美洲鰻鱺幼魚飼料中魚油的適宜添加水平研究

瞿 倩 趙盼月 蔡國鶴 翟少偉

(集美大學水產學院, 鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心, 廈門 361021)

鰻鱺(Anguilla), 俗稱河鰻, 又稱白鱔、青鱔等,屬鰻魚目、鰻鱺科魚類, 廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區; 其肉質鮮美, 營養豐富, 具有一定藥膳價值, 是公認的水產珍品, 一直享有“水中人參”的美譽[1]。自20世紀90年代中期以來, 鰻鱺已經成為我國重要的水產養殖種類, 連續多年在單一出口創匯水產品品種中排名第一。當前我國鰻鱺的養殖主要分布在南方地區, 養殖品種以日本鰻鱺和美洲鰻鱺為主。其中, 日本鰻鱺多在廣東省主要采用土池模式養殖, 美洲鰻鱺主要在福建省及其他省份采用水泥池精養模式, 一般在投喂前將粉狀配合飼料制作成面團狀飼料的過程中添加魚油。

魚油是魚粉加工過程中產出的副產品, 富含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)酸等n-3高不飽和脂肪酸(HUFA)。研究表明, 魚類飼料中添加適量魚油, 可以滿足生長所需的能量和必需脂肪酸, 提高飼料利用率, 其在維持細胞膜的流動性、增強免疫、提高抗氧化能力及調節脂類代謝等方面發揮著重要的作用[2—5]。因此, 富含HUFA的魚油一直被作為水產動物飼料優質脂肪源, 尤其是鰻鱺養殖中使用的最主要脂肪來源。由于魚油中HUFA含量高, 極易氧化變質, 往往在鰻鱺養殖場將粉狀配合飼料加水制作成面團狀飼料時直接添加。目前, 已有日本鰻鱺(Anguilla japonica)[6]、歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)[7]、澳洲鰻鱺(Auguilla australis)[8]及花鰻鱺(Anguilla marmorata)[9]飼料中適宜脂肪水平的報道。但美洲鰻鱺(Anguilla rostrata)飼料中適宜的魚油添加水平還未確定, 也未見飼料中適宜脂肪水平的報道。因此, 本試驗以我國主要的鰻鱺養殖品種-美洲鰻鱺幼魚為試驗對象, 通過研究飼料中添加不同水平魚油對其生長性能、體成分及肝臟脂肪代謝酶的影響, 確定適宜的魚油添加水平, 為魚油在美洲鰻鱺養殖中的科學應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

試驗用魚為美洲鰻鱺幼魚。挑選800尾規格一致、體格健壯, 平均體重為(8.34±0.12) g的試驗魚,隨機分為5個處理組, 分別投喂基礎飼料中添加0(對照組)、3%(FO3組)、6%(FO6組)、9%(FO9組)和12%(FO12組)魚油的試驗飼料, 每組4個重復, 每個重復40尾魚。試驗期56d。

1.2 試驗飼料與飼養管理

基礎飼料為福建正源飼料有限公司生產的黑仔鰻商品飼料, 主要營養成分為粗蛋白47.60%、粗脂肪5.60%、粗灰分12.90%和粗纖維0.40%。魚油購于福州開發區高龍實業有限公司。試驗在福建正源飼料有限公司養殖實驗室進行, 1200尾試驗魚隨機分到20個PVC養殖缸(注水量為250 L, 每缸60尾)中暫養2周后, 選擇出規格接近的800尾用于養殖試驗, 每缸放魚40尾。期間將基礎飼料按料水重量比1﹕1.2混合制作成團狀飼料投喂。正式試驗每次投喂時, 先將粉狀商品飼料稱重, 再分別與飼料重量0%、3%、6%、9%和12%的魚油, 及飼料重量1.2倍左右的水一起混合均勻制成團狀飼料投喂。每天飽食投喂2次(5: 00和18: 00), 根據魚體重、攝食情況及時調整投喂量。投喂30min 后, 將殘餌吸出, 收集并記錄殘餌重。在試驗期間, 每日檢測水質、水溫和記錄試驗魚的攝食情況等, 保持水溫26—28℃, 溶解氧濃度>7.6 mg/L, pH為7.8—8.2, 氨氮濃度<0.25 mg/L。

