冷藏期間灘羊肉保水性變化的機制

劉吉娟，楊 波，羅瑞明，李子欣，尤麗琴

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

保水性是衡量灘羊肉品質的重要指標之一，可用蒸煮損失率和離心損失率來表示。目前，關于灘羊肉的研究主要集中于宰前控制對于灘羊肉品質形成的影響。宰后因素對灘羊肉品質影響方面，吳亮亮等研究發現不同食鹽添加量對灘羊肉保水性、剪切力以及水分分布均有顯著影響。張麗文等研究發現凍融處理的灘羊肉中不易流動水相對含量較高，自由水相對含量較低。而從蛋白質水平解析貯藏過程中灘羊肉保水性的變化機制鮮有報道。

宰后貯藏期間，肉品的保水性受貯藏條件、糖酵解、肌肉pH值等因素影響，這些因素通過調節肌肉結構蛋白質的降解影響肌肉結構從而影響肌肉結構中水分的貯存情況，而蛋白質水平的變化是引起肌肉結構變化的根本原因。左惠心研究表明糖酵解關鍵酶磷酸丙糖異構酶可能是牦牛肉保水性的指示蛋白之一。劉秋鳳研究表明，糖代謝通過改變肌肉pH值影響豬肉保水性、肉色等品質性狀的形成。因此，從蛋白質水平解析貯藏過程中保水性變化的機制，從而尋找改善汁液損失的方法，對提高冷鮮肉品質、降低企業經濟損失具有重要意義。

蛋白質組學是研究細胞、組織或生物體中所表達的蛋白質組成、變化及相互作用規律的學科。蛋白質組學在肉品保水性研究相關領域也取得了可觀的進展。di Luca等采用高分辨率雙向熒光差異凝膠電泳（twodimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）和免疫印跡法研究豬肉滲出液，發現磷酸丙糖異構酶和轉鐵蛋白可能是預測保水性的生物標志物。Zuo Huixin等研究表明，肌球蛋白輕鏈、熱休克蛋白27和磷酸丙糖異構酶可能是牦牛腰長肌保水性的指示蛋白。然而，關于揭示宰后貯藏過程中灘羊肉保水性變化的機制鮮見報道。因此，本研究以6 月齡灘羊背最長肌為研究對象，測定4 ℃貯藏0、4、8 d時樣品的pH值、蒸煮損失率和離心損失率；采用基于同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術的蛋白質組學研究貯藏期間灘羊肌肉組織中蛋白質表達情況，篩選差異蛋白質并對其進行生物信息學分析，鑒定0～4 d和4～8 d兩個貯藏階段共有的差異表達蛋白質并構建蛋白質-蛋白質互作（protein-protein interaction，PPI）網絡，利用Cytoscape 3.8.0軟件對PPI進行分析并篩選核心網絡；通過分析品質指標與核心網絡中蛋白質表達量的關系，初步揭示宰后貯藏過程中灘羊肉保水性變化的機制，為冷鮮灘羊肉品質控制技術提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6 月齡公灘羊采集于寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司。

尿素、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、IPG buffer、甲酸美國GE公司；十二烷基磺酸鈉、三羧基氨基甲烷、三氯乙酸、過硫酸銨、四甲基乙二胺 美國Amresco公司；三乙二胺碳酸鹽、考馬斯亮藍G-250 美國Sigma公司；胰蛋白酶 美國普洛麥格公司；乙腈 美國Thermo公司。

1.2 儀器與設備

便攜式pH計 上海德圖儀器國際貿易有限公司；TG16W型離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DZKW-C型電子恒溫水浴鍋 滄州新三思試驗儀器有限公司；Sciex Triple TOF 5600質譜儀、Eksigent nanoLC-1D plus液相色譜系統（配有納升噴霧III離子源、Analyst TF 1.6數據處理軟件） 美國應用生物系統公司；5910R冷凍離心機 德國艾本德公司；Image Scanner III光密度掃描儀 美國GE Healthcare公司；真空冷凍干燥機 美國賽默飛公司；VCX130超聲波細胞粉碎機 美國Sonics公司；Mini PROTEAN tetra Cell電泳儀 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

