肺泡灌洗液二代基因測(cè)序在鸚鵡熱衣原體感染肺炎診斷中的應(yīng)用

周柳如，方錦龍，張平

東莞市人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 東莞 523000

0 引言

鸚鵡熱衣原體屬于一種嚴(yán)格胞內(nèi)寄生的需氧革蘭陰性菌，是介于細(xì)菌與病毒之間的特殊病原微生物，宿主主要是鳥(niǎo)類(lèi)、家禽、家畜等，可經(jīng)密切接觸、氣溶膠途徑發(fā)生人畜傳染[1]。鸚鵡熱衣原體感染人體后最常累及的臟器是肺部，但由于鸚鵡熱衣原體所致肺炎較為罕見(jiàn)，臨床仍缺乏快速、精準(zhǔn)的診斷手段。二代基因測(cè)序（NGS）技術(shù)為近年新興的一種DNA/RNA檢測(cè)技術(shù)，具有檢測(cè)速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于重癥或疑難病例病原學(xué)鑒別診斷[2]。但關(guān)于NGS技術(shù)應(yīng)用于鸚鵡熱衣原體感染肺炎診斷中的相關(guān)報(bào)道較少。鑒于此，本研究對(duì)我院收治的13例鸚鵡熱衣原體感染肺炎患者的肺泡灌洗液進(jìn)行NGS檢測(cè)，分析NGS技術(shù)對(duì)鸚鵡熱衣原體感染肺炎的診斷價(jià)值，旨在為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年3月-2021年4月東莞市人民醫(yī)院收治的13例鸚鵡熱衣原體感染肺炎患者作為研究對(duì)象，13例患者中男10例，女3例；年齡45～81歲，平均（62.98±7.07）歲；10例患者有家禽接觸史，包括3例接觸雞鴨，4例接觸鴿子，3例接觸其他鳥(niǎo)類(lèi)，剩余3例接觸史不明確；基礎(chǔ)疾病史：7例合并冠心病，6例合并高血壓，5例合并2型糖尿病，2例合并慢性乙肝，6例合并房顫。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合鸚鵡熱衣原體肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，有咳嗽、咳痰、呼吸困難等臨床表現(xiàn)；②在呼吸道樣本中檢測(cè)到鸚鵡熱衣原體病原微生物，或微免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到抗鸚鵡熱衣原體IgM抗體滴度1∶16；③患者自愿接受檢查，簽訂了知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他肺部疾病；②不配合樣本采集者。

1.2 方法

1.2.1 肺泡灌洗液NGS技術(shù)檢測(cè)

①肺泡灌洗液采集：在局麻下行支氣管肺泡灌洗術(shù)。即置入纖維支氣管鏡，將其嵌于肺葉目的片段，往肺內(nèi)注入溫的滅菌生理鹽水20mL，再負(fù)壓抽吸10mL灌洗液到無(wú)菌專(zhuān)用容器中送檢；②檢測(cè)：應(yīng)用BGISEQ-100平臺(tái)（深圳華大基因股份有限公司）進(jìn)行NGS檢測(cè)，具體方法：a.DNA提取：取3mL肺泡灌洗液，經(jīng)玻璃珠混合震蕩后使用TIANamp Mico DNA Kit試劑盒[DP316，天根生化科技（北京）有限公司]，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA。b.構(gòu)建文庫(kù)和測(cè)序：取提取所得的DNA，使用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)控文庫(kù)插入片段大小，使用QubitdsDNA Hs Assay Kit（Thermo Fisher Scienti6c Inc.）質(zhì)控DNA文庫(kù)濃度，經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)。環(huán)化后的文庫(kù)經(jīng)滾環(huán)復(fù)制生成DNA納米球。制備好的DNA納米球加載到測(cè)序芯片，使用BGISEQ-50進(jìn)行測(cè)序。c.數(shù)據(jù)分析：獲得測(cè)序數(shù)據(jù)后將長(zhǎng)度小于35bp、低質(zhì)量的數(shù)據(jù)去除以獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。應(yīng)用BWA軟件將測(cè)序所得的病原序列與病原庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，然后再去宿主化扣除正常人群中出現(xiàn)的微生物群落背景，來(lái)找到所檢測(cè)臨床標(biāo)本中可能致病的微生物。結(jié)果判斷：NGS檢測(cè)得到的微生物讀數(shù)，至少比其他微生物高2倍，則鑒定的微生物被分類(lèi)為確認(rèn)的病原體。

