低氧脅迫和螺原體感染對中華絨螯蟹存活和細胞凋亡的影響

汪雅琴 黃 晨 耿 超 繆艷陽 陸銀月 顧 偉 王 文 孟慶國

(南京師范大學海洋科學與工程學院, 江蘇省水生甲殼動物病害重點實驗室, 南京 210023)

水體溶解氧(Dissolved oxygen, DO)來源于大氣中的氧氣與水面接觸和水生生物的光合作用, 由于來源不穩定, 水體中溶解氧的含量并不高, 且易受外界影響而擴散慢[1]。正常情況下, 認為發生低氧時水體溶氧量小于2 mg/L[2]。人為因素和自然因素是導致水低氧的重要原因。自然因素包括溫度的驟變、晝夜交替、季節和水流速度的變化等。但人為影響是造成低氧的更重要原因, 隨著人口的增加, 大量營養物質被排入水體, 水體富營養化, 水中藻類大量繁殖, 加劇了溶解氧的消耗。此外, 養殖業快速發展, 但人工管理尚不完善, 未將殘留飼料和排泄物及時處理, 這類物質在高溫時節的腐敗分解使得水體處于缺氧狀態[3]。陳付菊等[4]研究發現重度低氧脅迫會使青海湖裸鯉肝血竇擴張, 血竇內紅細胞數量增多, 肝細胞出現空泡化, 并且空泡化程度隨著低氧時間的增長而加深。蔡超等[5]研究表明, 低氧脅迫能使鯽血紅蛋白和血糖濃度升高,還會影響鰓、血液、肝臟、心臟和腦中與能量代謝和轉化相關的酶的活力。吳煜國等[6]發現, 長期低氧脅迫會影響斑馬魚的卵巢發育, 進一步影響卵母細胞的發育成熟。由以上相關實驗可以看出, 低氧脅迫在水生生物的生活與生存中有著重要影響。

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)又被稱為河蟹,是我國傳統的水產珍品, 螺原體所引起的“顫抖病”對河蟹產業造成了嚴重危害。而關于低氧是否會對螺原體感染河蟹產生影響, 這一問題亟待研究,因為河蟹螺原體的靶細胞為血淋巴細胞, 所以本文將低氧脅迫與螺原體共同作用于河蟹, 探究它們的協同作用, 將河蟹的血淋巴細胞分離出來進行研究,觀察其在低氧狀態下的免疫力和生理指標變化, 為河蟹養殖低氧耐受提供新的思路和理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細菌

實驗所用河蟹來自江蘇省揚州市, 每只河蟹重(25±5) g, 將其在28℃, 溶氧量(6.0±0.5) mg/L的養殖箱中暫養, 檢測河蟹螺原體為陰性, 以用于后續實驗。

將實驗所用螺原體用R2培養基在30℃恒溫培養箱中培養, 實驗所用均為生長至對數期的螺原體。

1.2 螺原體與低氧刺激后河蟹螺原體拷貝數和死亡率計算

為了探究低氧脅迫對螺原體致死率的影響,(1) 設置不同部分組別: PBS+常氧組(N PBS), PBS+低氧脅迫組(H PBS), 螺原體+常氧組(N SE), 螺原體+低氧脅迫組(H SE), 每組設置兩個重復水槽, 每個水槽20只螃蟹。常氧組溶氧量為[(6.0±0.5) mg/L],低氧脅迫組溶氧量為(1.5±0.5) mg/mL, 使用溶氧儀(Bante821, China)實時監測各組水體含氧量。(2) 將對數期的螺原體12000 r/min離心10min, 去掉上清,收集備用。(3) 將螺原體用適量PBS緩沖液重懸, 在實驗組的河蟹第五附肢處注射200 μL螺原體, 對照組的河蟹注射200 μL PBS。(4) 每日記錄河蟹死亡情況。