選取體質量相近的6 月齡公灘羊，屠宰后用滅菌刀取右側背最長肌，編號后置于聚乙稀薄膜內，于風速3 m/s、相對濕度80%、溫度4 ℃條件下貯存。

取貯藏0、4、8 d的樣品各200 g用于測定pH值、離心損失率及蒸煮損失率；取0、4、8 d的樣品各200 mg迅速置于液氮中放置2 h后轉移至-80 ℃冰箱中保存，用于蛋白質組學分析。

1.3.2 蛋白質組學分析

采用尤麗琴等的方法從灘羊肉中提取總蛋白。iTRAQ-蛋白質組學分析委托上海鹿明生物科技有限公司進行，運用Analyst TS 1.1軟件系統獲得蛋白質組學數據。蛋白質的定性及定量信采用Protein Pilot 5.0軟件獲得。檢索的數據庫為數據庫，數據庫來源為UniProt。數據進行歸一化處理后，以差異倍數（fold change，FC）＞1.5或FC＜1/1.5且＜0.05為標準篩選差異豐度蛋白質。篩選出的差異豐度蛋白質利用OmicsBean軟件進行生物信息學分析，比對后獲得差異基因的基因本體（gene ontology，GO）（包括生物過程、分子功能、細胞組分）功能信息，選擇差異最顯著的前10 個條目作圖。采用京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫對所篩選的差異蛋白質進行通路注釋分析。利用String數據庫（https://www.string-db.org/）和Cytoscape 3.8.0軟件進行PPI分析及核心互作網絡篩選。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 pH值

取4 cm×4 cm×4 cm（60 g左右）灘羊背最長肌，使用便攜式數字pH計測量肌肉pH值，探頭沿肌纖維方向插入肉樣內部，每個樣品至少測定3 個點，結果取均值。測定前剔除樣品可見脂肪與結締組織。

1.3.3.2 蒸煮損失率

蒸煮損失率的測定參考文獻[14]的方法并稍作修改。將樣品切割成6 cm×3 cm×3 cm的肉塊并稱質量（），然后在80 ℃水浴鍋中加熱至樣品中心溫度75 ℃，取出后冷卻至室溫，用濾紙擦干表面水分后稱質量（），按式（1）計算蒸煮損失率。

1.3.3.3 離心損失率

離心損失率的測定參照文獻[15]的方法并稍作修改。將約5 g的樣品準確稱質量（）后放置于10 mL離心管中，4 ℃以8 000 r/min離心10 min。除去離心管中滲出液后以濾紙吸干樣品表面水分后準確稱質量（）。按式（2）計算離心損失率。

1.4 數據處理與分析

所有指標重復測定3 次，結果以平均值±標準差表示。采用Excel軟件統計數據，采用SPSS軟件進行單因素方差分析及Pearson相關性分析，采用Duncan檢驗進行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著，采用Origin軟件作圖。采用微生信在線平臺（http://www.bioinformatics.com.cn）對篩選的差異蛋白質進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 冷藏期間灘羊背最長肌pH值及保水性變化

由表1可知，宰后0～4 d，pH值顯著降低（＜0.05），并于4 d時降至最低（5.58），4 d后略有回升。王薇等發現灘羊肉于0～4 ℃貯藏條件下連續放置7 d后其pH值呈先下降后上升趨勢，本實驗研究結果與其一致。國內外諸多學者研究表明家畜屠宰后初期ATP水解產生導致H含量增加以及能量代謝方式轉變引起的乳酸積累是導致貯藏初期pH值下降的主要原因，而pH值4～8 d升高可能是由于分解代謝消耗肌肉中所積累的酸性物質。宰后貯藏過程中，肌肉pH值下降的速率和程度顯著影響代謝酶的活性，對于肉色、嫩度、保水性和風味前體的形成有重要影響，是宰后初期肌肉最重要的品質指標。貯藏8 d內蒸煮損失率與離心損失率均呈持續升高趨勢，二者均可表示肌肉的保水性，蒸煮損失率與離心損失率持續升高表明灘羊肉的保水性隨時間的延長逐漸變差。這與李升升的研究結果一致。據研究表明，畜禽屠宰后影響肌肉保水性的主要因素有肌肉結構、pH值、糖酵解等。肌肉中有自由水、結合水和不易流動水3 種形式存在，共占肌肉的80%左右。肌肉結構、pH值及糖酵解等變化所引起的水分狀態轉換以及水分儲存空間減少是導致灘羊肉保水性變差的主要原因。

