救必應對小腸黏膜損傷模型大鼠的防治作用及其機制*

梁欣儀，李茹柳，劉乙婷，陳婉霞，曾信平，胡玲

(廣州中醫藥大學科技創新中心、脾胃研究所，廣州 510405)

嶺南中藥救必應為冬青科植物鐵冬青(IlexrotundaThunb.)的干燥樹皮，性寒味苦，歸肺、胃、大腸、肝經，具有清熱解毒、利濕止痛功效，常用于治療暑濕發熱、咽喉腫痛、濕熱瀉痢、脘腹脹痛、風濕痹痛、濕疹、瘡癤、跌打損傷等[1]，最早記載于《嶺南采藥錄》，也是《中華人民共和國藥典》2010年、2015年、2020年版收錄的品種。救必應有調理脾胃作用，臨床上應用廣泛。國醫大師鄧鐵濤、廣東省名中醫勞紹賢等嶺南醫者常用救必應配伍其他中藥治療濕熱內蘊或肝郁內熱慢性胃腸疾病，如難治性消化性潰瘍、慢性萎縮性胃炎、腸易激綜合征、潰瘍性結腸炎等[2-4]。另外，含有救必應的中成藥腹可安片、飛揚腸胃炎膠囊等廣泛用于治療急慢性胃腸炎等。但救必應調理脾胃作用機制的研究較少，本研究在吲哚美辛致大鼠小腸黏膜損傷模型上，觀察其對小腸黏膜損傷的防治作用并分析其機制，檢測指標包括腸黏膜屏障功能相關指標(緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1，黏附連接蛋白E-cadherin、α-catenin、β-catenin，腸通透性指標血漿D-乳酸)以及腸特異性轉錄因子CDX-2，從促進腸黏膜損傷修復角度探討救必應調理脾胃的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物和動物 救必應為冬青科植物鐵冬青IlexrotundaThunb.的干燥樹皮，購于廣州市三元里杏園春藥店，經廣州中醫藥大學鑒定教研室童家赟副教授鑒定藥材性狀符合《中華人民共和國藥典》標準。

SD大鼠，雄性，無特定病原體(SPF)級，體質量180～220 g，購自廣州中醫藥大學動物實驗中心，實驗動物生產合格證：SCXK(粵)2018-0034；實驗環境：SPF級；實驗動物使用許可證：SYXK(粵)2018-0001。大鼠飼養條件：12 h明暗交替、溫度為18～26 ℃，日溫差≤3 ℃，相對濕度40%～70%，適應性喂養7 d后開始實驗。10%水合氯醛麻醉后取樣及處死。

1.1.2試劑和主要儀器 吲哚美辛(美國Sigma公司，批號：056M4036V)；通用鏈霉卵白素-生物素法免疫組化試劑盒(SP-9000)、二氨基聯苯胺(diamino-benzidine，DAB)試劑盒(北京中杉金橋有限公司)； ZO-1抗體(61-7300)，Occludin抗體(40-4700)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白定量試劑盒(凱基生物公司)；D-乳酸試劑盒(cat#13810，lot：2391443)(美國ATT，bioquest公司)；Claudin-1抗體(ab15098)、E-cadherin抗體(ab76055)、β-catenin抗體(ab32572)、α-catenin抗體(ab51032)、CDX-2抗體(ab76541)(英國abcam公司)；二抗：山羊抗兔IgG H&L(HRP，ab205718)，山羊抗小鼠IgG H&L(HRP，ab6789)。

ME204型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，感量：0.1 mg)，ClarityTMwestern ECL substrate、ChemiDocTMXRS+成像儀、TM電泳儀、垂直電泳儀槽(美國BIO-RAD公司)；DNA Expert型多用途微量板檢測儀(奧地利TECAN公司)；HeraousMultifuge X1R離心機(美國 Thermo Fisher公司)。

