水稻糙米率QTL檢測及候選基因分析*

蘆 濤， 葉涵斐， 褚曉潔， 林 晗， 王 盛，潘晨陽， 李三峰， 王躍星， 饒玉春

(1．浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2．中國水稻研究所，浙江 杭州 311121)

水稻(OryzasativaL.)是世界上主要的糧食作物，加工品質(zhì)作為水稻的重要品質(zhì)之一，在改善水稻品質(zhì)和提高水稻產(chǎn)量方面發(fā)揮了極為重要的作用[1]．隨著現(xiàn)代生活水平的提高，稻米品質(zhì)越來越受到消費者的重視，培育出高加工品質(zhì)的稻米對于農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟發(fā)展具有重要的作用．

水稻的糙米率受多種因素共同影響，由多個基因共同調(diào)控的數(shù)量性狀，其相關(guān)分子機制復(fù)雜，并受到環(huán)境因素調(diào)控[2]．目前已經(jīng)有80余個水稻糙米率QTL被報道，穆平等[3]利用IRAT109/越富構(gòu)建的DH群體定位到1個控制糙米率的主效QTL．劉家富等[4]以特青/云南野生稻構(gòu)建了一套深入系，并定位到3個與糙米率相關(guān)的QTL，同時發(fā)現(xiàn)第1染色體RM449～RM3120區(qū)間內(nèi)存在著1個QTL，其同時影響了水稻的糙米率和精米率．張上都等[5]通過V20B/CPSLO17構(gòu)建的RILs群體在1號染色體上發(fā)現(xiàn)1個糙米率QTL，位于Marker641882～Marker738688，LOD值為3.267．周勇等[6]利用廣陸矮4號/日本晴衍生的RILs群體定位到3個關(guān)于糙米率的QTL，其中1個位于第6染色體，2個位于第9染色體．饒玉春[7]利用DH群體檢測到4個跟糙米率有關(guān)的QTL，分別在第1，8，9，10染色體上．這4個QTL當(dāng)中位于第10染色體的RM271～RM304區(qū)間內(nèi)的QTL位點，其LOD值高達3.95．近年來已報道許多關(guān)于水稻品質(zhì)的位點：gw9.1來自于野生稻的基因組，被定位在第9號染色體上[8]，而其等位基因可以增加籽粒的質(zhì)量；TGW3編碼1個類似糖原合酶激酶GSK3的激酶，可以負調(diào)控籽粒的長度和質(zhì)量，同時也可以改變籽粒外殼當(dāng)中細胞的大小和數(shù)量[9]；GS2在水稻內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，當(dāng)過量表達GS2時可以引起籽粒中細胞增大增多，進而提高產(chǎn)量[10]．

雖然前人的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一部分糙米率相關(guān)QTL，但是目前并沒有成功克隆出與糙米率相關(guān)的基因[11]，因此,水稻糙米率具有巨大的研究價值．同時有研究表明，不同的定位群體檢測到的糙米率QTL之間也具有差異，挖掘不同材料中的糙米率QTL對深入研究糙米率的遺傳機制具有重要的意義．HZ具有穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、品種多等優(yōu)點，Nekken是日本在20世紀(jì)90年代選育的一份粳型常規(guī)水稻品種，具有廣譜親和性與較強的親和力，被廣泛應(yīng)用于親和研究和育種利用．本研究以典型秈粳交(HZ/Nekken)構(gòu)建的重組自交系群體(RILs)為材料，對水稻糙米率進行QTL定位，同時還進行了復(fù)合QTL模型分析，以期發(fā)現(xiàn)更多有價值的QTL位點，為培育高品質(zhì)、高產(chǎn)的水稻品種奠定基礎(chǔ)．

1 實驗材料

本實驗以Nekken為母本、HZ為父本進行雜交，以F1代通過單粒傳法套袋自交，從而獲得120個穩(wěn)定遺傳的重組自交系，組成RILs群體(見圖1)．

圖1 親本與RILs群體的構(gòu)建原理圖

2 實驗方法

2.1 水稻催芽與田間管理

每個重組自交系分別取50粒種子，用70%酒精沖洗2～3次，每次2 min，再用10%次氯酸鈉消毒2 min，最后用去離子水反復(fù)清洗種子10 min，洗去消毒液．隨后將消毒完成的種子浸入水中2 d，2 d后用濕透的紗布包裹種子，放入37 ℃的培養(yǎng)箱進行催芽并保持毛巾濕潤．等到種子普遍露白時，挑選長勢基本相同的幼芽播種到田中．等幼芽生長1個月之后，再從每個重組自交系挑選24株生長狀況相同的水稻苗進行移苗，每個株系按照4行6列移植．期間定期除草殺蟲，保證水稻苗的正常生長．

2.2 糙米率數(shù)據(jù)測定

待水稻成熟后每個株系隨機采收10株混合收種，脫粒后放入烘箱干燥，等到完全干燥后將種子放置儲藏柜室溫儲藏3個月．糙米率測定方法參考《糧食、油料檢驗稻谷出糙率檢驗法》(GB/T 5495—2008)[12]．每個自交系稱出100 g飽滿、沒有病態(tài)的谷子，然后去殼，稱出糙米的質(zhì)量，用糙米的質(zhì)量比上谷子的質(zhì)量就是糙米率．

m=m1/(m2-m3)×100%.