為了探究低氧脅迫對河蟹體內螺原體拷貝數的影響, (1) 設置與上步實驗相同的組別。(2) 在螺原體感染河蟹后的2d、4d、6d和8d取500 μL血細胞與抗凝劑等比例混合, 每個樣品取3—5只河蟹,提取DNA并檢測濃度, 將所得DNA的濃度均稀釋至10 ng/μL。 (3) 進行RT-qPCR, 具體反應體系及程序參考陸銀月等[7]的文獻。所用上游引物(10 μmol/L): Q-SE-F: 5′-CGCAGACGGTTTAGCA AGTTTGGG-3′; 下游引物(10 μmol/L): Q-SE-R: 5′-AGCACCGAACTTAGTCCGACAC-3′。使用以下公式計算螺原體拷貝數:

式中,y為實驗所得Ct值,x為lgcopy number。

1.3 血淋巴細胞PI染色

(1) 用PBS緩沖液將PI溶液稀釋, 使終濃度為10 μmol/L。(2) 在開始實驗的2d、4d、6d和8d, 分別隨機挑選3只河蟹, 取血細胞與500 μL抗凝劑等比例混合, 離心收集血細胞。(3) 用PBS緩沖液重懸細胞。(4) 加入10 μL PI溶液重懸細胞, 在37℃避光孵育20min。(5) 孵育結束后, 用PBS重懸細胞, 洗去殘留的PI溶液, 使用熒光顯微鏡觀察細胞染色情況[7]。

1.4 血淋巴細胞FITC/PI檢測

磷脂結合蛋白可與外翻的復合神經酸(Phosphatidylserine, PS)結合, 通過與PI共染色, 區分凋亡細胞(綠色熒光)與壞死細胞(紅色熒光)[7]以檢測早期細胞凋亡。

(1) 在實驗后的2d、4d、6d和8d隨機挑選3只河蟹, 取血細胞與500 μL抗凝劑等比例混合, 離心收集血細胞。(2) 用PBS緩沖液重懸細胞。(3) 用100 μL 1×Binding Buffer將細胞吹打混勻。(4) 加入5 μL PI Staining Solution和5 μL Annexin V-FITC,混勻后在室溫下孵育10min, 再用400 μL 1×Binding Buffer將細胞吹打混勻, 置于顯微鏡下觀察。

1.5 血淋巴細胞的線粒體膜電位檢測

線粒體膜電位的變化可以判斷細胞是否發生凋亡, Rhodamine123進入線粒體基質是以穿過細胞膜的方式, 線粒體膜的完整性會在血淋巴細胞發生凋亡時遭到破壞, 從而使線粒體跨膜電位發生紊亂,可以觀察到Rhodamina 123發出黃綠色熒光[7]。

(1)用DMSO配制5 mmol/L的Rhodamina 123試劑。(2) 在實驗后的2d、4d、6d和8d抽取河蟹血細胞與500 μL抗凝劑等比例混合, 使用緩沖液吹洗細胞一到兩次并收集細胞。(3)用100 μL Rhodamina 123對細胞進行重懸, 在37℃避光孵育30min。(4) 再次用緩沖液重懸細胞1—2次, 置于顯微鏡下觀察。

1.6 HE染色

在低氧脅迫處理后第8天, 從未注射螺原體的低氧脅迫組和常氧組中各隨機挑選3只河蟹, 在無菌環境下提取其肝胰腺組織和鰓組織, 并用適量4%動物組織固定液將其固定, 然后送至生物公司制備組織切片[7]。