1.2方法

1.2.1救必應水提物的制備 稱取救必應藥材600 g，掰成小塊，12倍體積量純水浸泡2 h，180 ℃煮開，后用120 ℃煮2 h，紗布過濾；濾渣用12倍體積純水煎煮2 h，紗布過濾，合并2次濾液；濾液濃縮至1 g·mL-1(約600 mL)，-60 ℃過夜，次日真空干燥2 d，得救必應水提物凍干粉105 g(得率為17.5%)，-20 ℃保存。

1.2.2動物分組、造模和給藥方法 按Excel軟件產生的隨機數字表將大鼠分成正常對照組6只，模型對照組及救必應小、大劑量(8，16 g·kg-1)組各10只；大鼠適應性喂養1周，體質量(260±10) g；造模前受試藥組灌胃救必應水提物(8，16 g·kg-1)，模型對照組和正常對照組灌胃等體積純水；1 h后，模型對照組和受試藥組分別皮下注射吲哚美辛5 mg·kg-1造模，正常對照組皮下注射等體積0.9%氯化鈉溶液。按10 mL·kg-1體積灌胃和皮下注射均為每天1次，共4 d；末次灌胃后禁食不禁水24 h，第5天以10%水合氯醛20 mL·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，剖腹，腹主靜脈采血，并取小腸組織剪開；肉眼觀察小腸黏膜損傷情況，按評分細則計算損傷的大體評分；取損傷最明顯的小腸組織(長約2 cm)置4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下進行小腸組織病理評分；其余小腸冰上刮取黏膜組織，-80 ℃冰箱保存，以備后續免疫印跡(Western blotting)實驗。

1.2.3小腸黏膜損傷大體及病理評分標準 小腸黏膜損傷大體評分[5]：按潰瘍和粘連分別評分，總分為二者之和。潰瘍評分：游標卡尺測量全小腸的潰瘍長度，每一毫米計1分，寬度>1 mm計分加倍，累積評分。粘連評分：無粘連為0分；粘連較輕，少許力量即可將小腸與其他組織分開為1分；粘連較重為2分。

小腸黏膜損傷病理評分[6]，顯微鏡下觀察小腸組織病理變化。0分：腸黏膜絨毛正常；1分：絨毛頂端上皮下出現囊狀間隙，并伴有毛細血管充血；2分：上皮下間隙擴大，中度固有層水腫，中央乳糜管擴張；3分：固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細胞變性、壞死，少數絨毛頂端脫落；4分：上皮細胞層變性壞死、脫落，部分絨毛脫落、固有層裸露，毛細血管擴張、充血；5分：絨毛脫落，固有層崩解，出血或潰瘍形成。

1.2.4免疫組化法檢測小腸組織蛋白表達 組織切片60 ℃加熱1 h，常規脫蠟、水化；放進0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH值6.0)，微波爐加熱修復抗原，先中高火9 min，自然冷卻15 min，再高火5 min，自然冷卻1 h；SP法阻斷內源性過氧化物酶10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，每次5 min；正常山羊血清封閉液封閉15 min；孵育一抗(ZO-11：200，Occludin 1：100，Claudin-1 1：100，E-cadherin 1：100，α-catenin 1：100，β-catenin 1：100，CDX-2 1：100)，4 ℃過夜，37 ℃復溫45 min，甩去一抗，沖洗，滴加二抗，室溫孵育15 min，沖洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min，沖洗，擦干，DAB室溫顯色10 min，顯微鏡下控制染色程度(細胞質呈棕色則判為陽性表達細胞)；自來水沖洗5 min終止反應；蘇木精復染，自來水沖洗2 min；常規脫水，中性樹膠封片、鏡檢。正常對照組、模型對照組、救必應水提物16和8 g·kg-1組全部樣本均進行免疫組化檢測，若顯色失敗、染色效果較差時，則視作脫落樣本不納入統計。