其中：m代表糙米率(%)；m1代表糙米質(zhì)量(g)；m2代表試樣谷質(zhì)量(g)；m3代表脫殼谷質(zhì)量(g)．

2.3 遺傳圖譜的構(gòu)建

使用CTAB法提取Nekken、HZ和120個重組自交系的DNA，對Nekken、HZ及120個重組自交系進行測序并構(gòu)建測序文庫，比較了從HZ和Nekken獲得的RILs之間的變異位點，并用隱馬爾可夫模型方法[13]確定了它們的基因型．將相同基因型的連續(xù)SNP位點集中成區(qū)塊，篩選出小于100 kb的單核苷酸多態(tài)性位點．并將結(jié)果進行分類整理統(tǒng)計，獲得4 858個分子標(biāo)記，這些分子標(biāo)記均勻分布在水稻的12條染色體上，構(gòu)建出覆蓋范圍廣并且密度較高的遺傳圖譜．

2.4 QTL定位

在實驗室前期已構(gòu)建的高密度SNP分子標(biāo)記連鎖圖譜基礎(chǔ)上，采用區(qū)間作圖法，用Mapmaker/QTL1.1B軟件對糙米率進行QTL定位分析，將LOD設(shè)置為2作為閾值來判斷QTL存在．

2.5 糙米率相關(guān)基因表達及分析

使用總RNA提取試劑盒(RNA simple total RNA kit)提取Nekken和HZ灌漿期葉片的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明將Nekken和HZ的總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA．根據(jù)QTL的定位結(jié)果，在水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)查找相關(guān)區(qū)間內(nèi)可能與糙米率有關(guān)的基因，利用實時熒光定量PCR對Nekken和HZ的候選基因進行表達差異分析，引物序列見表1．定量結(jié)果采用2-△△CT方法[14]進行分析．用Excel和SPSS 21.0等軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，實驗數(shù)據(jù)間的顯著性差異使用T檢驗進行比較．P<0.05代表具有顯著性差異．根據(jù)候選基因Nekken和HZ表達量差異情況，選取表達量具有顯著性差異的基因利用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Ve.2擴增并進行測序．

表1 實時熒光定量PCR的引物序列

3 結(jié)果分析

3.1 雙親和群體的表現(xiàn)

對雙親及重組自交系的糙米率進行檢測，發(fā)現(xiàn)Nekken的糙米率為84%，而HZ的糙米率為76%，Nekken的糙米率相對于HZ的糙米率要高出約8%．RILs群體的糙米率數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出連續(xù)的正態(tài)分布，范圍較廣泛，并且存在超親個體(見圖2)，符合QTL區(qū)間作圖的需求．

圖2 水稻重組自交系中糙米率的分布情況

3.2 QTL定位

利用該重組自交系事先構(gòu)建的連鎖遺傳圖譜進行QTL定位分析，該圖譜包括4 858個標(biāo)記的水稻分子標(biāo)記，而且各標(biāo)記均勻分布于全部水稻染色體上，完全適用于QTL區(qū)間作圖的需求．本研究共檢測到4個水稻糙米率相關(guān)QTL，分別位于第5，8，10，12染色體上(見表2和圖3)．LOD值最大的QTL位于第8染色體上遺傳距離為0.48～3.69 cM的區(qū)間內(nèi)，LOD值為2.78．

表2 水稻糙米率的QTL分析

圖3 水稻重組自交系糙米率的QTL定位

3.3 候選基因分析

通過對上述QTL所在區(qū)間進行候選基因分析，查閱水稻籽粒長寬比、厚度、品質(zhì)相關(guān)文獻，找出可能與糙米率相關(guān)的基因(見表3)，并對這些基因的功能和注釋信息進行了初步總結(jié)與歸納.通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，LOC_Os10g35440，LOC_Os08g01450，LOC_Os05g42210在HZ和Nekken當(dāng)中均有顯著性差異(見圖4)．

