復方肺毒清顆粒的制備工藝及質量標準*

張聰子，張金玲，杜光，王維武，姜瓊，夏松柏，陳輝，甘露珍，徐金軍，章登政，傅勃，饒志威

(1.咸寧市中心醫院、湖北科技學院附屬第一醫院藥學部，咸寧 437100；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院藥學部，武漢 430030；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院脾胃病科，長沙 410000)

復方肺毒清顆粒由防風、炒白術、魚腥草、赤芍、柴胡、桔梗、浙貝母、冬桑葉、川桂枝、炒白芍、板藍根、生甘草等12味中藥組成，具有辛溫解表、清熱解毒、宣肺止咳功效。方中柴胡作為君藥，有祛風清肺、抵御疫毒之功。2020年初新型冠狀病毒肺炎(簡稱新冠肺炎)疫情暴發后，該方經湖北省咸寧市新冠肺炎疫情防控指揮部醫療專家組討論通過，在咸寧地區推薦使用。在咸寧市中心醫院確診的117例患者中，服用103例，使用率88.03%；在咸寧市第一人民醫院確診的223例患者中，服用200例，使用率89.69%；嘉魚縣醫療機構初期確診的患者中有127例使用，治愈41例，治愈率32.28%，且無死亡病例；同時在中醫防治新冠肺炎中具有較高使用頻次，在抗擊新冠肺炎疫情中發揮了積極作用[1-3]。臨床應用過程中，由于中藥復方合劑多采用傳統煎煮方式給藥，患者用藥依從性差。因此，本實驗將該方制備成復方肺毒清顆粒，并進行質量標準研究，報道如下。

1 儀器與試藥

1.1試藥 防風(批號：190601)、炒白術(批號：201001)、魚腥草(批號：200701)、赤芍(批號：191201)、柴胡(批號：191201)、桔梗(批號：200701)、浙貝母(批號：191201)、冬桑葉(批號：200101)、川桂枝(批號：200101)、炒白芍(批號：191201)、板藍根(批號：190501)、生甘草(批號：201001)均購自安徽省亳州市坤源醫藥有限公司，藥材經咸寧市中心醫院主管中藥師孟婷鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》2020年版一部規定。

糊精(安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號：200308)、甜菊糖(安徽山河藥用輔料股份有限公司，批號：200308)、柴胡皂苷a(含量：94.80%，批號：110777-201912，購自中國食品藥品檢定研究院)；乙腈(批號：202889)、甲醇(批號：203074)為色譜級，均購自美國Fisher chemical公司。

1.2儀器 Thermo UltiMate3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司)；DSH-50-1電子水分測定儀(上海奧平科學儀器制造有限公司)；ZP-200振蕩器(蘇州培英實驗設備有限公司)；TDL-60B低速離心機(上海安亭科學儀器廠)；GLTQ-50L多功能提取濃縮罐(上海格翎環境科技有限公司)；101-2AB電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；YOKO-BD薄層電動點樣儀(武漢藥科新技術開發有限公司)；ZY-600U薄層色譜自動成像分析系統(北京先驅威鋒技術開發公司)。

2 方法與結果

2.1復方肺毒清顆粒的制備 處方組成為：防風、炒白術、魚腥草、赤芍、柴胡、浙貝母、冬桑葉、川桂枝、炒白芍、板藍根各10 g，桔梗5 g，生甘草6 g，總劑量111 g，水煎服(加水量為藥材量的5.4倍)，每日2劑，早晚各1次。

稱取處方量各藥材飲片，分別加入一定量水，置多功能提取器內，采用水回流提取法提取3次，得到含固率為29.3 %的干膏，粉碎，備用。將干浸膏、糊精、甜菊糖按照一定比例混合，制粒，干燥，整粒。本成品檢驗合格后制成單包裝顆粒，每袋裝量10 g，貼標簽。

2.2顆粒評價指標的測定

2.2.1成型率的計算 將制備好的顆粒稱質量，先過篩孔內徑2.00 mm(一號)篩，再過篩孔內徑0.18 mm(五號)篩，收集能通過篩孔內徑2.00 mm篩，但不能通過篩孔內徑0.18 mm的顆粒，稱質量，計算成型率。

2.2.2溶化率的測定 在干燥至恒質量的10 mL離心管中加入精密稱量的顆粒，加入沸水5 mL，持續攪拌5 min，3000 r·min-1離心15 min(離心半徑r=13 cm)，棄上清液，將殘渣在80 ℃條件下干燥至恒質量，精密稱定質量，計算溶化率。