組織切片鏡檢方法及圖片數據化：顯微鏡下所見棕黃色顆粒即為所測蛋白陽性表達，每張切片隨機選取5個視野(×200)進行評分，該5個視野再選取重點部位顯微鏡下(×400)觀察該蛋白表達。ImageJ軟件及IHC-Profiler插件處理圖片，軟件自動分離棕黃色部分(目標蛋白)進行測量，并得出“Negative，Low positive，Positive，and High positive”[7]。將軟件所得結果量化，Negative為0分，Low positive為1分，Positive為2分，High positive為3分，計算每張切片5個視野的平均陽性得分，即為該蛋白表達的半定量結果。

1.2.5Western blotting法檢測小腸黏膜蛋白表達 總蛋白提取及蛋白樣品準備，勻漿：小腸黏膜組織每50 mg加裂解液1 mL，低溫快速電動勻漿。12000×g離心，4 ℃，15 min，冰上靜置30 min。取少量上清液進行定量，用BCA試劑盒進行測定。將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合加5倍緩沖液，100 ℃變性10 min，冰上30 s冷卻，上樣，余下樣品-20 ℃保存。正常對照組、救必應水提物16 g·kg-1組全部樣本進行Western blotting檢測，模型對照組和救必應水提物8 g·kg-1組按隨機數字表各取6個樣本進行Western blotting檢測。

蛋白質免疫印跡，制膠：按照伯樂快速制膠試劑盒說明書配制。電泳：所有蛋白樣品調至等濃度后上樣，先用恒壓80 V，當跑至分離膠后改為200 V。轉膜：恒流250 mA電轉1.5～2 h。封閉：取膜，TBST洗5 min，3次，用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。孵育一抗：TBST洗膜，切膜，并放于對應的稀釋后的一抗4 ℃過夜(ZO-1 1：500，Occludin 1：500，Claudin-1 1：500，E-cadherin 1：1000，α-catenin 1：1000，β-catenin 1：1000，CDX-2 1：500)。室溫復溫20 min。孵育二抗：TBST洗膜，放入對應的稀釋好的二抗1 h(鼠二抗及兔二抗1：5000)。顯影：TBST洗膜，顯影液浸泡30 s后顯影。圖像處理：用ImageJ軟件處理得到所對應的吸光度(A值)。

1.2.6Amplite熒光法測血漿D-乳酸 按D-乳酸測定試劑盒說明書步驟，用DNA Expert型多用途微量板檢測儀檢測，發射波長/激光波長=532/590 nm，讀取吸光度，繪制標準曲線，計算血漿D-乳酸濃度。

2 結果

2.1救必應水提物對大鼠小腸黏膜損傷的影響(大體評分) 實驗結束時模型對照組和救必應小劑量組動物死亡各2只(2/10)，救必應大劑量組死亡4只(4/10)，動物死亡原因均為造模所致小腸穿孔，4組死亡數差異無統計學意義。

對各組存活大鼠進行小腸黏膜損傷大體評分，結果見表1。正常對照組大鼠小腸黏膜無粘連，黏膜未見明顯異常；模型對照組大鼠小腸腸管可見不同程度粘連，小腸黏膜均可見充血、糜爛、多發潰瘍灶及穿孔，潰瘍灶呈紅褐色，大體評分較正常對照組明顯增高(P<0.01，死亡大鼠不納入統計，下同)，提示造模成功。救必應水提物小劑量組可見小腸粘連，但程度輕于模型對照組，小腸腸管內可見多處潰瘍灶，但潰瘍總長度及總面積較模型對照組小，大體評分較模型對照組低(P<0.05)；救必應大劑量組大鼠小腸見少量粘連，小腸腸管內可見多處潰瘍灶，但潰瘍總長度及總面積較模型對照組減小(圖1)，大體評分較模型對照組低(P<0.01)。表明救必應水提物對吲哚美辛大鼠小腸黏膜損傷有防治作用。