1.3 樣品采集與組織勻漿液的制備

在試驗結束后, 美洲鰻鱺幼魚禁食24h, 將每缸魚撈出稱總重并記錄尾數, 用丁香酚和無水乙醇按比例1﹕4配置成50 mg/L的混合液麻醉5min左右, 每缸隨機取6尾魚, 用紗布擦拭魚體表面水分。在冰浴上用無菌剪刀解剖分別取出腸道和肝臟, 用生理鹽水漂洗裝入滅菌的凍存管中, 液氮速凍, 保存于?80℃冰箱。用于測定腸道消化酶和肝臟脂肪代謝酶指標分析。將保存于–80℃冰箱中美洲鰻鱺幼魚腸道和肝臟取出, 在冰上解凍。按組織重(g)與0.86%生理鹽水(mL)體積比1﹕9放入10 mL離心管中, 用組織研磨儀(Tissuelyser-24, 上海凈信實業發展有限公司, 中國)在冰浴條件下勻漿(勻漿時間30s/次, 間隙20s, 連續3—5次), 將制備好的組織勻漿用4℃離心機離心(3000 r/min, 10min), 取上清液分裝到離心管中備用。每缸另隨機取5尾魚(去除內臟)裝入標記分組自封袋中, 置于?20℃保存, 用于體成分的測定。

1.4 測定指標及方法

生長性能指標生長性能指標計算公式如下:

式中,W0(g)為平均每尾魚初始體重;Wt(g)為平均每尾魚末體重;FC(g)為平均每尾魚攝食飼料總量(風干樣重);t(d)為飼喂天數;Ni為初始魚尾數;Nf為試驗終末魚尾數。

腸道消化酶活性腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性均使用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒進行測定, 操作步驟均按說明書進行。

全魚體成分試驗魚全魚營養成分含量采用AOAC[10]的方法測定, 主要如下: 水分含量測定采用105℃烘干恒重法, 粗蛋白質含量的測定采用全自動定氮儀(Kjeltec8400, FOSS公司), 粗脂肪含量測定采用索氏提取法, 粗灰分含量測定采用550℃馬弗爐灼燒法。

肝臟脂肪代謝酶水平或活性脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase, FAS)和乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase, ACC)采用上海江萊生物科技有限公司生產的試劑盒測定; 脂蛋白酯酶(Lipoprotein lipase, LPL)和肝臟肝脂酶(Hepatic lipase, HL)活性采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒進行測定, 操作步驟均按說明書進行。

1.5 數據統計與分析

試驗數據均以平均值±標準差(Mean±SD)表示,用SPSS 22.0分析軟件進行單因素方差分析(Oneway ANOVA, LSD), 若存在顯著差異, 則采用Duncan法進行多重比較,P<0.05表示差異顯著。WGR、FE與飼料魚油添加水平間的關系采用Linear Regression模塊進行二次回歸分析, 顯著水平為P<0.05。

2 結果

2.1 飼料中添加不同水平魚油對美洲鰻鱺幼魚生長性能的影響

由表 1可知, 飼料中添加魚油顯著影響美洲鰻鱺幼魚WGR、FR和FE(P<0.05)。隨著魚油添加水平的增加,WGR、FR和FE均呈先上升后下降的趨勢, FO6組上述指標數值均為最高。將WGR、FE與飼料中魚油添加水平進行二次回歸分析, 得出最佳WGR、FE時飼料中添加魚油水平分別為6.78%和6.43%(圖 1和圖 2), 此時鰻鱺配合飼料中脂肪水平分別為11.59%和11.30%。試驗期間, 每組鰻鱺的成活率為100%。

圖1 美洲鰻鱺幼魚增重率與飼料中魚油添加水平的關系Fig. 1 Relationship between WGR and dietary fish oil supplementation level of juvenile American eels

圖2 美洲鰻鱺幼魚飼料效率與飼料中魚油添加水平的關系Fig. 2 Relationship between FE and dietary fish oil supplementation level of juvenile American eels

表1 不同處理組美洲鰻鱺幼魚生長性能Tab. 1 Growth performance of juvenile American eels in different treatment groups (mean±SD, n=4)