2.2.3休止角的測定 采用固定漏斗法，將漏斗固定于水平放置的坐標紙上高1.5 cm的位置(H)，緩慢將顆粒沿漏斗壁倒入最上面的漏斗中，直到形成的顆粒圓錐尖端接觸到漏斗口為止，測算圓錐底部的直徑(2R)，計算休止角tgα=H/R。成型性、溶化率、休止角的權重系數各設為45%，30%，25%，綜合評分=45%×(成型率/最大成型率)+30%×(溶化率/最大溶化率)+25%×(最小休止角/休止角)[4]。

2.2.4堆密度的測定 取本品顆粒適量，沿壁緩慢加入干燥至恒質量的10 mL量筒中，待顆粒表面至10 mL刻度處，稱質量，減去干燥空量筒質量即為顆粒的質量，平行測定3次，計算堆密度。堆密度ρ=顆粒質量/容積×100%。

2.2.5吸濕性的測定 配制氯化鈉飽和溶液，置于玻璃干燥器中，25 ℃恒溫平衡48 h。精密稱定本品顆粒2 g，平行3份，置于干燥至恒質量的稱量瓶中，于24，48，72，96，120，144，168 h后稱質量，計算吸濕百分率。吸濕率越低顆粒越不容易吸潮，質量也越穩定[5-6]。吸濕百分率=(吸濕后顆粒質量-吸濕前顆粒質量)/吸濕前顆粒質量×100%。

2.2.6水分測定 采用水分測定儀平行測定3次。

2.3處方篩選

2.3.1藥物與輔料比例考察 稱取干浸膏粉20.3 g 3份，分別稱取糊精10.2 g(藥輔比1：0.5)、14.2 g(藥輔比1：0.7)、18.3 g(藥輔比1：0.9)，將干浸膏粉與糊精混合，過篩孔內徑0.25 mm使其充分混勻；按一定比例混合，加入適宜的黏合劑制備軟材，擠壓過篩制粒，干燥30 min。整粒后遵循《中華人民共和國藥典》2020年版對顆粒成型率、溶化率、休止角等指標進行綜合評價，以此優選最佳藥輔比。

根據復方肺毒清顆粒制備工藝，按處方稱取各藥材飲片30付，總質量為3330 g，置多功能提取器內，總共提取3次。第1次加10倍量水，煎煮2 h(水沸騰后計時)，第2次加8倍量水，煎煮2 h，第3次加6倍量水，煎煮1 h。合并水煎液，濾液濃縮至相對密度約1.08(60～70 ℃)的稠膏4160 g，將稠膏烘干，得到干膏1218 g(含固率為29.3 %)。采用濕法制粒，篩選藥輔比，綜合評分顯示最高的藥輔比為1：0.9，但是為減少患者服用量，增加患者的順應性，選擇1：0.5比例作為最佳藥輔比(表1)。取20份處方量的干浸膏做小試顆粒，得到水分為3.19%的肺毒清顆粒(每袋10 g)。

表1 藥物與輔料比例考察 Tab.1 Investigation on drug-to-excipient ratio

2.3.2矯味劑選擇 為尋找最佳比例，選用木糖醇作為矯味劑，進行以下實驗：取3 g干膏粉6份，分別加入木糖醇0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60 g攪拌均勻。請6名實驗員品嘗口感，均認為口感較苦。另選擇甜菊糖作為矯味劑，稱取1.0：0.5藥輔比顆粒1 g，加入甜菊糖0.01 g，相同6名實驗員品嘗口感，均認為口感稍甜，具香甜味，故選用1% 甜菊糖作為矯味劑。

2.3.3小試工藝結果 本品顆粒劑粒度均勻，顆粒顏色由淺棕至深棕色，《中華人民共和國藥典》2020年版規定，能通過篩孔內徑2.00 mm但不能通過篩孔內徑0.18 mm的顆粒及粉末所占百分比<15%符合標準，本品顆粒成型率為96.31%，符合《中華人民共和國藥典》規定；休止角是考察藥物的流動性，休止角越小，顆粒劑的流動性越好[7]，一般認為，α≤30 °時流動性好，α≤40 °時可以滿足生產過程中對流動性的需求，本品顆粒的休止角為15.47 °，顆粒的流動性較好；顆粒劑的成型率、溶化率、休止角、堆密度具體結果見表2。

