氨氮脅迫下不同食性魚類仔魚抗氧化和非特異性免疫的差異響應

吳雪陽 郭紅會 況 宇 張 策 楊 慧 湯 蓉, 張 曦, 李大鵬, 李 莉,

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院, 武漢 430070; 2. 長江經(jīng)濟帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心, 武漢 430070;3. 池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室, 武漢 430070; 4. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070)

近年來, 我國極為重視水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境污染和發(fā)展之間關(guān)系, 并以綠色發(fā)展為理念, 積極通過實施“五大行動”推進水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖。氨氮是魚類蛋白質(zhì)分解代謝的最終產(chǎn)物, 主要通過鰓排泄到周圍環(huán)境中[1—3]。水體中氨氮以離子氨(NH4＋)和非離子氨(NH3)兩種形式存在, 其中, NH3具有很好的脂溶性, 能夠自由地穿過生物膜, 對魚類毒性較大; 而NH4

＋只能通過離子交換進入生物體內(nèi), 對魚類的毒性相對較小[4]。隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展, 大量殘餌及糞便在水體中積累并轉(zhuǎn)化為氨氮, 使得養(yǎng)殖環(huán)境中氨氮含量迅速升高。高濃度的氨氮對魚類的發(fā)育、生長和繁殖造成嚴重威脅, 特別是在魚類的早期生長階段[5—7]。為解決氨氮對水產(chǎn)綠色健康養(yǎng)殖發(fā)展的制約, 氨氮脅迫對魚類應激和健康的影響越來越受到人們的關(guān)注。

氨氮最先通過鰓上皮細胞進入鰓組織, 使鰓組織嚴重病變, 導致鰓組織出現(xiàn)壞死、溶血、血紅蛋白缺乏、耗氧量減少和呼吸障礙[8,9]。進入體內(nèi)的氨氮可以直接影響生物體內(nèi)物質(zhì)代謝以及損傷神經(jīng)系統(tǒng), 從而引起應激反應影響機體的健康[3,10,11]。氨氮也可影響細胞內(nèi)的NO和Ca2+濃度, 導致自由基的產(chǎn)生, 進而使得DNA和類固醇組件損傷、酶失活和脂質(zhì)過氧化等, 最終造成生物體各種生理病變[12—16]。近年來研究表明, 氨氮對魚類抗氧化系統(tǒng)的影響根據(jù)魚種類和氨暴露濃度不同而有所差異: 氨氮暴露會導致魚類體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性激活, 抵抗氨氮氧化脅迫[17—20]; 氨氮暴露也可抑制魚體抗氧化系統(tǒng), 使得SOD和CAT活力隨著氨氮濃度的升高而下降[21]。此外, 當魚類處于應激狀態(tài), 其特異性和非特異性免疫防御體系的功能也會受到不同程度的影響, 導致機體對各類病原敏感性的升高[22—25]。大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼魚在氨氮暴露后,腫瘤壞死因子α(TNFα)和白細胞介素1β(IL1β)基因表達水平均顯著性上調(diào), 溶菌酶(LYZ)表達水平顯著性下調(diào), 干擾先天性免疫反應[26]。相似地, 氨氮暴露可誘導河豚(Takifugu obscurus)肝臟中B細胞因子、tnfα、il-6和il-12的轉(zhuǎn)錄表達水平升高[27]。氨氮暴露也可以提高魚體內(nèi)LYZ活力和補體(C3, C4)含量以及免疫球蛋白水平, 促進機體免疫應答[28,29]。綜上所述, 氨氮作為重要的水環(huán)境因子, 其對魚類抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的危害不可忽視。魚類早期的生命階段比成魚對外界環(huán)境因子的影響更加敏感, 特別是其抗氧化和免疫系統(tǒng)還處于較低水平[30]。然而, 目前關(guān)于氨氮對魚類的抗氧化和免疫的影響主要集中在幼魚和成魚階段, 關(guān)于剛孵化出膜的仔魚對氨氮脅迫響應機制的研究還非常缺乏, 特別是不同種類的仔魚暴露在氨氮環(huán)境中響應差異的研究。

鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、草魚(Ctenopharyngodon idella)、團頭魴(Megalobrama amblycephala)和黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)都是我國重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類, 它們因其肉質(zhì)鮮美、生長速度快、經(jīng)濟價值高而受到人民的青睞, 其人工繁殖對滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖需求至關(guān)重要[31]。其中, 鰱為濾食雜食性, 產(chǎn)漂流性卵; 草魚和團頭魴均為草食性,但草魚產(chǎn)漂流性卵, 團頭魴產(chǎn)黏性卵; 黃顙魚為肉食性, 產(chǎn)沉性卵。由于它們的食性不同, 使得它們成為開展本研究絕佳的實驗對象。本研究從免疫與抗氧化的角度, 探討氨氮對鰱、草魚、團頭魴和黃顙魚仔魚氧化應激和免疫的影響及其分子機制的差異, 以期探究魚類早期發(fā)育過程中的氧化應激和免疫系統(tǒng)在魚類抵抗外源環(huán)境因子影響中的響應模式, 為全面評估和解析氨氮對魚類的危害以及苗種培育技術(shù)提升提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鰱、草魚、團頭魴和黃顙魚仔魚(出膜后24h)由湖南省田家湖漁業(yè)科技有限責任公司提供;實驗所用的塑料魚缸(32 cm×22 cm×17 cm)和培養(yǎng)皿(直徑10 cm)購自武漢迪躍生物; 游標卡尺(0—150 mm, 上海恒量量具有限公司); HQ40D水質(zhì)分析儀(哈希, 美國); 總蛋白濃度, 補體C3、溶菌酶(LYZ)、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)的含量及谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活力所用檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所; TRIzol試劑購自TaKaRa(中國大連); Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digeater plus)和HifairTMqPCR SYB?Green Mater Mix (No Rox)的試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。氯化銨(NH4Cl, 國藥, 99.5%), MS-222購自Sigma-Aldrich公司(美國), 其他所用試劑均為分析純。

1.2 半致死濃度測定

半致死濃度(LC50)測定實驗在湖南省華容縣田家湖漁業(yè)科技有限責任公司進行。選用基地馴化多年的成魚親本(鰱、草魚、團頭魴和黃顙魚)分別進行人工催產(chǎn)受精, 采集同一批健康孵化出膜的仔魚作為實驗對象。制備1 g/L的氨標準儲備液(氯化銨配制), 分別稀釋成1、2、4、6、8 和10 mg/L共6個濃度組的氨氮溶液(以總氨氮計), 對照組為24h曝氣自來水。半致死濃度測定選用直徑100 mm培養(yǎng)皿, 每個培養(yǎng)皿放入100條仔魚, 每個濃度5個平行, 分別在暴露前(0)和暴露后3h、6h、12h、24h、48h、72h和96h記錄各個濃度組的死亡數(shù)量,最后利用SPSS 22.0計算半致死濃度。

1.3 氨氮暴露實驗

根據(jù)半致死濃度結(jié)果, 設置1個對照組和3個暴露組, 氨氮濃度分別為0 (24h 曝氣自來水), 1 mg/L(25%LC50), 2 mg/L (50%LC50), 3 mg/L (75%LC50),每個濃度組3個平行培養(yǎng)缸。每個缸放入1500條魚苗, 暴露96h后進行樣品的采集, 實驗期間每24h更換相同濃度的NH4Cl溶液, 使?jié)舛缺３衷谠O置濃度的±20%以內(nèi), 并每隔3h查看, 及時利用膠頭滴管吸出死亡的魚苗, 防止污染實驗缸水環(huán)境。實驗期間鰱和草魚水溫為(24±0.2)℃, 團頭魴和黃顙魚水溫為(25.1±0.2)℃左右, 溶解氧均>5 mg/L, pH為8.8±0.2, 根據(jù)Emerson等[32]描述的方法計算實際水體中非離子氨(NH3)濃度:

非離子氨(NH3)=總氨氮/[1+10(pKa-pH)]

式中, pKa=0.09018+2729.92/T(T=273+t℃)。

采集樣品前用濃度為200 mg/L的MS-222麻醉實驗仔魚, 每個濃度組隨機取40尾仔魚利用游標卡尺測量體長。對每個濃度組, 隨機選取200條仔魚混合在一起作為1個平行樣, 液氮速凍后保存于–80℃用作酶活性和蛋白含量檢測, 共6個平行; 隨機選取20條仔魚混在一起作為1個平行樣, 放入液氮速凍后保存于–80℃冰箱中保存, 用于RNA提取和基因表達測定, 共6個平行。

1.4 抗氧化和免疫指標測定

采用南京建成生物工程研究所生化試劑盒測定勻漿中補體C3、LYZ、T-AOC、MDA的含量及GPx、SOD和CAT的活力。

1.5 基因表達水平測定

采用RNAiso Plus試劑(TaKaRa, 大連)提取總RNA, 利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, 大連)反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 用于實時熒光定量PCR分析。qPCR的引物序列運用Primer Premier 5.0軟件設計和參考相關(guān)文獻(表 1)。根據(jù)試劑盒操作說明, 利用SYBR Premix ExTaqⅡ(TaKaRa, 大連)進行qPCR反應, 擴增程序為:95℃預變性5min, 然后變性95℃ 10s, 退火58℃ 20s,延伸72℃ 20s, 共40個循環(huán)。實驗采用β-actin作為內(nèi)參基因, 2–??Ct方法計算相對表達量(R)[33]。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab. 1 Primer sequences for qPCR

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

實驗數(shù)據(jù)采用使用SPSS 22.0(Chicago, USA)對體長指標進行單因素方差分析(One-Way ANOVA),隨后采用Duncan進行多重比較。采用雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)方法對實驗中其他數(shù)據(jù)(T-AOC、MDA、SOD、CAT、GPx、LYZ、C3及相關(guān)的基因)進行分析, 隨后采用Duncan進行多重比較, 差異顯著水平均設為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 四種仔魚氨氮的半致死濃度

經(jīng)SPSS分析, 鰱仔魚96h總氨暴露的LC50為4.089 mg/L (NH3為0.697 mg/L), 草魚仔魚為4.276 mg/L(NH3為0.801 mg/L), 團頭魴仔魚為3.718 mg/L(NH3為1.142 mg/L), 黃顙魚仔魚為3.699 mg/L(NH3為1.136 mg/L)。

2.2 氨氮暴露對4種仔魚的體長的影響

在氨氮暴露后, 4種不同魚類仔魚的體長隨著氨氮暴露濃度增加而降低(圖 1)。與對照組相比,所有氨氮暴露組中鰱、草魚和黃顙魚仔魚體長均顯著降低(P<0.05), 其最高降幅依次為7.31%、18.71%和10.32%; 而團頭魴仔魚體長顯著降低僅出現(xiàn)在2和3 mg/L氨氮處理組(P<0.05), 最高下降了5.22%。

圖1 氨氮暴露對4種仔魚體長的影響Fig. 1 Effects of total ammonia nitrogen on body length of four species of fish larvae

2.3 氨氮對4種仔魚氧化和抗氧化指標的影響

氨氮暴露導致4種不同魚類仔魚的T-AOC活力降低(圖 2A)。與對照組相比, 2和3 mg/L氨氮脅迫導致鰱仔魚、草魚仔魚和團頭魴仔魚的T-AOC顯著降低(P<0.05), 其最高降幅分別為9.02%、17.36%和22.62%; 所有氨氮處理組中黃顙魚仔魚T-AOC均顯著降低(P<0.05), 最高下降了19.43%。相對地, 氨氮暴露僅導致團頭魴仔魚體內(nèi)MDA含量顯著性升高(P<0.05; 圖 2B)。