2 結果

2.1 低氧脅迫對河蟹鰓組織和肝胰腺組織的影響

在低氧處理后第8天, 對河蟹的肝胰腺組織和鰓組織進行HE染色并觀察其結構變化。觀察相應結果顯示, 肝胰腺對照組(圖 1A)中, 肝細胞均勻分布, 結構穩定, 形態正常, 基底膜與上皮細胞緊密相連且厚度均勻; 而在肝胰腺實驗組(圖 1B)中, 肝胰腺呈彌散狀, 管腔外圍出現致密小空泡, 基底膜厚度增加并脫離上皮細胞。在鰓組織中, 常氧組(圖 1C)的鰓葉分布均勻, 排列整齊, 鰓軸結構完整, 形態穩定; 而在低氧組(圖 1D)中, 鰓軸結構遭到破壞, 但鰓葉損傷較小, 說明低氧處理主要影響鰓軸, 而對鰓葉影響較小。

圖1 低氧脅迫8d后對中華絨螯蟹肝胰腺和鰓組織結構HE染色(50 μm)Fig. 1 HE staining of hepatopancreas and gills of E. sinensis after 8d of hypoxia stress (50 μm)

2.2 低氧和螺原體刺激對中華絨螯蟹死亡率的影響

圖2顯示, 低氧脅迫和螺原體共同作用的實驗組死亡率增加, 在第10天時, 河蟹全部死亡; 在僅有螺原體刺激的組中, 河蟹于第6天開始死亡, 并在第9天死亡加劇, 死亡率在第10和第12天分別達到50%和70%; 在僅低氧處理的組中, 河蟹的死亡率在第5天后也逐日增加, 但增加的速度低于僅有螺原體處理的組; 而在對照組中, 相較于其他組, 河蟹死亡率較為低緩。以上結果表明, 被螺原體感染的河蟹死亡速度受低氧脅迫的影響加快, 死亡率升高。

圖2 低氧脅迫及螺原體侵染對中華絨螯蟹死亡率的影響Fig. 2 The mortality rate of crabs after hypoxia and S. eriocheiris infection

2.3 低氧脅迫對中華絨螯蟹血淋巴細胞中螺原體拷貝數的影響

為了研究低氧脅迫是否對螺原體的生長繁殖有影響, 使用RT-qPCR檢測中華絨螯蟹血淋巴細胞中的螺原體拷貝數變化。如圖 3所示, 在螺原體感染后, 相比于常氧組, 低氧組河蟹血淋巴細胞中的螺原體拷貝數明顯較高, 綜上所述, 河蟹受低氧脅迫后更容易被螺原體感染。

圖3 低氧脅迫對血淋巴細胞中螺原體拷貝數的影響Fig. 3 S. eriocheiris copy number in hemocytes after hypoxia

2.4 河蟹血淋巴細胞壞死(PI)受低氧及螺原體侵染的影響

利用PI染色技術來研究在低氧脅迫狀態下, 螺原體感染對河蟹血淋巴細胞壞死是否會產生影響。對受低氧脅迫和螺原體刺激后的河蟹于2d、4d、6d和8d分別取樣, 進行PI染色, 結果如圖 4所示, 隨著螺原體感染時間的推移, 帶紅色熒光細胞的數目逐漸增多。同時將帶紅色熒光細胞數與總細胞數進行統計, 結果見圖 5, 發現低氧脅迫和螺原體共同作用的實驗組第4天的血淋巴細胞壞死顯著高于對照組, 僅有螺原體刺激的實驗組細胞壞死狀況則無顯著變化, 綜上所述, 河蟹血淋巴細胞結構可能受低氧破壞, 從而導致血淋巴細胞壞死發生。

圖4 低氧脅迫及螺原體刺激對河蟹血淋巴細胞壞死(PI)的熒光檢測Fig. 4 Fluorescence detection of necrosis (PI) in hemocytes of E.sinensis after hypoxia and S. eriocheiris stimulation

圖5 低氧脅迫及螺原體刺激對河蟹血淋巴細胞壞死(PI)的紅色熒光占比Fig. 5 Red fluorescence percentage of necrosis (PI) in hemocytes of E. sinensis after hypoxia and S. eriocheiris stimulation

