褪黑素對H2O2誘導的成骨細胞氧化應激損傷的保護作用

劉合棟 任茂賢 李楊 蔣文凱 周志 楊民

皖南醫學院第一附屬醫院/弋磯山醫院創傷骨科，安徽 蕪湖 241001

隨著社會人口老齡化的不斷發展，骨質疏松癥發病率日益升高[1]。研究[2]表明，氧化應激在骨質疏松癥發病中占有重要地位?；钚匝踔饕删€粒體產生，過量的活性氧在降低成骨細胞功能的同時可以激活破骨細胞，導致骨重建失衡從而引起骨質疏松。此外，活性氧增加可導致線粒體膜電位降低，引起細胞凋亡[3]。因此，保護成骨細胞免受氧化應激損傷對于預防骨質疏松癥具有重要意義。

褪黑素是一種由松果體分泌、受下丘腦調節的無毒性吲哚胺，主要調節晝夜節律，同時具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等功能[4]。有研究[5]表明，在非腫瘤細胞中褪黑素通過激活SIRT1發揮作用，而SIRT1的作用靶點之一是p66SHC，SIRT1上調可以降低p66SHC的表達[6]。同時，p66SHC可以將氧化信號轉變成活性氧，并促進線粒體氧化信號轉變成凋亡信號[7]。由此推測褪黑素可能通過調節SIRT1/p66SHC信號通路來抑制氧化應激引起的成骨細胞的凋亡。因此，本研究擬使用體外H2O2誘導成骨細胞氧化應激損傷模型來探討褪黑素對成骨細胞氧化應激損傷的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DMEM-F12培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗均購于美國Gibco公司；褪黑素(melatonin，MT)、CCK8試劑、BCIP/NBT堿性磷酸脂酶顯色試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒均購于碧云天生物技術有限公司；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、0.2 %茜素紅、十六烷基吡啶均購于索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購買于南京建成生物工程研究所；凋亡檢測試劑盒購買于貝博生物科技有限公司；抗體SIRT1、p66SHC、Bax、Bcl2、BMP2、RUNX2、β-actin購買于Affinity公司；手術器械由皖南醫學院弋磯山醫院創傷骨科提供。礦化誘導培養基由F12-DMEM完全培養基加入10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L維生素C配置而成。

1.2 實驗方法

1.2.1成骨細胞的分離、純化及鑒定：取24 h內新生SD大鼠乳鼠浸泡于75 %乙醇中20 min，移入無菌操作臺，使用眼科剪和眼科鑷分離顱骨，刮去骨膜及骨縫間結締組織并用含雙抗的PBS沖洗，直至骨塊變白。將骨塊剪成1 mm×1 mm大小骨片，加入5 mL 0.25 %胰酶消化10 min，棄胰酶，加入5 mL 0.5 % I型膠原酶震蕩消化20 min，棄消化液后再次加入5 mL 0.5 % I型膠原酶在37 ℃恒溫下消化90 min。消化完畢后用等量含血清的F12-DMEM培養基終止消化，無菌篩網過濾，將碎骨片接種于T25培養瓶中倒置培養，4 h后正置培養瓶。成骨細胞經礦化誘導培養基培養7 d、21 d后，按照試劑盒說明書分別進行ALP和茜素紅染色，以鑒定原代成骨細胞是否提取成功。

1.2.2氧化應激模型的建立：將第三代成骨細胞按5×103/孔接種于96孔板中，待細胞完全貼壁后更換成含100、200、400、800 μmol/L H2O2的培養基繼續培養2、3、4、5、6 h，結束后每孔加入10 μL CCK8 試劑并孵育2 h，使用酶標儀檢測450 nm處的吸光度。依據說明書計算細胞存活率。

1.2.3氧化應激指標檢測：將第三代成骨細胞以1×106/孔接種于6孔板中，將細胞分為四組：對照組、H2O2組(400 μmol/L H2O2作用4 h)、MT組(100 μmol/L褪黑素預處理24 h然后用400 μmol/L H2O2作用4 h)、EX527組(MT預處理前用10 μmol/L EX527預處理2 h)。結束后收集細胞，按照試劑盒說明書測定SOD活性及MDA含量，同時將四組細胞孵育DCFH-DA探針，熒光顯微鏡記錄四組細胞圖像并測定ROS熒光強度。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡：細胞經不同干預措施處理后，使用凋亡檢測試劑盒對細胞進行FITC和PI染色，結束后經流式細胞儀上機檢測各組細胞凋亡率。

