中藥飲片金銀花、菊花微生物限度檢查方法研究

尹良軍，楊曉莉，王文娟，王宏杰

1.銅川市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 銅川 727031；2.陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710065；3.國家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測技術(shù)重點實驗室，陜西 西安 710065

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初開的花，藥用歷史悠久，是我國常見的中藥之一［1-2］。金銀花不僅在民間膳食中制作成酒和茶，還可作為藥物、化妝品、觀賞性花木等［3］。菊花是菊科菊屬花卉菊的干燥頭狀花序。具有散風解熱，平肝明目，清熱利濕解毒的功能［4］。兩者均可內(nèi)服，煎湯，泡茶或入丸、散［5］。根據(jù)《中國藥典》2020 年版四部直接口服及泡服飲片要求對金銀花、菊花飲片微生物限度檢查方法進行研究［4-7］。

1 儀器試藥與菌株

1.1 儀器

電子天平（UX620H 型，日本島津公司）；生化培養(yǎng)箱（SPX-150 型，揚州慧科電子）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（WDP-9162 型，安亭科學(xué)儀器）；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（HWS-70D 型，杭州聚同電子）；電熱恒溫水浴鍋（DKZ 型，常州忠旺儀器公司）；調(diào)速多用震蕩器（HY-2 型，常州隆和制造有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（LDZF-75KB-Ⅲ型，上海申安醫(yī)療器械公司）。

1.2 試藥

金銀花（陜西興盛德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號分別為20210108、20210303、20210502，產(chǎn)地均為河南）；菊花（陜西興盛德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號分別為20210101、20210302、20210303，產(chǎn)地均為浙江）。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號：20 200720；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號：20 200807；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號：20 210320；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號：20 200628；腸道菌增菌液體培養(yǎng)基，批號：20 201021；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號：20 210122；麥康凱液體培養(yǎng)基，批號：20 200713；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，批號：20 200616；RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基，批號：20 200613；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基，批號：20 210310；培養(yǎng)基為青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)并進行了適用性檢查；各培養(yǎng)基在使用前按照使用說明滅菌（煮沸）分裝備用。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌（CMCC 26003）、銅綠假單胞菌（CMCC 10104）、枯草芽孢桿菌（CMCC 63501）、白色念珠菌（CMCC 98001）、黑曲霉（CMCC 98003）、大腸埃希菌（CMCC 44102）、沙門菌（CMCC 50094）均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

2 方法和結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

取金銀花10 g 置90 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基振蕩20 min，制成供試品溶液；稱取菊花25 g 置225 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基振蕩20 min，制成供試品溶液。供試品溶液用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基10 倍系列稀釋。

2.2 菌液制備

需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)。按《中國藥典》2020 年版四部方法試驗：接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基33 ℃培養(yǎng)18 h；接種白色念珠菌至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基23 ℃培養(yǎng)72 h；用無菌氯化鈉溶液稀釋成每1 mL 小于104 cfu 的菌液。接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基23 ℃培養(yǎng)72 h，加入濃度為0.05%（mL/mL）聚山梨酯80 的pH7.0 無菌NaCl溶液洗脫孢子，用無菌NaCl 溶液稀釋成每1 mL 小于104cfu 的孢子液。用于活菌計數(shù)，備用。

控制菌：接種大腸埃希菌、沙門菌至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上，33 ℃培養(yǎng)18 h，用無菌氯化鈉溶液稀釋成每1 mL 小于100 cfu 的菌懸液。

2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗

2.3.1 需氧菌總數(shù)試驗組取供試液加入5 個無菌試管中，每管加9.9 mL，再分別加入制備好的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液0.1 mL。取1 mL 加入無菌平板，再加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。供試品對照組：取供試品溶液9.9 mL，加入pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL。取1 mL 加入無菌平板內(nèi)再加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。菌液對照組：取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基分裝于5 個無菌試管中，每管裝量為9.9 mL，同試驗組操作分別加入制備好的試驗菌液0.1 mL。取1 mL加入無菌平板內(nèi)再加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。空白對照組：無菌平板內(nèi)加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。

2.3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)試驗組：取供試液加入2個無菌試管中，每管加9.9 mL，再分別加入制備好的白色念珠菌、黑曲霉試驗菌液0.1 mL。取1 mL加入無菌平板，再加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。供試品對照組：取供試品溶液9.9 mL，加入pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL。取1 mL 加入無菌平板內(nèi)，再加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。菌液對照組：取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基分裝于2 個無菌試管中，每管裝量為9.9 mL，同試驗組操作分別加入制備好的試驗菌液0.1 mL。取1 mL加入無菌平板內(nèi)，再加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。空白對照組：無菌平板內(nèi)加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

試驗菌的回收率=（試驗組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)。試驗結(jié)果見表1，2。

表1 金銀花需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)試驗結(jié)果

表2 菊花需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)試驗結(jié)果

金銀花、菊花樣品采用常規(guī)法，實驗組平均菌落數(shù)減去供試品對照組平均菌落數(shù)的值與菌液組平均菌落數(shù)的比值均在0.5～2.0范圍內(nèi)，實驗結(jié)果表明，常規(guī)法可用于檢查需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)。