由圖1及表1可見，正常對照組大鼠小腸可見輕微的黏膜層絨毛上皮細胞脫落，考慮跟飼養環境及動物批次有關；模型對照組大鼠可見小腸黏膜損傷形成，黏膜層絨毛及腸腺完全壞死，肌層肌細胞壞死，漿膜層及脂肪組織見結締組織增生，病理評分較正常對照組明顯增高(P<0.01)；救必應大劑量組也可見小腸黏膜損傷，部分為固有層裸露或充血水腫，病理評分較模型對照組降低(P<0.01)；救必應小劑量組損傷較模型對照組有所減輕，絨毛表面上皮細胞脫落，固有層崩解，但與模型對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。本結果從病理評分角度表明救必應水提物對吲哚美辛所致大鼠小腸黏膜損傷有改善作用。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.救必應小劑量組；D.救必應大劑量組。圖1 4組大鼠小腸黏膜組織病理變化(HE，×200) A.normal control group；B.model control group；C.Ilex rotunda Thunb. low dose group；D.Ilex rotunda Thunb. high dose group.Fig.1 Histopathological changes of small intestinal mucosa in four groups of rats(HE，×200)

表1 4組大鼠小腸黏膜損傷大體及病理評分比較 Tab.1 Comparison of gross and pathological scores of small intestinal mucosal injury among four groups of rats

2.2救必應水提物對造模大鼠小腸黏膜緊密連接蛋白表達的影響 免疫組化結果見圖2，正常對照組緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1在小腸黏膜絨毛和隱窩可見表達；與正常對照組比較，模型對照組小腸黏膜ZO-1、Occludin和Claudin-1表達均下降(均P<0.05)，提示吲哚美辛誘導小腸黏膜損傷可致緊密連接蛋白表達下降；與模型對照組比較，救必應小、大劑量組大鼠ZO-1、Occludin和Claudin-1表達升高(P<0.05或P<0.01)。圖2顯示(由于技術原因未取得ZO-1的 Western blotting結果)，與正常對照組比較，模型對照組緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1表達降低(P<0.05)；與模型對照組比較，救必應小、大劑量組大鼠Occludin和Claudin-1表達升高(P<0.05或P<0.01)。表明救必應水提物防治大鼠小腸黏膜損傷的作用與其提高小腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1表達有關。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.救必應小劑量組；D.救必應大劑量組；①與正常對照組比較，χ2=-2.863～-2.674(IHC)，t=0.003～0.798(WB)，P<0.05；②與模型對照組比較，χ2=-3.253～-2.650(IHC)，P<0.05；③與模型對照組比較，t=-0.129～0.644(WB)，P<0.01。圖2 免疫組化法(IHC)和免疫印跡法(WB)檢測4組大鼠ZO-1、Occludin和Claudin-1水平及其半定量分析結果(×200) A.normal control group；B.model control group；C.Ilex rotunda Thunb.low dose group ；D.Ilex rotunda Thunb.high dose group.①Compared with normal control group，χ2=-2.863—-2.674(IHC)，t=0.003-0.798(WB)，P<0.05；②Compared with model control group，χ2=-3.253—-2.650(IHC)，P<0.05； ③Compared with model control group，t=-0.129—0.644(WB)，P< 0.01.Fig.2 ZO-1，Occludin and Claudin-1 detected by immunohistochemistry(IHC)，Western blotting(WB) and their semi-quantitative analysis results in four groups of rats(×200)

2.3救必應水提物對造模大鼠小腸黏膜粘附連接蛋白表達的影響 免疫組化和免疫印跡檢測結果見圖3，正常對照組粘附連接蛋白E-cadherin、α-catenin和β-catenin在小腸黏膜絨毛和隱窩可見表達；與正常對照組比較，模型對照組小腸黏膜E-cadherin、α-catenin和β-catenin表達下降(均P<0.05或P<0.01)；與模型對照組比較，救必應小、大劑量組大鼠E-cadherin、α-catenin和β-catenin表達升高(P<0.05或P<0.01)。表明救必應水提物防治大鼠小腸黏膜損傷的作用與其提高小腸黏膜緊密連接蛋白E-cadherin、α-catenin和β-catenin表達有關。