1.2.5ALP及茜素紅染色：細胞經不同干預措施干預7 d、21 d后，按照試劑盒說明書分別行ALP及茜素紅染色。同時，用ALP活性檢測試劑盒檢測各組細胞ALP活性，用十六烷基吡啶溶解鈣結節，用酶標儀測定570 nm處吸光度。

1.2.6Western Blot檢測蛋白水平：用RIPA裂解液收集各組細胞，并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組蛋白濃度并計算30 μg蛋白所需上樣量。樣本經SDS-PAGE凝膠電泳分離不同分子量蛋白質，然后轉膜。轉膜結束后用5 %BSA封閉2 h，然后將膜置于含有SIRT1(1∶1 000)、p66SHC(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl2(1∶1 000)、BMP2(1∶1 000)、RUNX2(1∶1 000)、β-actin(1∶500)的抗體盒中，4 ℃搖床孵育過夜。次日將膜用TBST洗凈并放入對應二抗中孵育2 h。孵育完成后用TBST洗凈并用ECL發光液顯影，使用Image J測定灰度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 成骨細胞的提取與鑒定

如圖1所示，骨塊貼壁3 d后，倒置顯微鏡下可見骨塊蓬松，細胞零星的從骨塊邊緣爬出，呈飽滿長梭形(圖1B)，7 d后鋪滿整個瓶底(圖1C)。ALP染色顯示細胞被染成藍紫色(圖1 D)，茜素紅染色視野中可見數量不一、大小不等的橘紅色圓形鈣結節(圖1E)，提示原代成骨細胞提取成功。

圖1 原代成骨細胞的提取與鑒定

2.2 H2O2對成骨細胞增殖的影響及氧化應激指標的檢測

如圖2A所示，成骨細胞存活率隨著H2O2濃度的升高和作用時間的延長而逐漸下降，在400 μmol/L濃度下作用4 h存活率為52 %，因此采用此濃度與時間建立氧化應激模型。經H2O2、褪黑素、EX527處理后，各組細胞ROS含量、SOD活性、MDA含量如圖2B～圖2E所示，結果表明H2O2處理后ROS升高，熒光顯著增強，細胞腫脹變圓，SOD活性降低，MDA含量升高，表明H2O2處理后成骨細胞氧化應激水平升高。褪黑素處理緩解了H2O2對成骨細胞的氧化應激損傷，而EX527能夠逆轉褪黑素對H2O2誘導的成骨細胞氧化應激損傷的保護作用。

圖2 H2O2對成骨細胞增殖的影響及氧化應激指標的檢測

2.3 各組細胞ALP活性、礦化能力及凋亡的變化

細胞經H2O2、褪黑素、EX527處理后，成骨細胞ALP及茜素紅染色結果如圖3A、3B所示，定量分析結果如圖3C、3D所示，凋亡率如圖3E所示。結果表明H2O2誘導氧化應激后，成骨細胞ALP活性及礦化能力下降，凋亡率升高；褪黑素預處理能夠緩解H2O2誘導的氧化應激損傷，使成骨細胞ALP活性及礦化功能增強，凋亡率降低；而EX527能夠逆轉褪黑素的上述功能。

圖3 各處理因素對成骨細胞ALP活性、礦化能力及凋亡的影響

2.4 不同處理措施干預后對細胞蛋白表達的影響

細胞經不同處理措施干預后，蛋白表達如圖4所示。結果表明，H2O2處理后成骨細胞BMP2、RUNX2、Bcl2、SIRT1表達降低，Bax、p66SHC表達升高。褪黑素處理能夠緩解上述蛋白表達的變化。而SIRT1抑制劑EX527能夠逆轉褪黑素的上述功能。