表1 灘羊宰后貯藏過程中肌肉pH值及保水性的變化Table 1 Changes of pH and water holding capacity in Tan sheep meat from different aging stages

2.2 冷藏期間灘羊背最長肌蛋白質組學數據分析結果及差異蛋白篩選

對3 個貯藏時間段樣品的蛋白質組學結果進行主成分分析，如圖1所示，貯藏時間可將樣本很好地區分開，同一貯藏時間樣本之間區分不明顯，不同貯藏時間樣本之間區分明顯，表明本實驗樣品采集合理，蛋白質組學數據可靠，滿足后續分析要求。

圖1 不同貯藏期樣本蛋白質組學數據的主成分分析結果Fig. 1 Principal component analysis plot of proteomic data of samples stored for different periods

2.2.1 差異蛋白質篩選

以FC＞1.5或FC＜1/1.5且＜0.05為標準篩選差異豐度蛋白質，4 d組對比0 d組共鑒定出83 個豐度顯著差異蛋白質，其中，61 個為顯著上調，22 個為顯著下調（圖2A）；8 d組對比4 d組共鑒定出104 個豐度顯著差異蛋白質，其中，14 個為顯著上調，90 個為顯著下調（圖2B）。

圖2 不同貯藏期灘羊肉差異豐度蛋白質的火山圖Fig. 2 Volcano plot of differential abundant proteins in Tan sheep meat during chilled storage

2.2.2 冷藏期間灘羊背最長肌差異蛋白質生物信息學分析結果

2.2.2.1 GO功能注釋富集分析結果

通過GO功能注釋對所篩選的差異豐度蛋白質進行生物信息分析，通過生物過程、細胞組分、分子功能三方面解析其功能，結果表明，4 d對比0 d組顯著富集到441 個生物過程條目、117 個細胞組分條目和110 個分子功能條目；8 d對比4 d組顯著富集到769 個生物過程條目、85 個細胞組分條目和180 個分子功能條目，富集最顯著的前10 個條目如圖3所示。

圖3 不同貯藏期灘羊肉差異豐度蛋白質的GO注釋Fig. 3 Gene ontology annotation of differential abundant proteins in Tan sheep meat during chilled storage

由圖3A可知，宰后貯藏0～4 d，差異蛋白質主要涉及到的生物過程包括肌肉收縮、肌肉系統過程、橫紋肌收縮、ATP代謝過程、骨骼肌收縮等；細胞組分主要包括肌原纖維、收縮纖維、收縮纖維部分、肌節、超分子纖維等；分子功能主要包括肌動蛋白結合、細胞骨架蛋白結合、谷胱甘肽轉移酶活力、氫離子跨膜轉運蛋白活力、電子載流子活度等。以上結果表明，灘羊屠宰后初期構成肌肉結構的肌原纖維、收縮纖維、肌節、超分子纖維等發生變化，這些變化可能引起了肌肉收縮、骨骼肌收縮等，發生變化的蛋白質在細胞質主要負責肌動蛋白結合、細胞骨架蛋白結合、離子轉運等功能。已有諸多研究表明肌肉的收縮狀態會引起肌肉結構的變化，從而引起肉品保水性的變化。