2.2 飼料中添加不同魚油水平對美洲鰻鱺幼魚腸道消化酶活性的影響

由表 2可知, 飼料中魚油添加水平對美洲鰻鱺幼魚腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均有顯著影響(P<0.05)。飼料中添加魚油, 可顯著降低腸道蛋白酶和淀粉酶活性(P<0.05), 不同魚油添加組間兩種酶活性無顯著差異(P>0.05); 可顯著提高腸道脂肪酶活性(P<0.05), FO6組、FO9組和FO12組間脂肪酶活性接近(P>0.05)。

表2 不同處理組美洲鰻鱺幼魚的腸道消化酶活性Tab. 2 Intestinal digestive enzyme activities of juvenile American eels in different treatment groups (mean±SD, n=4; U/mg prot)

2.3 飼料中添加魚油水平對美洲鰻鱺幼魚體成分的影響

由表 3可知, 飼料中添加魚油顯著影響美洲鰻鱺幼魚全魚粗蛋白質和粗脂肪含量(P<0.05)。隨著飼料中魚油添加水平的增加, 美洲鰻鱺全魚粗蛋白質的含量呈逐漸下降趨勢, FO12組數值上最低; 全魚粗脂肪含量呈逐漸上升趨勢, FO12組數值上最高。飼料中添加魚油對全魚水分和粗灰分的影響不顯著(P>0.05)。

表3 不同處理組美洲鰻鱺幼魚的體成分Tab. 3 Body composition of juvenile American eels in different treatment groups (mean±SD, n=4; %)

2.4 飼料中魚油添加水平對美洲鰻鱺幼魚肝臟脂肪代謝酶活性的影響

由表 4可知, 飼料中添加魚油顯著影響美洲鰻鱺幼魚肝臟FAS、LPL和HL活性(P<0.05)。隨著飼料中魚油添加水平的增加美洲鰻鱺幼魚肝臟FAS活性呈降低趨勢, FO9組和FO12組FAS活性顯著降低(P<0.05); LPL和HL活性呈升高趨勢, 僅FO12組兩種酶活性顯著降低(P<0.05)。飼料中添加魚油對ACC活性無顯著影響(P>0.05)。

表4 不同處理組美洲鰻鱺幼魚的肝臟脂肪代謝酶水平或活性Tab. 4 Levels or activities of enzymes related to lipid metabolism in liver of juvenile American eels in different treatment groups(mean±SD, n=4)

3 討論

3.1 飼料中魚油添加水平對美洲鰻鱺幼魚生長性能的影響

目前還鮮見不同魚油添加水平對鰻鱺生長性能影響的報道。在本試驗中, 適量添加魚油顯著提高美洲鰻鱺幼魚WGR、FR和FE, 且隨飼料中魚油添加水平增加,WGR、FR和FE呈先升高后下降的趨勢。這種適量添加魚油促進生長, 過量添加魚油抑制生長的現象在斑石鯛(Oplegnathus punctatus)[11]、黃鱔(Monopterus albus)[12]、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[13]、芙蓉鯉鯽(Furong crucian carp)[14]、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)[15]、異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)[16]、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[17]和褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)[18]等研究中也有類似的報道。而在花鰻鱺[9]、三倍體虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[19]、雜交黃顙魚(Peltebagrus fulvidraco×P. vachelli)[20]、泰國草魚(Puntius gonionotus)[21]、黃姑魚(Nibea albiflora)[22]和大黃魚(Larimichthys croceus)[23]等研究中, 隨著飼料中魚油添加水平升高, 魚類生長未出現降低現象。導致這些差異的原因可能與試驗魚類品種、脂肪需要量、魚油添加水平、魚油組成、基礎飼料脂肪水平、養殖環境等方面的差異有關, 具體情況還有待進一步查明。從上述不同魚類添加魚油的研究中可以看出, 飼料中適量添加魚油大都促進魚體生長, 可能與飼料中添加的魚油為魚類提供充足且高效的能量, 減少蛋白質供能的消耗, 發揮“脂肪節約蛋白質效應”有關[24—26]。