1.2.2 肺泡灌洗液傳統(tǒng)病原檢測(cè)

取“1.2.1”步驟中10mL肺泡灌洗液，應(yīng)用德國(guó)布魯克質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定，使用法國(guó)生物梅里埃公司ⅥIEK-2、美國(guó)BD公司M-50法國(guó)生物梅里埃公司的VITEK-2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀，美國(guó)BD公司M-50自動(dòng)微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)。進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定和藥敏試驗(yàn)。

1.2.3 痰液NGS檢測(cè)

指導(dǎo)患者深呼吸用力咳嗽，將咳出的痰液保存到無(wú)菌容器內(nèi)送檢。NGS檢測(cè)方法與“1.2.1”相同。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較肺泡灌洗液NGS、肺泡灌洗液傳統(tǒng)病原測(cè)定、痰樣本NGS檢測(cè)鸚鵡熱衣原體的陽(yáng)性率。②比較三種檢測(cè)方法的結(jié)果回報(bào)耗時(shí)。③隨訪記錄13例患者的預(yù)后轉(zhuǎn)歸情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果比較

肺泡灌洗液NGS對(duì)鸚鵡熱衣原體的陽(yáng)性檢出率顯著高于傳統(tǒng)病原測(cè)定和痰樣本NGS（χ2=9.370，P=0.009），見(jiàn)表1。

表1 不同檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

2.2 不同檢測(cè)方法的結(jié)果回報(bào)耗時(shí)比較

肺泡灌洗液NGS、痰樣本NGS的檢測(cè)結(jié)果回報(bào)耗時(shí)顯著短于傳統(tǒng)病原測(cè)定（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同檢測(cè)方法檢測(cè)所需時(shí)間比較

2.3 預(yù)后轉(zhuǎn)歸情況

13例患者確診為鸚鵡熱衣原體感染后，11例予以多西環(huán)素治療，2例采用莫西沙星治療，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)性配合其他抗生素。經(jīng)氧療、藥物抗感染、呼吸支持等處理后，11例患者病情明顯好轉(zhuǎn)出院，2例治療無(wú)效，這考慮為患者伴有其他并發(fā)癥。其中1例患者因伴有大面積腦梗死，家人放棄治療辦理出院。另1例患者伴有多種基礎(chǔ)疾病，基礎(chǔ)狀態(tài)較差，住院期間反復(fù)發(fā)熱，合并膿毒血癥，呼吸循環(huán)功能衰竭，最終導(dǎo)致死亡。

3 討論

最早于1879年歐洲就首次報(bào)道了人類(lèi)可感染鸚鵡熱衣原體，鸚鵡熱主要是指感染鸚鵡熱衣原體而導(dǎo)致的人畜共患病，人類(lèi)通過(guò)接觸鳥(niǎo)類(lèi)的尿液、糞便或其他排泄物或通過(guò)氣溶膠途徑可傳播感染，進(jìn)展成流感樣疾病、肺炎[4]。實(shí)際上，鸚鵡熱在臨床中并不常見(jiàn)，而且有調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，亞洲國(guó)家鸚鵡熱患病率顯著低于澳大利亞、歐洲[5]。另由于本病診斷缺乏敏感性、特異性較高的檢測(cè)方法，具體流行病學(xué)特征尚未明確。

人體感染鸚鵡熱衣原體后，主要累及肺部，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱惡寒、干咳、頭痛、咽喉疼痛等非特異性的流感癥狀，病情嚴(yán)重的可發(fā)展為重癥肺炎，發(fā)生意識(shí)模糊、呼吸困難等。因此，從癥狀體征來(lái)看，鸚鵡熱衣原體感染肺炎缺乏特異性癥狀，臨床診斷較難。在影像學(xué)診斷方面的特異性也不高，有研究報(bào)道[6]，鸚鵡熱衣原體肺炎患者中有90%病例的肺部X線片可見(jiàn)異常，肺內(nèi)出現(xiàn)不同程度滲出和實(shí)質(zhì)性病變，與其他類(lèi)型肺炎無(wú)明顯的差異。