圖2 氨氮暴露對4種仔魚總抗氧化能力(A)和丙二醛(B)的影響Fig. 2 Effects of total ammonia nitrogen on total antioxidant capacity (A) and malondialdehyde (B) of four species of fish larvae (n=6)

鰱仔魚SOD活力在氨氮暴露后升高, 但沒有表現(xiàn)出顯著性變化(P>0.05), 但2和3 mg/L氨氮脅迫顯著降低了草魚仔魚、團頭魴仔魚和黃顙魚仔魚體內(nèi)SOD活性, 其最高降幅分別為17.81%、14.79%和23.98% (P<0.05; 圖 3A)。在基因水平上, 2和3 mg/L氨氮處理導致鰱仔魚cuznsod表達水平的顯著性下調(diào)(P<0.05; 圖 3B)。

如圖 3C所示, 氨氮脅迫導致4種仔魚的CAT活力降低。與對照組相比, 3 mg/L氨氮處理組中鰱仔魚和黃顙魚仔魚體內(nèi)CAT活性分別降低了41.14%和64.12% (P<0.05), 而草魚仔魚和團頭魴仔魚CAT活性在2和3 mg/L氨氮組均顯著下降, 最高降幅分別為45.01%和47.12% (P<0.05)。氨氮的脅迫并未造成4種仔魚cat轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著改變(P>0.05; 圖 3D)。

4種仔魚GPx的活性在氨氮脅迫后均降低(圖 3E)。與對照組相比, 1和2 mg/L氨氮處理導致鰱仔魚GPx活性顯著性降低了34.48%和23.21% (P<0.05);2和3 mg/L氨氮處理導致草魚仔魚GPx活性顯著降低了27.51%和43.12% (P<0.05); 而團頭魴仔魚GPx活性僅在3 mg/L氨氮處理組顯著降低了55.73% (P<0.05); 僅黃顙魚仔魚GPx活性在3個處理組中均顯著性降低, 最高降幅為56.04% (P<0.05)。與對照相比,僅黃顙魚基因gpx轉(zhuǎn)錄水平在3個氨氮處理組均顯著性下調(diào)(P<0.05), 且降幅超過52.23% (圖 3F)。

圖3 氨氮暴露對4種仔魚抗氧化酶含量和基因表達的影響Fig. 3 Effects of total ammonia nitrogen on antioxidant enzymatic activity and gene expression of four species of fish larvae (n=6)

2.4 氨氮對4種仔魚非特異性免疫指標的影響

與對照組相比, 氨氮暴露導致草魚仔魚體內(nèi)LYZ含量顯著降低(P<0.05), 但未造成鰱仔魚和團頭魴仔魚體內(nèi)LYZ含量出現(xiàn)顯著性變化(P>0.05)。然而, 2 mg/L處理組黃顙魚仔魚LYZ含量增加顯著(P<0.05; 圖 4A)。如圖 4B所示, 氨氮暴露對鰱、草魚、團頭魴和黃顙魚4種仔魚體內(nèi)補體C3含量均無顯著性影響(P>0.05)。

圖4 氨氮暴露對4種仔魚溶菌酶和補體C3含量的影響Fig. 4 Effects of total ammonia nitrogen on the contents of lysozyme (A) and complement C3 (B) of four species of fish larvae (n=6)