圖4 各處理措施對成骨細胞蛋白表達的影響

3 討論

骨重建由成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收來維持，當成骨細胞的骨形成不足以彌補破骨細胞的骨吸收時就會導致骨質疏松[8]。本研究中，成骨細胞經褪黑素預處理后與H2O2組比增強了ALP活性、礦化功能，降低了ROS、MDA含量，增強了SOD活性，減少了凋亡率，增加了BMP2、RUNX2、Bcl2、SIRT1蛋白的表達，降低了Bax、p66SHC蛋白的表達，SIRT1抑制劑EX527能夠逆轉褪黑素的上述作用，表明褪黑素通過調節SIRT1/p66SHC通路來抑制H2O2誘導的成骨細胞氧化應激損傷并促進成骨。

H2O2作為ROS主要成分之一，由于具有相對穩定性和長時間不帶電等特性被廣泛用于誘導建立氧化應激損傷模型[9]。本研究顯示，H2O2處理后成骨細胞活性降低，細胞腫脹變圓，ROS含量增加，表明細胞趨于凋亡。過量產生ROS將激活氧化應激并破壞脂質、核酸、蛋白質等生物大分子，引起脂質過氧化[10]。其產物通過調節NF-κB通路、MAPKs通路、PKC通路來誘導細胞發生凋亡[11]。同時，ROS的大量產生將消耗細胞內過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶等抗氧化物質，引起抗氧化酶活性降低。本研究結果顯示，細胞經H2O2處理后ROS含量、MDA含量增加，SOD活性降低，細胞凋亡增加，表明H2O2處理成功誘導了成骨細胞的氧化應激損傷。

本研究中，褪黑素通過SIRT1/p66SHC通路抑制氧化應激并促進成骨，這與Chen等[12]的研究結果相似，其研究顯示褪黑素通過上調SIRT1抑制氧化應激，促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化從而促進成骨。Zhou等[13]研究表明褪黑素通過調節SIRT3/SOD2通路抑制線粒體氧化應激增加OVX大鼠假體周圍骨量。最近研究[14]表明，褪黑素激活SIRT1/PGC1α/SIRT3通路保護異丙腎上腺素誘導的心肌細胞損傷，大腦p66SHC基因缺失的小鼠顯示出SIRT3活性增強[15]。由此筆者推測褪黑素可能通過SIRT1/p66SHC軸調節SIRT3/SOD2軸發揮抗氧化應激功能。此外，體內研究[16]發現褪黑素MT1受體缺陷小鼠骨量正常，而MT2受體缺陷的小鼠表現出低骨量，表明褪黑素主要通過MT2受體調節骨量。褪黑素還能通過改善炎癥因子的表達增加OVX大鼠的骨密度[17]。體外研究[18]表明褪黑素能夠上調神經肽Y和神經肽Y受體的表達，促進骨髓間充質干細胞的增殖與遷移，從而促進骨折愈合。這些結果表明褪黑素能夠通過受體介導和非受體依賴(抗氧化和抗炎作用)作用機制來預防骨降解，促進骨形成。

SIRT1是一種NAD+依賴的III類組蛋白脫乙酰酶，通過對組蛋白、轉錄因子等多種底物進行去乙?；瘉碚{節細胞周期、炎癥、凋亡、自噬等生物過程[19]。研究[6]表明，在內皮細胞中，SIRT1過表達能夠使組蛋白H3發生去乙?；?，減少乙?；M蛋白H3與p66SHC啟動子的結合，從而降低p66SHC的轉錄。p66SHC是shcA基因家族中的一個亞型，在誘導細胞氧化應激和凋亡中發揮重要作用。當細胞感知氧化應激時，p66SHC從細胞質轉移到線粒體并氧化細胞色素C，催化氧還原為H2O2，導致ROS升高[20]。升高的ROS觸發線粒體通透性轉換孔(MPTP)開放，引起線粒體腫脹，線粒體外膜破裂，電子傳遞鏈蛋白復合體活性下降，并釋放促凋亡因子引起細胞凋亡[21]。本研究中，褪黑素上調SIRT1的同時降低了p66SHC的表達，同時SOD活性增強，ROS含量、MDA含量降低，Bcl2表達升高而Bax表達降低；而SIRT1抑制劑EX527能夠抑制褪黑素的上述作用。這些結果提示褪黑素通過SIRT1/p66SHC通路抑制H2O2誘導的成骨細胞氧化應激損傷。

綜上所述，褪黑素可能通過調節SIRT1/p66SHC通路來抑制H2O2誘導的成骨細胞的氧化應激損傷并促進成骨。但本研究尚需進一步的動物實驗來驗證其機制。