Contents of IL-1β，IL-6 and TNF-α in lung tissues of six groups of

表3 6組小鼠BALF中總細胞、巨噬細胞和中性粒細胞數量比較 Tab.3 Comparison of number of total cells，macrophages and neutrophils in BALF among six groups of mice

2.3腺花素對巨噬細胞RAW264.7生長的影響 MTT結果顯示，0～12 μmol·L-1濃度范圍內腺花素對巨噬細胞RAW264.7生長無明顯抑制作用(圖4)。

①與0 μmol·L-1比較，t=4.42～14.14，P<0.05。圖4 腺花素對RAW264.7細胞存活率的影響 ①Compared with 0 μmol·L-1，t=4.42—14.14，P<0.05.Fig.4 Effect of adenanthin on RAW264.7 cell viability

2.4腺花素對脂多糖誘導的巨噬細胞RAW 264.7凋亡的影響 流式細胞術的結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組凋亡率顯著上升；與模型對照組比較，地塞米松組和腺花素小、中、大劑量組凋亡率顯著下降，表明腺花素可抑制脂多糖誘導的巨噬細胞凋亡(P<0.05)(圖5)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.腺花素小劑量組；D.腺花素中劑量組；E.腺花素大劑量組。①與正常對照組比較，t=22.77，P<0.05；②與模型對照組比較，t=8.20，13.49，19.21，P<0.05。圖5 5組RAW 264.7細胞凋亡率A.normal control group；B.model control group；C.adenanthin low dose group；D.adenanthin middle dose group；E.adenanthin high dose group.①Compared with normal control group，t=22.77，P<0.05；②Compared with model control group，t=8.20，13.49，19.21，P<0.05.Fig.5 Apoptosis rate of RAW 264.7 cells in five

2.5腺花素對脂多糖誘導的巨噬細胞中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路及凋亡相關蛋白的影響 Western blotting結果顯示，腺花素能夠顯著抑制巨噬細胞NF-κB的磷酸化以及TLR4和MyD88蛋白的表達，并伴隨促凋亡蛋白Bax顯著減少和抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著增多(P<0.05)(圖6和表4)。上述實驗證明，腺花素可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路并降低脂多糖誘導的巨噬細胞凋亡率。

表4 5組RAW 264.7細胞TLR4、 MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2 和Bax蛋白相對表達量比較 Tab.4 Comparison of relative expression of TLR4，MyD88，p-NF-κB，NF-κB，Bcl-2 and Bax in RAW 264.7 cells among five groups

A.正常對照組；B.模型對照組；C.腺花素小劑量組；D.腺花素中劑量組；E.腺花素大劑量組。圖6 5組RAW 264.7細胞TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2 和Bax蛋白的表達(n=3) A.normal control group；B.model control group；C.adenanthin low dose group；D.adenanthin middle dose group；E.adenanthin high dose group.Fig.6 Expression of TLR4， MyD88，p-NF-κB，NF-κB，Bcl-2 and Bax in five groups of RAW 264.7 cells(n=3)

2.6腺花素對脂多糖所致ALI小鼠肺組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響 Western blotting結果顯示，腺花素可抑制NF-κB的磷酸化以及TLR4和MyD88蛋白的表達，并伴隨促凋亡蛋白Bax顯著減少和抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著增多(P<0.05)(表5和圖7)。上述實驗證明，腺花素抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路并改善ALI。

表5 5組小鼠肺組織中TLR4、 MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2 和Bax蛋白相對表達量比較 Tab.5 Comparison of relative expression of TLR4， MyD88，p-NF-κB，NF-κB，Bcl-2 and Bax in lung tissues among five groups of mice

3 討論

隨著醫療技術的不斷發展，治療ALI的新方法不斷涌現，但ALI的病死率30%～50%，依然很高[16]。ALI患者接受類固醇藥物治療后，藥物引起的全身不良反應嚴重影響生活質量[17]。因此亟需研發治療效果好、不良反應小和價格適宜的有效藥物。本研究發現，與脂多糖誘導的ALI小鼠模型對照組比較，腺花素組小鼠的基本狀態得到改善，肺組織的濕干比及BALF中總蛋白濃度明顯降低。HE染色結果顯示，腺花素各組ALI小鼠的肺組織病理損傷均改善，肺泡間隔清晰，肺泡結構完整度較高。腺花素大劑量組的治療效果與地塞米松組接近。上述結果表明，腺花素能有效改善ALI。

ALI具有炎癥細胞浸潤及炎癥因子爆發等特點，導致彌散性功能受損、肺泡順應性下降等臨床表現[18]。研究報道，腺花素可通過抑制炎癥細胞的浸潤及降低TNF-α和IL-6等炎癥因子分泌，從而預防和治療自身免疫性腦脊髓炎[9]。本實驗結果顯示，腺花素能顯著減少小鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-1β以及IL-6的分泌及中性粒細胞和巨噬細胞的數量。在脂多糖誘導的ALI體外實驗中，在0～12 μmol·L-1濃度范圍內腺花素對巨噬細胞RAW264.7生長無明顯抑制作用，且能夠抑制脂多糖誘導的巨噬細胞的凋亡，表明小劑量腺花素對細胞無毒性作用且能有效抑制脂多糖誘導的肺部組織炎癥反應及炎癥細胞的凋亡。

研究表明，轉錄因子NF-κB活化后可進入細胞核與B細胞免疫球蛋白κ鏈啟動子結合，導致炎癥的發生[19]。作為NF-κB的上游蛋白，TLR4也有助于先天免疫反應中炎癥遞質的釋放[20]，并且可通過激活下游MyD88和NF-κB信號通路調節炎癥反應[21]。為了進一步驗證腺花素是否通過NF-κB信號通路改善脂多糖誘導的急性肺損傷，本實驗分別開展了相應的體內外實驗。Western blotting結果顯示，腺花素抑制脂多糖誘導的RAW 264.7細胞NF-κB的磷酸化及其NF-κB信號通路上游TLR4和MyD88蛋白的表達，并伴隨促凋亡蛋白Bax表達的顯著減少和抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著增多。進一步的體內實驗顯示，NF-κB信號通路及凋亡相關蛋白的改變與體外細胞實驗結果一致。此外，YIN等[9]也報道腺花素可以通過抑制NF-κB信號通路預防及治療自身免疫性腦脊髓炎。因此，TLR4/MyD88/NF-κB信號級聯可能是腺花素治療ALI的重要炎癥信號通路。既往研究顯示，腺花素能靶向抑制硫氧還原蛋白-硫氧還原蛋白還原酶系統[22]。本實驗結果提示TLR4/MyD88/NF-κB可能是腺花素另一個重要的靶向信號。然而，腺花素抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的機制還有待進一步探究。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.腺花素小劑量組；D.腺花素中劑量組；E.腺花素大劑量組。圖7 5組小鼠肺組織中TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、Bcl-2 和Bax蛋白的表達(n=5) A.normal control group；B.model control group；C.adenanthin low dose group；D.adenanthin middle dose group；E.adenanthin high dose group.Fig.7 Expression of TLR4，MyD88，p-NF-κB，NF-κB，Bcl-2，and Bax in lung tissues among five groups of mice(n=5)