在本試驗中, 美洲鰻鱺飼料中魚油添加水平6.78%和6.43%時,WGR和FE達最高值。此時飼料中脂肪水平為11.59%和11.30%, 這與歐洲鰻鱺適宜脂肪水平為20%[7]、日本鰻鱺適宜脂肪水平為16%[6]和澳洲鰻鱺適宜脂肪水平為15%[8]相比, 美洲鰻鱺幼魚適宜脂肪水平相對較低; 但高于花鰻鱺的8%適宜脂肪水平[27]。上述研究中不同品種鰻鱺飼料中適宜脂肪水平的變化情況與于海振[28]報道250 g、500 g兩個規格不同品種鰻鱺肌肉中粗脂肪含量高低的順序一致, 從高到低依次為歐洲鰻鱺>日本鰻鱺>美洲鰻鱺>花鰻鱺。可見, 鰻鱺飼料中適宜的脂肪水平與肌肉中粗脂肪含量密切相關。

此外, 與適宜魚油添加水平組相比, 添加高水平的魚油(9%和12%)顯著抑制美洲鰻鱺生長性能。這種現象在斑石鯛[11]、黃鱔[12]、半滑舌鰨[13]、芙蓉鯉鯽[14]、斜帶石斑魚[15]、異育銀鯽[16]、尼羅羅非魚[17]和褐菖鲉[18]等飼料添加過量魚油的研究中也有類似報道。研究表明, 魚類與陸生動物一樣為能而食, 其攝食量與飼料能量含量成反比; 當飼料脂肪水平升高時, 飼料的能量含量也相應增加,魚類的攝食量則減少, 降低了魚類腸道對營養素的消化和吸收效率, 尤其是吸收過多的脂肪導致蛋白質利用率下降, 魚類生長減緩[29]。這也說明魚類對脂肪的利用有一定限度, 脂肪節約蛋白質的本質僅限于把蛋白質的分解供能降低到最低限度, 而對于蛋白質的其他功能則是脂肪無法替代[29,30]。

3.2 飼料中魚油添加水平對美洲鰻鱺幼魚腸道消化酶活性的影響

在本試驗中, 添加魚油使美洲鰻鱺幼魚腸道脂肪酶活性顯著升高。這與斜帶石斑魚[15]、三倍體虹鱒[19]飼料中添加不同水平的魚油研究結果一致。隨著魚油添加水平的上升美洲鰻鱺幼魚腸道脂肪酶活性先升高后趨于相對穩定, 在斜帶石斑魚[15]、褐菖鲉[18]、巴丁魚(Pangasianodon hypophthalmus)[31]和細鱗鮭 (Brachymystax lenok)[32]等飼料中添加不同水平魚油后腸道脂肪酶活性也有類似的變化。而三倍體虹鱒隨著魚油添加水平增加腸道脂肪酶活性呈先升高后降低趨勢[19]; 吉富羅非魚飼料中添加過量魚油水平可顯著降低前、中腸脂肪酶活性[33]。本試驗中添加較高魚油水平未觀察到美洲鰻鱺幼魚脂肪酶活性受到明顯抑制, 可能與魚類對魚油利用的能力、魚油添加水平和脂肪需求量等方面的差異有關; 添加魚油使美洲鰻鱺幼魚腸道蛋白酶和淀粉酶活性降低, 與點籃子魚(Siganus guttatus)飼料中添加魚油后降低腸道蛋白酶和淀粉酶研究結果類似[34]; 在幼魚和成魚階段石斑魚添加9%和12%魚油后降低腸道淀粉酶也有相同的結果[15]。然而不同魚油添加水平間美洲鰻鱺幼魚腸道蛋白酶和淀粉酶活性接近, 類似的結果在黃顙魚[20]和絲尾鳠(Hemibagrus wyckioides)[35]飼料中添加魚油研究中出現。這說明在一定魚油水平基礎上繼續添加對魚類腸道蛋白酶和淀粉酶活性影響不大。從添加魚油對魚類腸道消化酶影響的變化情況來看, 肉食性魚類尤其是幼魚階段在脂肪源充足時, 優先利用脂肪作為能量來源, 通過提高脂肪酶的活力而增加對脂肪的消化吸收; 減少蛋白質氨基酸及碳水化合物作為能量的消耗, 相應降低腸道蛋白酶和淀粉酶的活性。