2.5 低氧脅迫及螺原體刺激下河蟹血淋巴細胞凋亡(FITC/PI)情況

根據細胞凋亡試劑盒對河蟹血淋巴細胞進行染色, 觀察在低氧脅迫和螺原體刺激下, 血淋巴細胞凋亡情況。對被低氧和螺原體刺激后的河蟹于2d、4d、6d和8d取樣, 進行熒光拍照與并統計熒光比例, 如圖 6所示, 螺原體感染前期, 細胞開始出現凋亡, 并且隨著感染時間的推移, 綠色熒光細胞和紅色熒光細胞數量均出現增多。如圖 7所示, 同對照組相比, 在低氧脅迫和螺原體刺激的共同作用下,實驗組在螺原體侵染前期凋亡現象并不明顯, 但在感染后第8天, 與對照組相比, 河蟹細胞凋亡率明顯升高, 這說明在低氧脅迫和螺原體刺激的共同作用下, 河蟹血淋巴細胞主動發生凋亡以適應環境變化。

圖6 低氧脅迫及螺原體刺激對河蟹血淋巴細胞凋亡(FITC/PI)的熒光檢測Fig. 6 Fluorescence Detection of Apoptosis (FITC/PI) in hemocytes of E. sinensis after hypoxia and S. eriocheiris stimulation

圖7 低氧脅迫及螺原體刺激對河蟹血淋巴細胞凋亡(FITC/PI)的綠色熒光占比Fig. 7 Green fluorescence percentage of apoptosis (FITC/PI) in hemocytes of E. sinensis after hypoxia and S. eriocheiris stimulation

2.6 低氧脅迫及螺原體侵染對河蟹血淋巴細胞線粒體膜電位(Rhodamine123)的影響

為研究低氧脅迫及螺原體刺激對河蟹血淋巴細胞線粒體膜電位是否有影響, 使用Rhodamine 123檢測河蟹血淋巴細胞的凋亡情況。如圖 8所示,在第 2天, 兩組帶綠色熒光的細胞均較少, 且與對照組相比, 隨著實驗時間推移, 每個實驗組中的熒光量都在逐漸增加。在圖 9中, 發現低氧脅迫和螺原體共同作用的組在第4、第6和第8天的熒光比例均高于對照組, 并且隨著感染時間的增加, 熒光比例呈現上升趨勢, 僅有螺原體刺激的組中, 熒光比也隨著感染時間的增長而增加, 且在第8天的時候, 顯著高于對照組, 相對于對照組, 僅受低氧刺激的實驗組無明顯差異。綜上所述, 河蟹受低氧和螺原體刺激后, 會為了適應環境變化而改變生存策略。

圖8 低氧脅迫及螺原體刺激對河蟹血淋巴線粒體膜電位的熒光檢測Fig. 8 Fluorescence detection of mitochondrial membrane potential (Rhodamine 123) in hemocytes of E. sinensis after hypoxia and S. eriocheiris stimulation

圖9 低氧脅迫及螺原體刺激對河蟹血淋巴細胞線粒體膜電位的綠色熒光占比Fig. 9 Green fluorescence percentage of mitochondrial membrane potential in hemocytes of E. sinensis after hypoxia and S.eriocheiris stimulation

3 討論

一般認為, 溶氧量為4 mg/L左右的水體是適宜中華絨螯蟹生長的環境, 低于2 mg/L溶氧量的水體環境會抑制河蟹的生長蛻殼和變態[8]。本研究發現, 河蟹在長期低氧脅迫狀態下, 死亡率和血淋巴細胞內螺原體拷貝數均顯著上升。與之相同的是,藍蟹(C. sapidus)幼體在低溶氧量狀態下的死亡率也顯著高于對照組[9]。由此可見, 低氧對水生生物的生存生活有著重要影響。