在氨氮暴露后, 除了鰱仔魚il1β基因表達呈現(xiàn)下降趨勢, 4種魚仔魚所有檢測基因(il1β、tnfα和c3)均呈現(xiàn)上升趨勢(圖 5)。與對照組相比, 3 mg/L氨氮暴露導致tnfα基因表達在鰱、草魚、團頭魴和黃顙魚仔魚體內(nèi)分別顯著升高了206.12%、79.67%、416.44%和267.18%(P<0.05)。同時, 3 mg/L氨氮暴露導致草魚和團頭魴仔魚體內(nèi)il1β基因表達顯著上升55.41%和2701.84%; 鰱體內(nèi)顯著下降51.17%(P<0.05);而黃顙魚仔魚體內(nèi)il1β基因表達在2和3 mg/L暴露下顯著增加205%和773.68% (P<0.05)。3 mg/L氨氮誘導黃顙魚仔魚c3基因表達顯著上升275.43%, 而2和3 mg/L氨氮均在鰱、團頭魴和草魚仔魚中誘導c3表達顯著升高(P<0.05), 其最高漲幅分別為177.04%、374.61%和112.99%。

圖5 氨氮暴露對4種仔魚相關(guān)基因表達量的影響Fig. 5 Effects of ammonia nitrogen on relative mRNA expression of four species of fish larvae (n=6)

2.5 氨氮和魚的種類雙因素對仔魚抗氧化酶和先天性免疫指標的影響

雙因素方差分析結(jié)果顯示, 氨氮對所有抗氧化酶活性、免疫指標以及免疫相關(guān)基因均有顯著影響(P<0.05), 不同種類仔魚(鰱、草魚、團頭魴和黃顙魚)的T-AOC、CAT、GPx、C3和基因sod、gpx、il1β、c3之間差異顯著(P<0.05), 而魚種和氨氮互作效應僅對C3和基因gpx、tnfα、il1β、c3影響顯著(P<0.05; 表 2)。對于交互作用顯著的指標, 我們通過單因素方差分析進一步解析了同一氨暴露下魚種之間的差異 (表 3), 結(jié)果顯示: 在無氨氮的對照組, 鰱和草魚仔魚體內(nèi)C3含量顯著高于黃顙魚和團頭魴仔魚(P<0.05), 而基因gpx、tnfα、il1β和c3mRNA表達水平在4種仔魚間沒有顯著差異; 在低濃度氨氮(1 mg/L)處理條件下, 黃顙魚仔魚c3和tnfα轉(zhuǎn)錄水平顯著低于鰱和草魚仔魚, 其il1β基因轉(zhuǎn)錄水平顯著低于鰱和團頭魴仔魚(P<0.05), 而在高濃度氨氮(3 mg/L)處理下, 黃顙魚仔魚c3轉(zhuǎn)錄水平顯著高于鰱和團頭魴仔魚,il1β轉(zhuǎn)錄水平顯著高于鰱和草魚仔魚,tnfα基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于草魚仔魚(P<0.05; 表 3)。

表2 氨氮和魚的種類雙因素對仔魚抗氧化酶和先天性免疫指標的影響Tab. 2 Effects of ammonia and species on antioxidant enzyme of different feeding habits fish larvae

表3 氨氮暴露下4種仔魚之間C3含量及基因c3、gpx、il1β和tnfα轉(zhuǎn)錄水平變化Tab. 3 The changes of C3 levels and c3, il1β, tnfα translation among four species of fish larvae after ammonia exposure