3.3 飼料中魚油添加水平對美洲鰻鱺幼魚體成分的影響

魚體組成是反映魚類生理狀態和營養水平的重要指標。飼料中主要營養素水平的變化都會對魚體組成產生影響。在本試驗中, 添加6%、9%和12%魚油顯著提高美洲鰻鱺幼魚全魚粗脂肪含量,而添加3%、6%和9%魚油對全魚粗蛋白質含量無顯著影響。這些結果與尼羅羅非魚[17]、泰國草魚[21]、黃姑魚[22]和大黃魚[23]添加魚油對全魚體成分影響的報道相似, 說明在飼料中添加一定水平的魚油可促進全魚脂肪沉積[36], 而不影響魚體中蛋白質的沉積。但本試驗中僅添加12%的高水平魚油顯著降低美洲鰻鱺幼魚全魚粗蛋白含量, 與黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)飼料中添加10%魚油后全魚粗蛋白含量變化相同[37], 說明添加過高魚油添加可減少魚體蛋白質的蓄積。

3.4 飼料中魚油添加水平對美洲鰻鱺幼魚肝臟脂肪代謝酶水平或活性的影響

FAS在魚類肝臟合成脂肪酸的過程中起著重要作用[38], 其水平隨著飼料脂肪水平的升高而降低[39]。在本試驗中, 添加9%和12%水平的魚油顯著降低美洲鰻鱺幼魚肝臟FAS水平, 與黑鯛添加10.0%魚油[37]、道氏虹鱒添加10.95%和14.09%魚油[40]和尼羅羅非魚添加3.0%、6.0%、9.0%、12.0%和15.0%魚油[17]后FAS水平降低的結果一致。研究表明, 魚油富含EPA和DHA, 屬于n-3系列不飽和脂肪酸，是FAS酶及相關基因的抑制劑[39,41]。在道氏虹鱒添加7.86%、10.95%和14.09%魚油[39], 斜帶石斑魚添加7.0%、10.5%和14.0%魚油[42], 及大黃魚添加12%魚油也發現肝臟FAS基因表達豐度顯著降低[43]。此外, 高水平n-3系列不飽和脂肪酸還可通過降低乙酰輔酶羥化酶和提高激素敏感脂肪酶的活性[44], 降低脂類合成相關基因和蛋白的表達水平[45], 從而抑制脂質合成。

LPL和HL是魚類肝臟中參與脂肪分解代謝過程中的兩個關鍵酶。LPL主要催化血漿中乳糜顆粒和極低密度酯蛋白, 將甘油三酯分解成脂肪酸和甘油[46]。HL主要參與高密度脂蛋白的重構和乳糜微粒殘骸、低密度脂蛋白的代謝以及膽固醇的逆向轉運[47]。在本試驗中, 僅12%魚油添加水平顯著提高美洲鰻鱺幼魚肝臟LPL和HL活性, 與道氏虹鱒添加10.95%和14.09%魚油[40]、許氏平鲉(Sebastes schlegeli)添加9.0%和12.0%魚油[48]、大菱鲆(Scophthalmus maximu)添加12.94%魚油[49]、梭魚(Chelon haematocheilus)添加12%和15%[26]和尼羅羅非魚添加6.0%、9.0%、12.0%和15.0%[17]魚油后, 肝臟LPL和HL活性與對照組相比的變化情況類似。而幼魚和成魚階段石斑魚添加高水平魚油使這兩種酶的活性顯著降低[15]; 在尼羅羅非魚魚和多鱗鱚(Sillago sihama)等飼料中添加高水平魚油也發現,LPL和HL活性與適宜魚油添加水平組相比顯著下降[17,50]。這可能是不同品種魚類在脂肪利用能力、脂肪需要量、魚油添加水平和基礎飼料脂肪水平等方面差異導致的。但總的來看, 添加一定水平的魚油可提高肝臟脂肪分解酶的活性, 可能是飼料中添加魚油使高水平的n-3多不飽和脂肪酸通過激活PPARɑ上調LPL靶基因表達所致[51]。魚油調節魚類肝臟HL活性的研究鮮見報道, 具體機制還有待進一步研究。

4 結論

在本試驗條件下, 飼料中適量添加魚油可提高美洲鰻鱺幼魚生長性能、腸道脂肪酶活性和全魚粗脂肪含量, 調節肝臟脂肪代謝酶水平或活性; 美洲鰻鱺幼魚飼料中適宜的魚油添加水平推薦為6.43%—6.78%, 此時飼料中脂肪水平為11.30%—11.59%。