表2 小試生產的復方肺毒清顆粒(批號20201201)的檢測結果 Tab.2 Test results of compound Feiduqing granules produced in a small scale(batch No.20201201) n=3

吸濕性檢測7個時間點，每24 h檢測1次，分別是24，48，72，96，120，144，168 h測定顆粒劑的吸濕性，計算吸濕百分率。實驗結果表明，小試生產的復方肺毒清顆粒，吸濕擬合回歸曲線方程為Y=-0.00 043X2+0.137 7X+1.995 7，R值為0.994 1，其擬合程度較好，平衡吸濕時間為137.7 h，平衡吸濕率為12.80%，見表3。

表3 復方肺毒清顆粒(批號20201201)在不同時間的吸濕百分率 Tab.3 Moisture absorption rate of compound Feiduqing granules(batch No.20201201) at different times %

2.3.4制劑成型工藝驗證 采用濕法制粒，根據藥輔比篩選，以干膏粉為原料，以糊精和甜菊糖為輔料，75%乙醇、純化水適量作潤濕劑，干膏粉：糊精：甜菊糖=1：0.50：0.01的藥輔比進行制劑，上述原輔料均過篩孔內徑0.25 mm(60目)后，在篩孔內徑1.18 mm(14目)標準篩上擠壓，制濕顆粒，干燥30 min，整粒后分單包裝。按照顆粒劑相關檢查項目對其進行粒度、水分、溶化率檢查，結果顯示：該小試顆粒的粒度均<15%，水分均<5%，顆粒均完全溶化，符合《中華人民共和國藥典》2020年版顆粒劑相關檢查要求。

2.4柴胡的薄層鑒別

2.4.1供試品溶液的制備 精密稱取本品顆粒2.0 g，研缽中研細，加入甲醇12 mL溶解，超聲處理15 min，濾過，揮干后得濾渣，加入純化水1.5 mL溶解濾渣，溶解后加入水飽和正丁醇溶液5 mL，置于分液漏斗中震蕩萃取3次，將正丁醇合并，揮干正丁醇溶液得濾渣，濾渣加甲醇定容至1.5 mL，作為供試品溶液[8]。

2.4.2對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a對照品0.1 mg，加入甲醇2 mL，制成濃度為0.05 mg·mL-1對照品溶液。

2.4.3陰性溶液、對照藥材溶液的制備 取不含柴胡藥材的陰性顆粒及柴胡藥材，同“2.4.1”項方法制成陰性對照溶液和對照藥材溶液。

2.4.4鑒別 吸取供試品溶液及陰性對照溶液5 μL，對照藥材溶液及對照品溶液10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯：乙醇(95%)：水=8：2：1的比例為展開劑進行展開，晾干，噴2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液顯色劑，于105 ℃ 加熱至斑點清晰，置紫外燈(波長365 nm)下檢視[9]。供試品與對照藥材及柴胡皂苷a對照品相應的色譜位置上顯示相同的黃色熒光斑點，而陰性對照無相應的斑點，見圖1。

1—3.樣品；4.柴胡；5.柴胡皂苷a對照品；6.陰性對照品。圖1 柴胡皂苷a的薄層色譜鑒定 1—3. sample；4.bupleuri radix；5.saikosaponin a reference substance；6.negative reference.Fig.1 TLC identification of saikosaponin a

2.5柴胡皂苷a的含量測定

2.5.1色譜條件 色譜柱：6 L sciences Inc ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A為乙腈，流動相B為水，梯度洗脫：0～40 min，85%→40%B；40～45 min，40%→85%B；柱溫40 ℃；流速1 mL·min-1；檢測波長為210 nm，進樣：20 μL，在此條件下，樣品中柴胡皂苷a與其他成分色譜峰完全分離，和相鄰色譜峰的分離度>1.5。

2.5.2對照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a 5.17 mg，加入甲醇5 mL溶解，配成柴胡皂苷a 1.034 mg·mL-1的母液，密封，放入4 ℃冰箱，備用。

2.5.3供試品溶液的制備 精密稱取樣品10.013 0 g，研缽中研細，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，密塞，超聲(功率：200 W，頻率：40 kHz)30 min，離心取上清液10 mL，揮干后加甲醇定容至5.0 mL即為供試品溶液。