3 討論

3.1 氨氮脅迫對仔魚生長的影響

苗種培育是制約養(yǎng)殖后期發(fā)展的重要階段, 在保障人工繁殖魚苗孵化率的同時, 需要特別重視出膜后仔魚的生長發(fā)育。其中, 仔魚的生長發(fā)育是評價人工繁殖是否成功以及優(yōu)良品種選育的重要時期, 因為仔魚往往對外界環(huán)境較為敏感, 易受到環(huán)境因素(氨氮、亞硝酸鹽和溫度)的影響, 例如氨氮進入魚體后能破壞腦中樞神經(jīng)系統(tǒng), 影響魚的攝食和食物吸收, 進而抑制魚的生長[15,21,35,36]。Foss等[35]發(fā)現(xiàn), 長期氨氮脅迫導致大菱鲆幼魚特定生長率和增重率降低。Li 等[15]研究指出, 高濃度氨氮(26.88 mg/L)暴露明顯抑制了黃顙魚的攝食、生長及飼料轉(zhuǎn)化效率。在本實驗中, 氨氮暴露使4種仔魚體長生長顯著減緩, 且隨著氨氮濃度升高體長呈現(xiàn)劑量依賴性下降, 表明氨氮脅迫對魚類早期生長發(fā)育造成一定的負面影響, 其中氨氮暴露對生長影響最顯著的是草魚和黃顙魚。相似地, 尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)受精卵暴露于0.05—0.6 mg/L的氨氮20d和60d后, 死亡率與對照組相比顯著性上升, 且高濃度氨氮暴露時, 仔魚表現(xiàn)出各種生理反應, 其中包括體長生長減緩, 脊柱彎曲、卵黃囊縮小等[36]。Segner和Verreth[37]研究也指出, 魚卵較大的魚類(例如鮭)可以維持較長時間的卵黃囊期, 可以支持其生長至較大的仔魚。相比之下, 卵和仔魚較小的海魚品種, 在外源喂養(yǎng)開始時器官發(fā)育不完全[38,39]。

3.2 氨氮脅迫對仔魚氧化和抗氧化系統(tǒng)的影響

魚類的生長和魚體的健康密不可分, 而魚類抗氧化系統(tǒng)和氧化系統(tǒng)之間的平衡往往是評價魚類健康的重要指標, 因為多種環(huán)境污染物的毒性機制之一是過量生成的活性氧(ROS)引起氧化應激[40—42]。MDA是脂質(zhì)過氧化的重要標志之一。此外，T-AOC是衡量機體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)功能強弱的綜合性指標。MDA和T-AOC水平的動態(tài)變化可以充分反應機體氧化應激狀態(tài)[43,44]。急性氨氮暴露能導致羅非魚肌肉和肝臟ROS含量增加, 并造成相應的氧化損傷[17], 且高濃度氨氮易導致魚體內(nèi)MDA的積累[18,45]。在本研究中, 隨著氨氮濃度升高, 4種魚體內(nèi)T-AOC含量顯著降低, 而MDA含量都有一定的上升, 表明氨氮的暴露導致魚體抗氧化能力的減弱, 造成了氧化應激損傷?？寡趸芰υ诓煌N類的魚之間會有很大的差異, 這可能與它們對引起氧化損傷的外源污染物的抵抗力不同有關(guān)[46,47]。通過顯著性分析和雙因素方差分析發(fā)現(xiàn), 不同仔魚之間T-AOC含量差異顯著, 并且氨氮對于不同仔魚T-AOC含量均具有顯著抑制作用, 其中對黃顙魚仔魚T-AOC削弱程度最大, 其次是團頭魴仔魚, 初步表明鰱和草魚仔魚的氨耐受性較強。