表3 QTL定位區(qū)間候選基因及功能注釋

圖4 雙親中候選基因的表達情況

LOC_Os05g42210在Nekken當(dāng)中表達量要顯著高于HZ，而LOC_Os10g35440在Nekken當(dāng)中表達量顯著低于HZ，同時發(fā)現(xiàn)LOC_Os08g01450在雙親中表達量存在極顯著的差異，而且該基因也位于效應(yīng)最大的QTL位點內(nèi)．因此，對HZ和Nekken當(dāng)中LOC_Os08g01450進行測序，發(fā)現(xiàn)共有7處差異，且7處均為單堿基差異，分別位于第273位(HZ為G，Nekken為A)，第1 042處(HZ為G，Nekken為A)，第1 185處(HZ為G，Nekken為A)，第1 260處(HZ為A，Nekken為G)，第1 289處(HZ為T，Nekken為C)，第1 411處(HZ為G，Nekken為A)，第1 452位(HZ為T，Nekken為C)(見圖5)，其中第1處、第2處和第7處的單堿基差異沒有引起氨基酸的改變，第3處、第4處、第5處和第6處的單堿基差異引起氨基酸改變，分別位于第348位(HZ為纈氨酸，Nekken為異亮氨酸)，第420位(HZ為異亮氨酸，Nekken為甲硫氨酸)，第430位(HZ為纈氨酸，Nekken為丙氨酸)，第470位(HZ為天冬氨酸，Nekken為天冬酰胺)．由此推測，HZ與Nekken間的糙米率差異有可能是由于基因LOC_Os08g01450編碼的氨基酸序列的差異而造成的.

a：LOC_Os08g42750位點分析；b：位點1；c：位點2；d：位點3；e：位點4；f：位點5；g：位點6；h：位點7

4 討 論

目前有關(guān)于水稻糙米率的研究仍處在起步階段，本研究利用HZ/Nekken構(gòu)建的RILs群體定位到4個糙米率QTL，并通過對區(qū)間內(nèi)基因的分析篩選出3個候選基因，分別編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體前體、細胞色素P450、含有五肽重復(fù)序列的蛋白質(zhì)．

目前已有的研究表明，水稻糙米率受到不同基因的共同調(diào)控，LOC_Os05g42210編碼1個表達絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體的前體，該前體通過調(diào)控細胞周期蛋白控制水稻籽粒大小和產(chǎn)量，其表達量的下降可能會引起籽粒變短[18]．LOC_Os08g01450編碼1種酶，屬于細胞色素P450家族[19]．LOC_Os08g01450基因的突變可能會引起種子中糖分的積累及籽粒產(chǎn)量的提高，對粒長粒寬也會有一定的影響．LOC_Os10g35440編碼1個三角狀五肽重復(fù)蛋白[20]，該蛋白在調(diào)控線粒體功能和水稻胚乳發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其突變導(dǎo)致線粒體呼吸電子傳遞鏈中復(fù)合物I的組裝減少，線粒體超微結(jié)構(gòu)異常，同時ATP合成受阻，引起水稻營養(yǎng)期和生殖期生長明顯減慢，成熟時米粒小且不透明，灌漿速率顯著降低，千粒質(zhì)量約降低36%，直鏈淀粉含量降低，胚乳中淀粉顆粒變小，且糊粉層細胞結(jié)構(gòu)異常．

近幾年，研究者通過構(gòu)建不同的遺傳群體對糙米率進行QTL定位并進行分析．梅德勇等[21]利用特青/IRBB的RILs群體在第6染色體短臂、第2染色體長臂、第7染色體長臂、第8染色體長臂和第10染色體長臂等共檢測到8個糙米率的QTL位點，同時在第10染色體RM6100～RM3773檢測到的QTL與本研究發(fā)現(xiàn)的qBR-3具有部分重合，而Ren等[22]利用TN1/CJ06的DH群體在第10染色體上RM258～RM1108區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)LOD值高達5.95的位點也與本位點非常接近，說明該位點很可能是一個穩(wěn)定控制水稻糙米率的QTL位點．胡霞等[23]在第5染色體上RM161～RM3474區(qū)間發(fā)現(xiàn)的糙米率QTL也與本研究發(fā)現(xiàn)的qBR-1位點比較接近但并沒有重疊，這可能是由于不同群體定位的糙米率QTL在遺傳距離上存在一定的偏差，同時也說明在此附近可能存在與糙米率相關(guān)的QTL位點．除了這2個位點外，本次研究還發(fā)現(xiàn)了2個新的糙米率QTL位點，分別位于第8染色體RM22196～RM22277和第12染色體RM28127～RM28132的區(qū)間內(nèi)．

水稻是世界重要的糧食產(chǎn)物之一，隨著耕地面積的減少，培養(yǎng)出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的水稻成為現(xiàn)在研究者的目標(biāo)之一．加工品質(zhì)是水稻的一個重要品質(zhì)，改進水稻加工品質(zhì)可以提高水稻產(chǎn)量，有效緩解糧食危機，保障我國的糧食安全．但是水稻加工品質(zhì)的遺傳是一個極其復(fù)雜的過程，不同研究方式得到的結(jié)果往往各不相同，甚至不同群體得到的結(jié)果也會有所不同．隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記育種已經(jīng)逐漸應(yīng)用到水稻育種的研究中，借助分子標(biāo)記研究水稻加工品質(zhì)將是未來研究方向之一．水稻糙米率是由多基因控制的數(shù)量性狀，本研究利用HZ/Nekken構(gòu)建的RILs群體得到的4個水稻糙米率QTL，為選育高糙米率的水稻品種提供一定的基礎(chǔ)．但是QTL定位容易受到群體和材料的影響，因此，需要開展更多關(guān)于糙米率QTL的研究，進一步挖掘水稻糙米率QTL位點，尋找其中的主效基因，以加快高品質(zhì)水稻的育種．