由圖3B可知，宰后貯藏4～8 d，差異蛋白質主要涉及到的生物過程包括肌肉收縮、肌肉系統過程、橫紋肌收縮、嘌呤核糖核苷三磷酸代謝過程、核糖核苷三磷酸代謝過程等；在細胞組分中主要包括細胞外膜結合的細胞器、胞外外泌體、細胞外囊泡、胞外細胞器、肌原纖維等；在分子功能中主要包括細胞骨架蛋白結合、過氧化物酶活力、FATZ綁定、抗氧化活性、肌動蛋白結合等。以上結果表明，灘羊肉貯藏4 d后，除了肌肉收縮等變化，差異豐度蛋白質還涉及了嘌呤核糖核苷三磷酸代謝過程、核糖核苷三磷酸代謝過程等。

2.2.2.2 KEGG通路分析結果

通過KEGG數據庫對所篩選的差異蛋白質進行通路注釋分析，結果表明，4 d對比0 d組顯著富集到23 個KEGG通路，8 d對比4 d組顯著富集到18 個KEGG通路。由圖4A可知，宰后貯藏0～4 d差異蛋白質主要參與的KEGG通路包括代謝途徑、碳代謝、氨基酸的生物合成、2-氧代羰基酸代謝、淀粉和蔗糖代謝等；由圖4B可知，宰后貯藏4～8 d差異蛋白質主要參與的KEGG通路包括碳代謝、氨基酸的生物合成、代謝途徑、2-氧代羰基酸代謝、糖酵解/糖異生等。這些代謝過程可能通過影響結構蛋白質參與的生物學過程間接影響肉品的保水性。

圖4 不同貯藏期灘羊肉差異蛋白質的 KEGG通路注釋Fig. 4 KEGG pathway annotation of differential abundant proteins in Tan sheep muscle during chilled storage

2.2.3 核心網絡的構建

如圖5所示，34 個蛋白質為0～4 d與4～8 d兩個貯藏階段共有的差異豐度蛋白質。利用String數據庫（https://www.string-db.org/）對共有的差異蛋白質進行PPI分析，結果如圖6所示，共有34 個節點，其中24 個差異蛋白質之間具有明顯的互作關系。該網絡中PPI富集的值為1.0×10，聚類系數為0.521。將PPI網絡導入Cytoscape 3.8.0軟件進行核心互作網絡篩選，結果如圖7所示，10 個蛋白質（原肌球蛋白2（tropomyosin 2，TPM2）、肌球蛋白輕鏈1（myosin light chain 1，MYL1）、肌鈣蛋白I2（troponin I2，TNNI2）、肌鈣蛋白C2（troponin C2，TNNC2）、肌鈣蛋白T3（troponin T3，TNNT3）、肌球蛋白輕鏈2（myosin light chain 2，MYL2）、輔肌動蛋白α3（actinin alpha 3，ACTN3）、肌動蛋白（細胞質1）（actin cytoplasmic 1，ACTB）、肌動蛋白α1（actin alpha 1，ACTA1）、輔肌動蛋白α2（actinin alpha 2，ACTN2））處于該核心網絡中，且全部為灘羊肌肉結構蛋白質。

圖5 不同貯藏期灘羊肉差異豐度蛋白質的維恩圖Fig. 5 Venn diagram showing unique and shared differential abundant proteins

圖6 共有差異豐度蛋白質的PPI網絡Fig. 6 Interaction network of shared differential abundance proteins

圖7 PPI核心網絡的構建Fig. 7 Constructed core protein-protein interaction (PPI) network

由表2可知，TPM2、MYL1、TNNI2、TNNC2、TNNT3、MYL2、ACTN3、ACTB、ACTA1、ACTN2均為灘羊肌肉結構蛋白質，且絕大多數蛋白質的表達下調發生在4～8 d，可能是由于這些結構蛋白質于貯藏后期發生了降解，而肌肉中的水分又儲存于肌肉結構中，因此對灘羊肉保水性具有重要影響。TPM2、MYL1和肌鈣蛋白等在0～4 d內上調表達可能是由于應激蛋白的防護作用試圖維持肌肉結構的穩定。這些蛋白質位于肌節、細胞器，與細胞骨架蛋白或離子結合，參與肌肉收縮以及ATP酶活性的調節，富集于心肌收縮和肌動蛋白細胞骨架調節的代謝通路，表明這些蛋白質通過肌肉的收縮及肌肉結構的變化來影響灘羊肉的保水性。