當(dāng)前臨床診斷鸚鵡熱主要通過(guò)臨床表現(xiàn)、鳥(niǎo)類(lèi)接觸史進(jìn)行初步疾病診斷，但在實(shí)際臨床中部分患者并沒(méi)有鳥(niǎo)類(lèi)接觸史，極易引起了漏診、誤診。而本病確診方法為傳統(tǒng)微生物檢測(cè)，主要是通過(guò)涂片鏡檢、微生物培養(yǎng)法、PCR擴(kuò)增等方法鑒別采集的樣本中的病原種類(lèi)及其定量信息，但該法耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)（一般需要5～7天），且結(jié)果極易受抗菌藥物使用所影響，存有一定的局限性[7]。另有文獻(xiàn)指出[8]，鸚鵡熱衣原體的分離、培養(yǎng)效率較低，傳統(tǒng)病原學(xué)測(cè)定陰性概率較大，不利于診治。隨著醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，為了提高病原微生物檢測(cè)的效率及其精確度，二代基因測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。二代基因測(cè)序技術(shù)主要是通過(guò)對(duì)宏基因組的樣本開(kāi)展大規(guī)模測(cè)序，以獲得基因組核酸序列，再借助生物信息工具進(jìn)行定量分析，獲得詳細(xì)的病原基因信息[9]。也有研究證實(shí)[10]，二代基因測(cè)序技術(shù)具有無(wú)培養(yǎng)樣本、檢測(cè)時(shí)間短、測(cè)定靈敏度高、可測(cè)定未知病原體等優(yōu)點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)微生物檢測(cè)的不足之處，為臨床疾病診治提供新的可靠依據(jù)。本研究將二代基因測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于鸚鵡熱衣原體感染肺炎診斷中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是應(yīng)用肺泡灌洗液還是痰樣本，應(yīng)用二代基因測(cè)序技術(shù)所需耗時(shí)均短于傳統(tǒng)病原學(xué)測(cè)定，提示應(yīng)用NGS測(cè)序技術(shù)檢測(cè)報(bào)告快，能夠顯著降低診斷時(shí)間，利于臨床及時(shí)早期治療。

此外，本研究還對(duì)不同呼吸道樣本的NGS檢測(cè)及傳統(tǒng)病原學(xué)測(cè)定效果進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺泡灌洗液、痰樣本NGS測(cè)定的陽(yáng)性率顯著高于傳統(tǒng)病原測(cè)定，說(shuō)明NGS技術(shù)的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)優(yōu)于傳統(tǒng)病原學(xué)。而且肺泡灌洗液NGS的陽(yáng)性率優(yōu)于痰樣本，這是因?yàn)榉闻莨嘞匆簺](méi)有口腔、上呼吸道定植菌的干擾[11]。因此，應(yīng)用肺泡灌洗液進(jìn)行NGS檢測(cè)對(duì)鸚鵡熱具有較高的診斷價(jià)值。

鸚鵡熱衣原體為衣原體科病原微生物，主要應(yīng)用抑制致病菌DNA、蛋白質(zhì)合成的抗菌藥物，如四環(huán)素類(lèi)（如多西環(huán)素等）、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素（如莫西沙星等）[12-13]。本研究中13例患者經(jīng)NGS測(cè)定發(fā)現(xiàn)為鸚鵡熱衣原體所致肺炎后，及時(shí)調(diào)整治療方案，11例采用多西環(huán)素治療，2例采用莫西沙星治療，結(jié)果11例患者病情好轉(zhuǎn)出院，另2例因伴有其他系統(tǒng)并嚴(yán)重并發(fā)癥而自動(dòng)放棄救治或死亡，提示NGS技術(shù)檢測(cè)能夠快速明確疾病診斷，最大限度縮短了患者病程，利于有效改善患者的預(yù)后，也可減少后續(xù)非必要的治療費(fèi)用，能夠在一定程度上抵消NGS檢測(cè)費(fèi)用高的問(wèn)題，同時(shí)還可以減少不必要抗菌藥物應(yīng)用，避免耐藥現(xiàn)象。

綜上所述，與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)相比，應(yīng)用肺泡灌洗液NGS對(duì)鸚鵡熱衣原體感染肺炎有更高的檢出率，且其檢測(cè)耗時(shí)短，利于臨床早期、準(zhǔn)確診治，有效改善患者的預(yù)后。但本研究納入病例數(shù)較少，只有13例肺泡灌洗液進(jìn)行NGS檢測(cè)，今后研究仍需擴(kuò)大樣本量，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間以進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論。