2.5.4陰性溶液的制備 精密稱取缺柴胡的樣品顆粒，同“2.5.3”項方法制成陰性對照品溶液。

2.6方法學考察

2.6.1專屬性實驗 在選定的色譜條件下，分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀測定，結果柴胡皂苷a標準品與供試品中其他成分色譜峰完全分離，在與對照品色譜相應的保留時間上有相同的色譜峰，而陰性溶液無干擾，見圖2。

2.6.2線性關系實驗 將母液濃度為1.034 mg·mL-1柴胡皂苷a標準品，等比稀釋得0.064 6，0.129 3，0.258 5，0.517 0，1.034 0 mg·mL-15個濃度樣品，每個連續進樣2次，每次20 μL。以含量為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，柴胡皂苷a線性回歸方程為Y=110.26X+0.935 7，R=1，在0.06～0.98 mg·mL-1濃度范圍內，含量與峰面積線性關系良好。

1.柴胡皂苷a。圖2 陰性對照品、柴胡皂苷a對照品、供試品溶液高效液相色譜圖

1.saikosaponin a.

Fig.2 HPLC chromatograms of negative reference，saikosaponin a reference and test sample

2.6.3精密度實驗 精密吸取柴胡皂苷a對照品溶液20 μL，連續進樣6次，測定色譜峰面積，計算RSD值。結果顯示柴胡皂苷a峰面積RSD為0.21%，表明儀器精密度良好。

2.6.4穩定性實驗 取復方肺毒清顆粒，按“2.5.3”項下制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣20 μL，記錄峰面積，結果顯示：柴胡皂苷a的 RSD為1.493%，表明溶液在24 h內穩定。

2.6.5重復性實驗 取復方肺毒清顆粒(批號：20201201)6份，按“2.5.3”項下分別制備供試品溶液，按上述色譜條件測定柴胡皂苷a的含量，每個樣品進樣2次，得到柴胡皂苷a的平均含量為0.192 mg·g-1，RSD為0.679%。

2.6.6回收率實驗 取已知含量樣品(批號：20201201)6份，精密稱定每份2 g；各份樣品中加入一定量的對照品溶液，按“2.5.3”項下分別制備供試品溶液，再按“2.5.1”項色譜條件進樣測定含量，分別進樣20 μL，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果平均回收率為97.49%，RSD為1.34%，見表4。

表4 柴胡皂苷a加樣回收率實驗結果 Tab.4 Recovery test results of saikosaponin a

2.7樣品測定結果 取不同批次復方肺毒清顆粒(批號：20201201，20201202，20201203)，按供試品制備方法制備樣品溶液，進樣量20 μL，按“2.5.1”項色譜條件進行柴胡皂苷a含量測定，記錄峰面積，按照外標法計算含量。結果顯示樣品中(每袋10 g)柴胡皂苷a平均含量為0.192 mg·g-1，最低濃度為0.191 mg·mL-1，RSD為0.679%。

3 討論

因中藥復方制劑藥味多，本研究預實驗中，參照《中華人民共和國藥典》2020年版中的色譜條件，結合文獻，選擇薄層色譜鑒別所需展開劑，顯色劑比例。對復方肺毒清顆粒處方中的桔梗以桔梗皂苷d為對照品進行薄層色譜鑒別，在對照品色譜相應的位置上，主斑點不顯色或顯色不明顯，且與其他斑點未分離，方法不可用，因此未納入本實驗質量標準。柴胡以柴胡皂苷a作對照品進行薄層色譜鑒別，分離效果好，在對照品相應的色譜位置上顯示相同的黃色熒光斑點，而陰性對照無干擾。故將薄層色譜法鑒別方中柴胡皂苷a納入本質量標準，且分離方法可靠。因條件受限，今后課題組將進一步擴大對處方中各組分進行色譜條件的考察優化及鑒別。

提取工藝選用水回流提取法進行提取，操作簡單，符合我國傳統的中藥提取方法。復方肺毒清顆粒處方有效成分復雜，柴胡作為君藥，具有疏散退熱、升舉陽氣、疏肝解郁等功效[10-11]。本研究中標志物的選擇，遵循了中醫方劑中“君臣佐使”的原則，采用高效液相色譜法對方中的柴胡皂苷a進行含量測定[12]，參考相關文獻，對流動相比例進行篩選，通過觀察不同條件及圖譜的變化，最終選擇了最適宜的流動相比例及洗脫梯度。結果表明方法易于操作，重復性較好。

綜上所述，本研究建立的質量標準方法可行，能有效控制復方肺毒清顆粒的質量。