表2 核心網絡中差異豐度蛋白質表達量的變化趨勢Table 2 Changes in expression levels of differential abundance proteins in the core PPI network

2.3 影響灘羊肉保水性的機制

通過Pearson相關性分析確定核心蛋白質表達量與灘羊肉保水性的關系。由表3可知，蒸煮損失率與離心損失率及MYL1表達量呈顯著正相關（＜0.05），與肌肉pH值及ACTA1表達量呈顯著負相關（＜0.05），與ACTN3表達量呈極顯著正相關（＜0.01）；離心損失率與MYL2表達量呈顯著負相關（＜0.05），ACTN）表達量呈極顯著正相關（＜0.01）；pH值與ACTB、ACTA1呈極顯著正相關（＜0.01），與MYL1、TNNC2、TNNT3和ACTN2表達量呈極顯著負相關（＜0.01），與TPM2、TNNI2表達量呈顯著負相關（＜0.05）。相關性分析結果表明，MYL1、ACTN3、ACTA1直接影響灘羊肉蒸煮損失，MYL2和ACTN3直接影響灘羊肉離心損失，其他結構蛋白質可能通過間接方式影響貯藏過程中灘羊肉保水性的變化。

表3 灘羊肉品質指標與核心差異豐度蛋白質的相關性Table 3 Correlations between meat quality traits and core differential abundance proteins

相關性分析表明，結構蛋白質對蒸煮損失、離心損失均有顯著影響，肌肉pH值影響宰后貯藏過程中TNNC2、TNNT3等結構蛋白質的變化，且肌肉pH值與灘羊肉保水性密切相關。諸多研究表明宰后貯藏期間鈣蛋白酶體系和細胞凋亡酶體系等組織蛋白水解酶促使細胞骨架蛋白降解會引起肌肉結構的變化。Koohmaraie等研究表明，鈣蛋白酶系統在宰后肌肉蛋白質水解中起著重要作用。其中-鈣蛋白酶誘導的關鍵肌原纖維蛋白降解是宰后肌肉蛋白水解的原因之一。王琳琳等研究表明，通過控制宰后肌肉細胞凋亡發生進程來調節肌肉內環境變化。肌肉中的水分主要以自由水、結合水和不易流動水3 種形式儲存于肌肉結構中，因此肌肉的收縮及肌肉結構的變化均可引起保水性的變化。郭兆斌等研究表明由于pH值的下降導致肌原纖維網格結構收縮，同時蒸煮條件下肌肉蛋白質的熱變性使得肌原纖維緊縮，儲存水分空間變小，部分不易流動水變為自由水而流失。此外，pH值降低會導致維持細胞骨架的連接蛋白變性，致使離心損失升高，且當pH值接近蛋白質等電點時，蛋白質靜電荷為零，對水的吸引能力減弱，也會造成水分流失。

蒸煮損失及離心損失均可反映灘羊肉保水性的變化情況，本研究中蒸煮損失率與MYL1表達量呈顯著正相關，與肌肉pH值及ACTA1表達量呈顯著負相關，與ACTN3表達量呈極顯著正相關；離心損失率與MYL2表達量呈顯著負相關，與ACTN3表達量呈極顯著正相關。肌動蛋白與肌球蛋白均為骨骼肌中主要的肌原纖維蛋白，其中肌球蛋白占骨骼肌總蛋白的1/3以上，構成肌肉結構中的粗絲，肌動蛋白構成細絲，二者在肌肉收縮中起著關鍵作用，產生收縮力。ACTN3作為骨骼肌Z線的構成部分，負責形成肌動蛋白-肌動蛋白交聯，與快型肌纖維功能有關，而快型肌纖維功能又是引起肌肉劇烈收縮的原因，肌肉收縮會引起細胞間及細胞內儲存水分的空間減小，且會導致不易流動水轉化為自由水，由此引起水分流失的增加。因此，ACTA1、ACTN3、MYL2對灘羊肉的保水性有顯著影響。由于ACTN3與蒸煮損失率、離心損失率均具有很高的相關性，推測其可作為灘羊肉保水性的指示蛋白。左惠心采用蛋白質組學技術研究宰后牦牛肉保水性機制的過程中發現結構蛋白質作為差異蛋白的一類，對牦牛肉保水性有重要影響，本研究結果與其一致。