2.4救必應水提物對造模大鼠小腸黏膜CDX-2表達的影響 免疫組化和免疫印跡檢測結果見圖4，正常對照組CDX-2在小腸黏膜絨毛和隱窩可見表達；與正常對照組比較，模型對照組小腸黏膜CDX-2表達下降(P<0.05)；與模型對照組比較，救必應小、大劑量組大鼠小腸黏膜CDX-2表達升高(P<0.01或P<0.05)。與正常對照組比較，模型對照組CDX-2表達下降(P<0.05)；與模型對照組比較，救必應小、大劑量組大鼠小腸黏膜CDX-2表達升高(P<0.05或P<0.01)。表明救必應水提物能提高吲哚美辛造模大鼠小腸黏膜CDX-2表達。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.救必應小劑量組；D.救必應大劑量組。①與正常對照組比較，χ2=-2.806～-2.749(IHC)，P<0.05；②與模型對照組比較， χ2=-3.318～-2.693(IHC)，P<0.05；③與正常對照組比較，t=-1.731～ 1.773(WB)，P<0.01；④與模型對照組比較，t=-0.652～ 1.680(WB)，P<0.01。圖3 免疫組化法(IHC)和免疫印跡法(WB)檢測4組大鼠E-cadherin、α-catenin和β-catenin蛋白水平及其半定量分析結果(×200) A.normal control group；B.model control group；C.Ilex rotunda Thunb.low dose group ；D.Ilex rotunda Thunb.high dose group.①Compared with normal control group，χ2=-2.806—-2.749(IHC)，P<0.05； ②Compared with model control group，χ2=-3.318—-2.693(IHC)，P<0.05； ③Compared with normal control group，t=-1.731—1.773(WB)，P< 0.01；④ Compared with model control group，t=-0.652—1.680(WB)，P< 0.01.Fig.3 E-cadherin，α-catenin and β-catenin detected by immunohistochemistry(IHC)，Western blotting(WB) and their semi-quantitative analysis results in four groups of rats(×200)

A.正常對照組；B.模型對照組；C.救必應小劑量組；D.救必應大劑量組。①與正常對照組比較，χ2=-2.680(IHC)，t=0.106(WB)，P<0.05；②與模型對照組比較，χ2=-3.385(IHC)，t=1.276(WB)，P<0.01；③與模型對照組比較，χ2=-2.765(IHC)，t=0.098(WB)，P<0.05。圖4 免疫組化法(IHC)和免疫印跡法(WB)檢測4組大鼠CDX-2蛋白水平及其半定量分析結果(×200) A.normal control group；B.model control group；C.Ilex rotunda Thunb.low dose group ；D.Ilex rotunda Thunb.high dose group.①Compared with normal control group，χ2=-2.680(IHC)，t=0.106(WB)，P<0.05； ②Compared with model control group，χ2=-3.385(IHC)，t=1.276(WB)，P<0.01； ③Compared with model control group，χ2=-2.765(IHC)，t=0.098(WB)，P<0.05.Fig.4 CDX-2 detected by immunohistochemistry(IHC)，Western blotting(WB) and their semi-quantitative analysis results in four groups of rats(×200)

2.5救必應水提物對造模大鼠血漿D-乳酸的影響 正常對照組、模型對照組和救必應小、大劑量組血漿D-乳酸分別為(22.100±8.084)，(44.715±13.809)，(30.565±6.590)，(26.284±8.702) μmol·L-1。與正常對照組比較，模型對照組大鼠血漿D-乳酸升高(t=-9.063，P<0.01)，提示造模大鼠腸通透性增加，腸黏膜屏障受損；與模型對照組比較，救必應小、大劑量組血漿D-乳酸降低(t=-31.983，P<0.05；t=-1.544，P<0.01)。表明救必應水提物能抑制吲哚美辛所致的腸通透性增高，有助于恢復腸屏障功能，促進腸黏膜損傷修復。