細胞內(nèi)ROS水平由相互作用的抗氧化防御體系協(xié)同控制[17,48], 抗氧化酶活性的增加表明氧化應激的發(fā)生和清除生成的ROS的適應性反應, 而其活性的降低則暗示其抗氧化防御能力的破壞。在本實驗中, 氨氮暴露導致4種仔魚的抗氧化酶SOD、CAT和GPx的活性和基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)不同程度的下降, 進一步證實氨氮的暴露造成了氧化應激損傷, 進而削弱了其抗氧化能力。我們研究還發(fā)現(xiàn),氨氮暴露后4種仔魚中僅鰱仔魚體內(nèi)SOD含量未出現(xiàn)顯著性變化, 而CAT和GPx 活力顯著性降低, 表明鰱仔魚不依賴SOD作為抵抗氨介導的ROS。與我們結(jié)果相似的, 剛孵化鰱體內(nèi)SOD的活力在NH3(0.06—0.264 mg/L)暴露3d和7d后沒有受到顯著影響[31]。本實驗中草魚、團頭魴和黃顙魚仔魚的SOD、CAT和GPx均顯著性下降, 且黃顙魚gpx基因的轉(zhuǎn)錄水平在氨氮暴露后也顯著下調(diào), 表明這3種魚的抗氧化酶SOD、CAT和GPx都參與氨氮脅迫下ROS的清除。Chen等[49]研究發(fā)現(xiàn), 氨氮(NH3:0.176—0.879 mg/L)暴露草魚卵至神經(jīng)胚和孵化, 可使其SOD水平顯著下降。Zhang等[50]研究結(jié)果揭示, 20 mg/L總氨氮長期暴露導致團頭魴幼魚(14.27±0.01) g肝臟中SOD、CAT和GPx活性顯著降低。同樣, 黃顙魚在氨氮暴露后其SOD、CAT和GPx活力也顯著性下降[15,21]。在正常情況下, 細胞內(nèi)ROS可被SOD分解為H2O2, CAT和GPx可催化H2O2形成水和分子態(tài)氧, 所以SOD在抗氧化防御過程中起到首要地位[51,52]。本實驗發(fā)現(xiàn), 氨氮處理后鰱仔魚體內(nèi)SOD活性顯著高于其他3種仔魚, 這可能是鰱仔魚較其他3種仔魚耐氨氮性強的原因。雙因素方差分析進一步顯示, 與對照組相比, 氨氮脅迫導致黃顙魚仔魚抗氧化酶降低的程度最大, 其次是草魚和團頭魴仔魚, 另一方面4種仔魚自身之間抗氧化酶CAT和GPx活性就有顯著差異, 而不同魚抗氧化應激的響應能力可能與它們食性相關(guān)[53,54]。姜丹莉[54]研究發(fā)現(xiàn), 草食性草魚和肉食性青魚捕撈后肝臟糖含量下降, 而雜食性銀鯽(Carassiusautatus gibelio)捕撈后肝糖原含量未發(fā)生顯著變化, 其血漿葡萄糖和乳酸濃度增幅較小, 表明銀鯽的捕撈應激反應強度低于草魚和青魚。綜上所述, 在氨氮暴露下, 鰱仔魚抗氧化能力最高, 耐氨氮能力最強; 黃顙魚仔魚抗氧化能力最低, 耐氨氮能力最低。

3.3 氨氮脅迫對仔魚免疫系統(tǒng)的影響

魚類生活的水環(huán)境病原體復雜多變, 病原體會增加宿主免疫系統(tǒng)功能障礙, 因此集約化養(yǎng)殖中氨氮對魚類免疫影響已成為熱點問題[29,55], 而魚類先天性免疫被認為是抵抗外界病原體的第一道防線[56,57]。溶菌酶在生物體中廣泛存在, 其轉(zhuǎn)錄水平或者活力是魚類先天免疫的重要指標。章瓊[60]研究報道,72h氨氮(20 mg/L)急性脅迫導致團頭魴成魚鰓組織中溶菌酶基因表達量顯著下降, 免疫系統(tǒng)功能減弱。相似地, 急性氨氮暴露也造成瓦氏黃顙魚成魚血清中溶菌酶含量顯著性降低, 導致免疫系統(tǒng)功能減弱[61]。同樣, 長期氨氮(5.56—5.80 mg/L)暴露導致黃顙魚幼魚(1.94±0.05) g肝臟中溶菌酶活性顯著降低[62]。相反, 黃顙魚在氨氮(5.70 mg/L)3h短期急性暴露后, 肝臟中溶菌酶呈現(xiàn)顯著性上升[15]。在本研究中, 氨氮暴露后鰱和團頭魴仔魚LYZ含量沒有顯著變化, 但草魚魴仔魚中顯著下降, 而黃顙魚中顯著升高, 可見氨氮脅迫導致4種仔魚呈現(xiàn)差異性免疫響應, 草魚表現(xiàn)為免疫反應抑制, 黃顙魚表現(xiàn)為免疫反應興奮, 而鰱和團頭魴免疫反應未受影響。本實驗雙因素方差分析顯示, 氨氮對LYZ含量影響顯著, 但是4種仔魚體內(nèi)LYZ之間沒有顯著差異。魚類的補體可裂解外界細胞, 對外來生物產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用, 其中補體C3在補體級聯(lián)反應中起著核心作用[58,59]。在本研究中, 氨氮暴露未導致C3含量在4種仔魚中出現(xiàn)顯著變化, 但c3基因表達呈現(xiàn)顯著升高。相似地, 高濃度氨氮(10 mg/L)急性脅迫24h后, 團頭魴成魚血清中C3和C4含量沒有顯著變化[63]。同樣, 在24h急性氨暴露后, 草魚成魚血清中C3含量無顯著變化[64]。綜合以上結(jié)果表明, 氨氮暴露下4種仔魚通過提高C3基因表達量維持體內(nèi)C3含量恒定。