pH值對ACTB、ACTA1、MYL1、TNNC2、TNNT3、ACTN2、TPM2、TNNI2均有顯著影響，這些蛋白質分別為肌動蛋白（ACTB、ACTA1、ACTN2）、肌球蛋白輕鏈（MYL1）、肌鈣蛋白（TNNC2、TNNT3、TNNI2）、原肌球蛋白（TPM2），是肌肉結構的主要構成蛋白質。其中，原肌球蛋白是一種高度保守的肌動蛋白結合蛋白，對肌動蛋白絲的穩定和許多肌動蛋白功能的協同調節至關重要；肌鈣蛋白復合物由3 種調節蛋白組成，分別是肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T，可調節骨骼肌和心肌的肌肉收縮，TNNT3是一種僅在骨骼肌細胞中表達的快速骨骼肌肌鈣蛋白；ACTB參與了細胞肌動蛋白細胞骨架的形成；ACTA1對交叉連接的肌動蛋白絲起作用，并將其穩定在相鄰細胞之間、細胞與細胞外基質連接等結構上，在胞質分裂、細胞黏附和細胞遷移中發揮重要作用。pH值對這些結構蛋白質有重要影響可能是由于pH值變化直接影響了結構蛋白水解酶的活性。pH值對這些結構蛋白質的重要影響意味著屠宰后pH值變化顯著影響肌肉保水性等品質指標。肖雄等研究表明，在屠宰初期，由于氧氣供應中斷，機體細胞很快處于無氧環境，葡萄糖及糖原的有氧分解變為無氧酵解，產生乳酸，肌肉pH值下降，從而使蛋白質分子的多肽鏈變緊密、分子間距縮小，肌肉中的部分水分子被擠出，因而保水性下降；且當pH值下降至蛋白質的等電點，蛋白質（尤其是肌球蛋白）所攜帶的凈電荷為零，其正負電荷數量基本相等，蛋白質中的陽性和陰性基團互相吸引，對水的吸引能力減弱，導致水分流失。此外，肌球蛋白頭部在低pH值下的部分變性也被認為是肌原纖維晶格間距收縮的主要原因，收縮可能會壓迫肌細胞導致細胞內的水分流出，最終也會影響灘羊肉的保水性。

3 結 論

宰后0～8 d內，隨著貯藏時間延長，灘羊肉pH值先降低后有所回升，蒸煮損失率與離心損失率持續升高。利用iTRAQ蛋白質組學技術分析鑒定發現TPM2、MYL1、TNNI2、TNNC2、TNNT3、MYL2、ACTN3、ACTB、ACTA1、ACTN2共10 個核心差異豐度蛋白質。其中TPM2、MYL1、TNNI2、TNNC2、TNNT3、MYL2、ACTN2在0～4 d表達上調，4～8 d下調；ACTB、ACTA1在0～4 d表達下調，4～8 d 上調；ACTN3 在0～8 d持續上調。這些蛋白質位于肌節、肌纖維、細胞膜，通過與細胞骨架蛋白或離子結合，參與肌肉收縮以及ATP酶活性的調節，引起肌肉收縮及肌肉結構變化，最終影響灘羊肉的保水性。肌肉pH值對肌肉結構的主要構成蛋白質ACTB、ACTA1、MYL1、TNNC2、TNNT3、ACTN2、TPM2、TNNI2有顯著影響，pH值及MYL1、ACTA1、ACTN3對蒸煮損失有重要影響，MYL2與ACTN3對離心損失有重要影響。