2.4 控制菌檢查方法適用性試驗

2.4.1 耐膽鹽革蘭陰性菌取“2.1”項下供試品溶液在23 ℃預(yù)培養(yǎng)2 h。

試驗組：取供試品的培養(yǎng)物十倍系列稀釋，各取1 mL 加入腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)48 h后劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上33℃培養(yǎng)24 h。供試品對照組：取供試品的培養(yǎng)物十倍系列稀釋，各取1 mL 加入腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，同時加入每1 mL 小于100 cfu 的大腸埃希菌試驗菌液，33 ℃培養(yǎng)48 h 后劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上33 ℃培養(yǎng)24 h。菌液對照組：取腸道菌增菌液體培養(yǎng)基，加入每1 mL 小于100 cfu 的大腸埃希菌試驗菌液。33 ℃培養(yǎng)48 h 后劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上33 ℃培養(yǎng)24 h。空白對照組：腸道菌增菌液體培養(yǎng)基33 ℃培養(yǎng)48 h 后劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上33 ℃培養(yǎng)24 h。

2.4.2 大腸埃希菌試驗組：取“2.1”項下供試品溶液10 mL，加入100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)24 h，取1 mL 接種至100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中，43 ℃培養(yǎng)48 h，劃線接種到麥康凱培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)48 h。供試品對照組：取“2.1”項下供試品溶液10 mL，加入100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同時加入每1 mL 小于100 cfu 的大腸埃希菌試驗菌液，33 ℃培養(yǎng)24 h，取1 mL 接種至100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中，43 ℃培養(yǎng)48 h，劃線接種到麥康凱培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)48 h。菌液對照組：取100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，加入每1 mL 小于100 cfu 的大腸埃希菌試驗菌液。33 ℃培養(yǎng)18 h，取1 mL 接種至100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中，43 ℃培養(yǎng)24 h，劃線接種到麥康凱培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)24 h。空白對照組：取100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，33 ℃培養(yǎng)24 h，取1 mL 接種至100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中，43 ℃培養(yǎng)48 h，劃線接種到麥康凱培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)48 h。

2.4.3 沙門菌試驗組取金銀花、菊花各10 g 置90 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻33 ℃培養(yǎng)24 h。取0.1 mL 接種至10 mL RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)24 h，劃線接種到木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)24 h。供試品對照組：精密稱取金銀花、菊花各10 g 置90 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同時加入每1 mL 小于100 cfu 的沙門菌試驗菌液混勻，33 ℃培養(yǎng)24 h。取0.1 mL 接種至10 mL RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)24 h，劃線接種到木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)24 h。挑取疑似菌落用沙門菌生化鑒定條鑒定。菌液對照組：取1 mL 小于100 cfu 的沙門菌試驗菌液加入90 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)24 h。取0.1 mL接種至10 mL RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)24 h，劃線接種到木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)24 h。挑取疑似菌落用沙門菌生化鑒定條鑒定。空白對照組：90 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)24 h。取0.1 mL 接種至10 mL RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)24 h，劃線接種到木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，33 ℃培養(yǎng)24 h。結(jié)果見表3，4。

表3 金銀花控制菌方法試驗結(jié)果

表4 菊花控制菌方法試驗結(jié)果

2.5 供試品微生物限度檢查

取供試品溶液10 mL 置水浴煮沸30 min 后置冷水中迅速冷卻，測定耐熱菌總數(shù)。

供試品微生物限度檢查結(jié)果見表5，6。

表5 金銀花檢驗結(jié)果

表6 菊花檢驗結(jié)果

《中國藥典》2020 年版規(guī)定直接口服及泡服飲片的需氧菌總數(shù)可接受的最大菌數(shù)為105cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)可接受的最大菌數(shù)為103cfu/g，耐膽鹽革蘭陰性菌可接受的最大菌數(shù)應(yīng)小于104cfu/g，不得檢出大腸埃希菌（1 g），不得檢出沙門菌（10 g）。樣品檢驗均符合規(guī)定。

3 討論

微生物限度檢查是藥品安全的重要指標，是客觀衡量藥品質(zhì)量的重要指標［8-9］。《歐洲藥典》《美國藥典》《日本藥局方》均將植物藥或天然藥微生物限度作為安全性控制項目。《中國藥典》2020 年版中藥標準的重點是加強安全性控制，微生物污染物控制對加強中藥安全性有重要意義，規(guī)定中藥飲片微生物限度檢查法，讓中藥飲片的微生物限度檢查有了依據(jù)，為控制中藥飲片微生物污染，加強中藥安全性控制奠定了基礎(chǔ)，為提高中藥飲片質(zhì)量標準和促進中藥國際化提供了更全面的參考。

金銀花含有包括揮發(fā)油類、有機酸類、黃酮類、三萜皂苷類和環(huán)烯醚萜類等成分［10-11］。研究證實其具有多種生物活性，如抗菌、抗炎、解熱、抗病毒等［12］。金銀花常作為清熱解毒的良藥，具有很好的抗炎活性［13-16］。菊花含有黃酮類、多糖類、酚類物質(zhì)［17-20］。研究表明，菊花中含有多種抑菌成分，具有抑菌作用，菊花還有中草藥中“廣譜抗生素”的稱號［21］。實驗表明，20 min 振搖蕩洗金銀花中抑菌成分溶解量達不到抑菌濃度；在控制菌檢查中對陽性菌也未見影響。

4 結(jié)論

中藥飲片金銀花、菊花需氧菌總數(shù)，霉菌和酵母菌總數(shù)，控制菌檢查均可用常規(guī)法進行微生物限度檢查，方法簡便、準確、安全、可靠。