細胞因子家族中il1β和tnfα被視為重要的促炎細胞因子, 在受到外界損傷時作為幾種免疫反應的中間因素參與炎癥反應[65—68]。氨氮(10 mg/L)急性脅迫導致鯽(Carassius auratus)肝臟中tnfα和il1β表達升高[66], 表明機體發(fā)生了炎癥反應。同樣, 急性氨氮暴露也可誘導河豚(Takifugu obscurus)和翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)肝臟中tnfα表達升高[70,71]。此外, 急性96h氨氮(0.14和0.28 mg/L)脅迫導致黃顙魚頭腎巨噬細胞il1和tnf基因相對表達量顯著下降[72]。在本研究中, 3 mg/L氨氮處理導致4種仔魚體內(nèi)tnfα基因表達量均顯著升高, 且其在鰱和草魚仔魚體內(nèi)的漲幅低于團頭魴和黃顙魚仔魚, 表明團頭魴和黃顙魚仔魚可能較其他兩種仔魚對氨耐受性弱。與tnfα表達結(jié)果相似, 氨氮暴露導致草魚仔魚、團頭魴仔魚和黃顙魚仔魚il1β表達顯著升高,且黃顙魚仔魚中il1β表達對氨脅迫表現(xiàn)更加敏感,但鰱仔魚體內(nèi)il1β表達顯著下降。雙因素方差分析表明, 同一氨氮濃度下4種仔魚之間tnfα和il1β表達存在顯著差異, 黃顙魚仔魚體內(nèi)免疫炎癥因子(tnfα和il1β)在低濃度氨氮(1 mg/L)下表達量較低, 但在高濃度氨氮(3 mg/L)條件下表達量較高, 而鰱和草魚仔魚卻表現(xiàn)出相反趨勢。由此可見, 氨氮暴露干擾了4種仔魚免疫反應, 引發(fā)炎癥反應, 其中黃顙魚仔魚和團頭魴仔魚較其他兩種仔魚對氨耐受性更弱。

4 結(jié)論

氨氮脅迫導致4種不同食性魚類仔魚產(chǎn)生氧化應激和免疫炎癥響應, 損害機體內(nèi)酶的平衡, 降低仔魚的抗氧化能力和先天性免疫功能, 影響基因的轉(zhuǎn)錄水平和酶的合成, 導致生長遲緩甚至死亡。在抗氧化和免疫對氨氮耐受性方面, 鰱仔魚的抗性最強, 其次是草魚和團頭魴仔魚, 而黃顙魚仔魚抵抗力較弱。鑒于此, 苗種培育階段應該重視水體中氨氮濃度控制, 特別是在肉食性黃顙魚仔魚的培育過程。