3 討論

胃腸黏膜損傷是臨床常見病變，其中非甾體抗炎藥是導致胃腸黏膜損傷的常見因素。報道顯示，在膠囊內窺鏡檢查者中76.3%服用非甾體抗炎藥的受試者發現了小腸黏膜的糜爛或潰瘍性病變[8]。救必應在嶺南地區廣泛用于治療胃腸病變，但其作用機制特別是對小腸病變的干預作用研究較少，本研究在非甾體抗炎藥吲哚美辛所致大鼠小腸黏膜損傷模型上，觀察救必應防治腸黏膜損傷的作用及機制。

細胞間連接(緊密連接、粘附連接、縫隙連接和橋粒等)是維持腸黏膜屏障的關鍵因素，其中緊密連接和粘附連接對維護腸黏膜屏障的作用尤為突出。細胞間連接控制著細胞旁轉運途徑的通透性，從而調節腸道屏障通透性[9-10]。臨床研究發現，炎癥性腸病患者在活動期緊密連接功能下調，其超微結構和蛋白組成被改變，并引起腸道通透性增加[11]。本研究結果表明，救必應水提物對吲哚美辛所致大鼠小腸黏膜損傷有防治作用，作用機制與其提高造模大鼠小腸黏膜緊密連接蛋白(ZO-1、Occludin和Claudin-1)和黏附連接蛋白(E-cadherin、α-catenin和β-catenin)表達有關；川陳皮素、廣藿香提取物等有效組分能通過調節緊密蛋白的功能維持腸上皮屏障的完整性和通透性，從而減輕潰瘍性結腸炎的癥狀[12]，本研究結果與之有相似之處，提示細胞間連接蛋白是調理脾胃中藥的作用靶點之一。

血漿D-乳酸是反映腸道通透性的指標，其在克羅恩病、缺血性腸病等多種消化系統疾病均升高[13]。緊密連接蛋白能反映腸道屏障完整性。結合腸通透性指標血漿D-乳酸能更好反映腸屏障功能。本研究結果表明，吲哚美辛誘導的大鼠小腸黏膜損傷模型不但導致黏膜細胞連接蛋白表達下降，還可致血漿D-乳酸升高，臨床胃腸病變患者也有類似表現[14]；救必應不但能提高造模大鼠小腸黏膜細胞連接蛋白表達，還能降低造模大鼠血漿D-乳酸水平，表明救必應可通過改善腸屏障功能而起腸黏膜保護作用。

CDX-2為腸特異性轉錄因子，能調節Rho-GEFs轉錄從而激活Rho信號級聯，導致肌動蛋白細胞骨架的重組和粘附連接的增強[15]。腸上皮特異性缺乏CDX-2的小鼠出現巨噬細胞浸潤和促炎級聯反應的激活，導致慢性炎癥反應[16]。本研究結果表明，吲哚美辛誘導的大鼠小腸黏膜損傷模型黏膜CDX-2表達下降，而救必應能提高造模大鼠小腸黏膜CDX-2表達，且有研究報道黃芩素、黃芩苷等清熱解毒中藥成分通過激活CDX-2而間接激活孕烷X受體，減輕小鼠實驗性潰瘍性結腸炎[17]，本實驗結果與之有相似之處。

本研究表明，救必應可通過作用于小腸黏膜緊密連接蛋白(ZO-1、Occludin和Claudin-1)和粘附連接蛋白(E-cadherin、α-catenin和β-catenin)、腸特異性轉錄因子CDX-2、腸通透性指標(血漿D-乳酸)等而防治小腸黏膜損傷，為探討救必應腸黏膜損傷修復作用及機制提供了參考，也豐富了對嶺南中藥救必應的認識。本研究僅對救必應水提物進行動物水平的初步機制研究，后續可考慮對其藥效物質基礎等其他方面開展研究。