細胞凋亡(Apoptosis)是程序性細胞死亡的嚴格調控形式, 可觸發細胞的自我毀滅而不受任何外部影響。細胞的凋亡和壞死有著本質的區別, 細胞凋亡是一種主動死亡以維持內環境穩定的方式, 當外界環境變化, 細胞受到刺激, 體積縮小, 染色體濃縮,膜上的復合神經酸外翻, 形成能快速被巨噬細胞識別并吞噬的凋亡小體, 并且不會影響周圍細胞[10,11]。細胞壞死是外界環境劇烈變化, 強刺激下, 細胞會發生腫脹、破裂, 繼而引發周圍細胞感染炎癥[12]。多數研究表明, 大部分病原菌感染都能引起細胞凋亡和壞死, 由于感染鉤端螺旋體(Leptospira), 巨噬細胞的細胞周期停滯, 繼而發生凋亡[13]; 紅細胞的滲透性會被創傷弧菌溶細胞素破壞溶解, 從而誘導內皮細胞發生細胞凋亡[14]。中性粒細胞在小鼠被鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)[11]感染后發生凋亡, 并且隨著時間推移, 細胞壞死率逐漸上升。

在河蟹等無脊椎動物抵御細菌等外來病原體入侵的過程中, 先天免疫系統的作用至關重要, 血淋巴細胞更是其中的重要組成部分[15]。螺原體侵染河蟹的第一個靶細胞是血淋巴細胞, 螺原體在其中生長繁殖后通過血液流動到達河蟹的各個組織,引起河蟹附肢顫抖, 進而引發河蟹死亡[16—18]。在此研究中, 發現河蟹血淋巴細胞壞死率在低氧條件下顯著高于對照組, 且低氧脅迫與螺原體共同刺激時,血淋巴細胞在感染后期發生凋亡。與這類似的是,羅氏沼蝦的血淋巴細胞受氨和亞硝酸鹽刺激時也會發生凋亡[19]。

線粒體是一種雙層膜包被的細胞器, 存在于真核細胞中。在細胞凋亡過程中, 線粒體膜通透性的變化起著至關重要的作用。線粒體是細胞制造能量的結構, 其內膜中儲存的電化學勢能可以引起內膜兩側的離子濃度分布不對稱, 從而形成線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential, MMP)[20],線粒體膜電位的下降是細胞凋亡的標志性事件之一。在此實驗中, 通過對河蟹血淋巴細胞進行Rhodamine123染色發現, 與常氧組相比, 低氧組的河蟹感染螺原體后的熒光比例顯著升高, 并且隨著感染時間的增加, 熒光比例呈現上升趨勢, 即細胞凋亡增強。無脊椎動物的線粒體的攝氧量相較于脊椎動物要低得多, 受低氧刺激6h后, 對蝦的線粒體攝氧量及相關酶活性均呈明顯下降趨勢, 這說明對蝦通過減少攝氧量和降低蛋白的合成率以應對缺氧環境[21]。此實驗中, 根據組織切片結果, 相對于常氧組, 低氧組的肝胰腺結構較為疏松, 管腔外圍出現小空泡, 鰓軸出現彌散, 河蟹的肝胰腺和鰓組織結構均出現不同程度的損傷。類似的是, 在陶易凡等[22]的研究中, 克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)在低pH脅迫下, 肝胰腺組織中許多空泡, 鰓的上皮細胞剝落。日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)在低氧脅迫下, 鰓小片支柱細胞與上皮細胞排列雜亂, 肝組織中B淋巴細胞量減少, 細胞內運轉囊泡的體積縮小[23]。

4 結論

本實驗將低氧脅迫和螺原體共同作用于河蟹,最終得出結論: 在低氧狀態下, 河蟹的組織結構被破壞, 死亡率升高, 血淋巴細胞的壞死率和凋亡率升高, 螺原體感染速度加快, 河蟹更容易被螺原體感染, 這些實驗結果為研究低氧脅迫加速河蟹顫抖病的分子機制指明了方向。